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1 应用配备 Agilent Poroshell 色谱柱的 Agilent 9 Infinity LC 在 内同时测定八种有机紫外线吸收剂 应用报告 消耗品 作者 Siji Joseph Agilent Technologies India Pvt. Ltd. Bangalore, India Michael Woodman Agilent Technologies, Inc. 8 Centerville Road Wilgton DE 988 USA 摘要 FDA 与欧洲药典 (EP) 中都规定了个人护理产品中紫外线吸收剂的含量水平 液相色谱法 (LC) 是用于紫外线吸收剂定性和定量分析的被广泛认可的分析技术 大多数此类分析的传统 LC 方法一次运行需约 - 在此应用报告中, 采用配有 Agilent Poroshell 色谱柱的 Agilent 9 Infinity LC, 开发了一种快速 灵敏 耐用和具有良好分辨率的分析方法, 可在 99 s 内分离 8 种 FDA/EP 收载的紫外线吸收剂成分 重复进样保留时间的标准偏差 (SD) 及相对标准偏差 (RSD) 值证实了 Agilent 9 Infinity 二元泵具有的优良性能 极小的峰面积 RSD 值及有机紫外线吸收剂标准品. ng- ng 载样量的宽线性范围展现了 Agilent 9 Infinity 二极管阵列检测器的卓越性能 此外, 该方法可有效鉴别 种国际个人护理产品中的活性紫外线吸收剂

2 引言 紫外线波长介于 X 射线和可见光之间 (~ - ) 黑色素是可引起皮肤变黑的一种色素, 皮肤产生黑色素是人体天然防御紫外线辐射的措施 黑色素吸收紫外线辐射, 并将其能量转化为无害的热量散失掉, 当然, 肤色及其它遗传因素决定了人体对紫外线辐射的反应及黑色素沉着的程度, 不考虑肤色和皮肤产生黑色素的能力, 与晒伤有关的主要因素是紫外线辐射强度和暴晒时间 紫外光的主要分类见表 保护皮肤免受晒伤的防晒霜中包含以下一个或多个类型的活性成分 : 吸收紫外线的有机化合物 可反射 散射及吸收紫外线的无机微粒 具有上述所有功能的有机微粒有机紫外吸收剂通常是羰基共轭的芳香族化合物 美国 FDA 已批准 种 UV-A 吸收剂化合物和 9 种 UV-B 吸收剂化合物可作为防晒霜的成分, 同时欧州药典委员会已批准了另外的 种紫外线吸收剂可在欧洲国家使用 尽管通过认证的几种紫外线吸收剂已经可在市场上见到, 但是这些紫外线吸收剂的广泛应用也引起一些关注 一些防晒霜成分已证明具有致癌作用 另外, 旧时的和 编号组成波长 () 过度暴晒对皮肤的影响 UV-A I - 可引起晒黑但极少产生红斑 可引起长期损害 深层渗透 通过间接损伤 DNA 导致皮肤癌 UV-A II - 产生轻度红斑 UV-B 9- 引起晒伤, 是导致皮肤癌的主要原因 UV-C -9 很强的辐射 可被臭氧层吸收 可直接损伤 DNA 表 紫外辐射的主要分类 当前广泛应用的防晒化学品不能像黑色素一样有效地消散激发态的能量, 因而防晒成分渗透到皮肤底层可增加自由基和活性氧的数量 因此需要对防晒霜进行广泛测试, 揭示其中成分的作用效果 此应用报告详述了一个快速液相分析方法, 可在 99 s 内分离 8 种当前广泛应用的紫外线吸收剂 在产品开发 法规管理及质量控制中, 化妆品生产商可采用这种方法简化防晒霜原材料以及成品的分析, 从而提高分析效率 实验部分 仪器配置由化学工作站 ( B.. 版 ) 控制的 Agilent 9 Infinity LC 系统, 配备了集成真空脱气机的二元泵 自动进样器 柱温箱及用于采集数据的二极管阵列检测器 进样量 µl, 并用乙腈洗针 s 样品恒温箱设为 C, 而色谱柱设定在 C 下工作 二元泵流速设置为 ml/ 检测器程序设置了 个不同的波长 (88 和 8 ), 样品采集速率为 8 Hz ( 响应时间. 秒,>. ) 采用 Agilent Poroshell EC-C8 色谱柱 ( mm. mm,. µm) 用于色谱分离 化学品和标准品 8 种紫外线吸收剂标准品和已酸 ( 流动相改性剂 ) 均购自 Aldrich 公司 ( 印度 ) 超梯度级乙腈 (ACN) 购自 Lab-Scan 公司 ( 泰国曼谷 ) HPLC 级水为 Milli-Q 超纯水净化系统新鲜制备 个不同的国际品牌防晒霜购自当地 本实验中所用有机紫外线吸收剂标准品详见表

3 化合物 编号 化合物 结构 UV 光谱 CH 名称 氨基苯甲酸 CAS 号 -- 分子式 CHN 分子量. 检测波长 88 名称 二羟苯宗 H 分子量. H HC 检测波长 88 名称 羟苯甲酮 H CAS 号 -- 分子式 CH 分子量 8. 检测波长 名称 阿伏苯宗 CAS 号 -9- 分子式 CH 分子量.9 HC 检测波长 8 HC 分子式 C8H 检测波长 8 名称 氰双苯丙烯酸辛酯 N 分子量.8 检测波长 名称 水杨酸辛酯 分子量. HC CAS 号 8-- 分子式 CH CH CAS 号 9-- 分子式 CHN 8 8 CAS 号 -- CH 名称 对甲氧基肉桂酸辛酯 分子量 名称 -甲基苄基樟脑 分子量. CAS 号 8--9 分子式 C8H 8 检测波长 88 NH CAS 号 -- 分子式 CH 88 H 检测波长 表 本实验中所用的有机紫外线吸收剂标准品详情列表

4 LC 分析参数 预先混合.% 乙酸溶液 / 乙腈比例为 9:(A),:9(B) 的溶液作为流动相 本实验所用梯度程序见表 色谱柱重新平衡的后运行时间设置为 时间 () B (%). 8 表 实验中所用梯度程序 标准品混合 以乙腈与.% 乙酸溶液按比例为 : 的混合液作为稀释剂 分别配制各标准品的母液, 浓度均为 ppm( ng/µl) 混合对氨基苯甲酸 二羟苯宗 羟苯甲酮 - 甲基苄基樟脑 阿伏苯宗 对甲氧基肉桂酸辛酯 氰双苯丙烯酸辛酯以及水杨酸辛酯的各标准母液, 并用稀释剂稀释制成每个化合物浓度均为 ppm(ng/µl) 的标准品混合液 然后采用逐级稀释法稀释较高浓度的标准品混合液, 制成 个分析物浓度分别为. 和. ng/µl 的标准品混合液, 以进行检测器的线性分析 从配方样品中提取紫外线吸收剂 通过一个简单的样品提取步骤, 使用乙腈从 个不同的当地现有国际品牌防晒霜产品中提取紫外线吸收剂 用 ml 乙腈对 mg 样品进行提取, 超声并离心 上清液用. µm 的安捷伦注射式过滤器 ( 部件号 -) 过滤 滤液用稀释剂稀释 倍, 得到提取样品的贮备液 采用等量的稀释剂进一步稀释样品贮备液, 作为进样样品, 进样量为 µl 加标的萃取样品用 ppm 的标准品混合液和提取的样品贮备液等体积混合制备 通过加标样品中组分的保留时间和紫外光谱来鉴定提取样品中的峰 实验步骤 为考察分离中的色谱干扰, 所有实验均进行空白进样分析 同时进样标准品混合液 线性水平测定溶液 稀释的萃取样品溶液以及加标的稀释萃取样品溶液进行分析 并通过单个标准品进样分析来确定每个标准品的保留时间 结果与讨论 标准品混合液的液相色谱图结果表明 8 个防晒霜活性成分可达到良好的基线分离且无色谱空白干扰 标准品混 DAD A, Sig= DAD B, Sig=88 DAD C, Sig=8 合液的最后一个峰 ( 水杨酸辛酯 ) 在. 被洗脱出来 标准品混合液的色谱图如图 所示 大约在. 处检测到一个未知峰, 这是阿伏苯宗标准品中存在的杂质 通过 - 光谱扫描进行峰纯度检测, 结果表明 8 个化合物峰均不包含任何可检测到的杂质共洗脱峰 由于各成分最大吸收值不同因而选定了三个不同的波长进行检测 使用 Agilent Poroshell EC-C8 色谱柱分析, 半峰宽 峰对称性 USP 拖尾因子及分离度数据表明, 所有标准分析物在 99 秒内均达到了基线分离 ( 表 )..... 图 使用配有 Agilent Poroshell EC-C8 色谱柱的 Agilent 9 Infinity LC,8 种有机紫外线吸收剂在 99 秒内的洗脱色谱图 ( 覆盖了 个不同波长 ) 化合物编号 化合物名称半峰宽对称性 USP 拖尾因子 8 分离度 氨基苯甲酸...8 NA 二羟苯宗 羟苯甲酮 甲基苄基樟脑 阿伏苯宗 对甲氧基肉桂酸辛酯 氰双苯丙烯酸辛酯 水杨酸辛酯..9.. 表 波长下, 进样一个标准品混合液 ( ng), 其中 8 种防晒霜成分标准品的半峰宽 峰对称性 USP 拖尾因子及分离度数据 进样量为 µl

5 次重复进样浓度为 ng/µl 样品的色谱叠加图, 表明数据重现性良好 ( 图 ) 尽管化学结构相似, 各成分在 99 秒内仍得到很好分离 在此水平下, 得到的保留时间 (RT) 的标准偏差值 (SD)<., 相对标准偏差 (RSD)<.%, 并且峰面积的 RSD <.% DAD, Sig= 信噪比图 为分析标准品混合液柱内浓度为. ng 时所有分析物的色谱图 以各组分可检测到峰的峰高为信号, 无化合物峰区域基线的绝对噪声作为噪声, 计算各标准品的信噪比值 (S/N) S/N 值 SD 以及 RSD 值列于表 在此浓度下, 前 个化合物的 S/N 值 >, 其中检测到的最小 S/N 值是水杨酸辛酯 ( 化合物 8), S/N 值是 图 ng/µl 浓度水平下标准品混合液 次重复进样的叠加色谱图 DAD A, Sig= DAD B, Sig=88 DAD C, Sig= 图 所有分析物柱内浓度为. ng 时, 标准品混合液的色谱图 ( 覆盖 个不同波长 ) 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 8 进样 平均值 SD RSD (%) 表 柱内浓度为. ng 时, 各标准品的信噪比值

6 线性 在柱内浓度为. ng- ng 的浓度范围进行线性研究 (9 浓度水平, 重复进样 次 ) 浓度水平分别为 ng ng ng ng ng ng ng. ng 和. ng 通过计算各浓度水平 次重复进样峰面积和保留时间的 SD 值和 RSD 值展现其精密度 图 所示为保留时间的 RSD 由图可知 RSD 值在可接受的.% 范围内, 表明保留时间的精密度良好 结果表明除水杨酸辛酯 ( 化合物 8) 外, 其余所有组分在. ng 以上的柱内浓度时, 峰面积重现性良好 对于化合物 8, 在 ng 及以上柱内浓度时, 其峰面积的 RSD 值也在允许的.% 范围以内 与其它标准品相比, 较小的峰面积表明水杨酸辛酯的紫外响应较弱, 这是其 RSD 值较高的原因 所有线性浓度水平的化合物峰面积的 RSD 值列于表 以标称浓度 (. ng. ng ng ng ng ng ng ng ng) 为横坐标, 各标准品峰面积为纵坐标制备校准曲线, 建立峰面积与浓度的线性关系, 相关系数 (R ) >.999 所有标准品的线性曲线叠加图如图 所示 各组分的 R 值列于表 提取样品的分析 创建所有标准品的图谱库用来确认色谱峰成分, 并且提供光谱数据以检测峰纯度或判断是否存在共洗脱峰 对 个不同国际品牌防晒霜中的紫外线吸收剂进行提取和分析 所有样品叠加的洗脱色谱图如图 所示 样品 中可观察到在. 处有一未知峰 结果显示, 在已检测的个人防晒护理产品中, 阿伏苯宗和氰双苯丙烯酸辛酯是使用最广泛的紫外线吸收剂成分 从提取样品的色谱图中可明显看出, 样品 b 和 d 提供了抵御 UVA UVB 和 UVC 射线的广泛保护 RSD (%) 图 保留时间 RSD 值 RT RSD.. ng 峰面积 RSD 值 (%) 8 柱内浓度 (ng) 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 化合物 表 所有化合物在各线性浓度水平下峰面积的 RSD 值 (n=) 其中 >. 的 RSD 值标红 ng 图 所有标准品的线性曲线叠加图 8 化合物名称 R 氨基苯甲酸.9999 二羟苯宗. 羟苯甲酮 甲基苄基樟脑.9999 阿伏苯宗.999 对甲氧基肉桂酸辛酯.9998 氰双苯丙烯酸辛酯 水杨酸辛酯.9998 表 各组分的 R 值

7 具有较高 SPF 值的防晒产品一般含有较大量的防晒成分, 因此这些产品中包含相当数量杂质的几率也很大 Agilent 9 Infinity LC 可在最短的时间内提供个人护理产品中杂质分布的整体概貌, 如图 所示为样品 e 的色谱图 结论 本应用报告介绍了使用配有 Agilent Poroshell EC- C8 色谱柱的 Agilent 9 Infinity LC, 在 99 s 内实现了 8 种 FDA/EP 收载的防晒化合物的基线分离 标准品混合溶液色谱图中各组分间最小的分离度 >.8 并且在. ng 水平 ( 柱内浓度 ) 下对各组分的信噪比值进行了考察 所有化合物的线性在柱内浓度. ng- ng 的范围内得到了验证 校准曲线中最差的 R 为.999(9 浓度水平, 次重复进样 ) 在各线性浓度水平上, 得到其保留时间最大的标准偏差值是.8, 最大的 RSD 值是.%(n=) 本法可有效地用于防晒霜和个人护理化妆产品中紫外线吸收剂及其杂质的色谱分析 DAD, Sig= 8.. 图 个提取样品的叠加色谱图 8 8 b... a c d e f DAD, Sig= 8.. 图 样品 e 的满刻度放大色谱图, 表明杂质峰分离度良好 这些较小的未经确认的峰可能是对羟基苯甲酸酯类或配方中其它相关成分的杂质

8 参考文献. Dr. James H. Gibson, Senior Research Scientist Director, USDA UVB Monitoring Program Natural Resource Ecology Laboratory Colorado State University.. Jesus Mercado-Blanco, Fernando Garcia, Manuel Fernandez-Lopez and Jose livares, Melanin Production by Rhizobium meliloti GR Is Linked to Nonsymbiotic Plasmid prmegrb: Cloning, Sequencing and Expression of the Tyrosinase Gene mepa, Journal of Bacteriology, Sept. 99, p. -.. David A. Katz, Sunscreens: Preparation and evaluation.. Ken Klein, Cosmetech Laboratories Inc: Emulsion and sunscreen, (pub date: ).. Marc.S.Reisch C&EN northeast news bureau, Chemical and Engineering news, April, Volume 8 Number, pp 8-.. Hanson Kerry M.; Gratton Enrico; Bardeen Christopher J. (). "Sunscreen enhancement of UVinduced reactive oxygen species in the skin," Free Radical Biology and Medicine (8):. 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 年 月 日, 中国印刷出版号 99-8CHCN

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