前言材料与方法软件新型胰岛素类似物是人胰岛素产品的一种替代物临床试验已经证明, 与人胰岛素相比, 这些类似物具有相同或更好的疗效胰岛素类似物目前是市面上的长效型人胰岛素美国食品药品监督管理局 (USFDA) 在 2 年 4 月批准了胰岛素类似物的使用与小分子不同, 生物治疗药物来自于生

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卞路
5 years ago
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1 胰岛素生物仿制药与创新药物的体积排阻色谱分析使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱应用简报生物制药作者 M. Sundaram Palaniswamy 与 Andrew Coffey 安捷伦科技有限公司摘要胰岛素是一种用于控制血糖稳态的小分子多肽激素基因工程技术使生物制药公司开发出了各种长效胰岛素类似物目前仍未出现用于胰岛素类似物分析的药典方法本文根据 EP 方法草案, 采用 Agilent AdvanceBio SEC 13Å, mm, 2.7 µm 色谱柱开发出了一种用于鉴定胰岛素类似物创新药物和生物仿制药的 SEC 方法采用系统适用性测试以及由胰岛素创新药物作为标准物质的保留时间 (RT) 和峰面积精度研究证实了该方法在常规分析中的有效性本应用简报还介绍了这款色谱柱在定量研究中检测分子量大于胰岛素的杂质方面的应用 -

2 前言材料与方法软件新型胰岛素类似物是人胰岛素产品的一种替代物临床试验已经证明, 与人胰岛素相比, 这些类似物具有相同或更好的疗效胰岛素类似物目前是市面上的长效型人胰岛素美国食品药品监督管理局 (USFDA) 在 2 年 4 月批准了胰岛素类似物的使用与小分子不同, 生物治疗药物来自于生物过程每个制造商各自都有一套用于生产原料药和药品的内部开发过程这些生产方法会使原料药中产生聚集体和降解产物等杂质由于对降糖药需求的不断增加, 因此生产不含杂质的药物以及提供无副作用的安全药物是一项十分重要却充满挑战的任务在生物制药行业中, 配备紫外检测器的液相色谱仪是批签发和表征研究的一种通用工具 1 体积排阻色谱 (SEC) 则是纯度分析的首选方法, 可用于检测药品中的聚集体本应用简报描述了一种用于测定胰岛素生物仿制药及其创新药物参比之间的分子相似性, 并进行了系统适用性与方法精密度分析的 SEC-UV 方法 2 这些测试可确保方法所得到的结果具有合格的准确度和精密度所选标准基于关键色谱参数及其在可接受限值内的变化, 方法评价实验中对该限值进行了定义胰岛素的线性曲线在 µg/ml 的范围内具有出色的相关系数, 表明此方法适用于定量分析文中还描述了采用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱监测并分离强制应激研究中测得的分子量大于药品的杂质 Agilent ChemStation B.4.3( 或更高仪器版本 ) 采用完全生物兼容最高耐压达 6 bar 的 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱体积排阻色谱参数系统, 由以下模块组成 : 表 1 展示了使用 Agilent 126 Infinity 生物 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相惰性液相系统进行体积排阻分析时的色谱色谱泵 (G5611A) 参数 Agilent 126 Infinity 生物惰性高性能自试剂样品与材料动进样器 (G5667A) 商品化胰岛素创新药物与生物仿制药购自当地药店并根据制造商的使用说明进行储存 Agilent 12 Infinity 系列柱温箱乙酸和氨水购自 Sigma-Aldrich 所有化学 (G133B) 品和溶剂均为 HPLC 级, 高纯水采用 Milli Q 包含生物惰性溶剂加热元件的 Agilent 水纯化系统 (Millipore Elix 1 型, 美国 ) 126 Infinity 柱温箱 (G1316C, 进行处理选项 19) 步骤 Agilent 126 Infinity DAD VL 进样 1 µl 流动相 A 作为空白, 随后对各线 (G1315D, 配备生物惰性标准 1 mm 性浓度分别重复进样三次用每个浓度的峰流通池 ) 面积和保留时间 (RT) 计算标准偏差 (SD) 和相对标准偏差 (RSD%) 值以较低线性浓度 Agilent AdvanceBio SEC, 13Å, 7.8 样品的进样分析确定检测限 (LOD) 和定量限 3 mm, 2.7 µm( 部件号 PL ) (LOQ) 将各线性浓度下的平均峰面积对胰岛素浓度作图, 得出单体校准曲线表 1. SEC HPLC 的色谱参数参数条件流动相 2 ml 无水乙酸 3 ml 乙腈和 4 ml 水, 用浓氨水将 ph 调节至 3., 并用水稀释至 1. ml TCC 温度室温等度运行流动相 A 进样量 1 µl 流速紫外检测.5 ml/ 276 nm 2

3 线性和范围校准曲线由浓度范围为 µg/ml 的 9 个胰岛素创新药物的标准浓度点构建 LOQ 和 LOD 将信噪比 (S/N) > 3 时的最低胰岛素浓度定义为 LOD, 而将 S/N > 1 时的浓度定义为 LOQ 胰岛素聚集体制备通过温度处理制备胰岛素聚集体简言之, 将约 3.4 mg/ml 的药品置于聚丙烯管中并在 6 C 下温育 6 小时将样品冷却至室温并立即进行分析系统适用性结果与讨论分离和检测采用胰岛素创新药物为参比标样, 与胰岛素生物仿制药进行对比通过优化 SEC HPLC 分离条件, 完整胰岛素生物仿制药与创新药 A 物 AdvanceBio SEC 13 Å, mm, 2.7 µm 色谱柱上实现了出色分离 55 分钟的总分析时间表明样品十分均匀, 并未发生聚集色谱柱中还可观察到防腐剂间 - 甲酚的峰, 洗脱时间约为 49 分钟 ( 图 1) 根据各论草案得出以下系统适用性要求 : 对称因子 : 胰岛素类似物色谱峰的最大值为 2. 峰谷比 : 最小值为 2 保留时间小于胰岛素类似物保留时间的所有杂质总和 : 不高于色谱峰总面积的.3%, 不考虑 RT 大于胰岛素峰的所有峰 B 图 1. 胰岛素创新药物和生物仿制药在 Agilent AdvanceBio SEC, 13Å, mm, 2.7 µm 色谱柱上得到的 SEC HPLC 色谱图 3

4 保留时间和峰面积的精密度图 2 展示了胰岛素创新药物与生物仿制药六次重复进样的叠加色谱图, 表明结果具有绝佳的分离重现性表 2 列出了六次重复进样中胰岛素单体的平均 RT 与峰面积 RSD 胰岛素单体的 RT 和峰面积 RSD 分别为可接受限值的 ±3% 和 ±5%, 表明该方法具有优异的重现性和精密度系统适用性表 3 列出了胰岛素类似物此次系统适用性研究的可接受标准, 表 4 则展示了系统适用性的汇总结果胰岛素创新药物与生物仿制药的系统适用性测试结果表明, 使用安捷伦生物惰性液相色谱仪以及 AdvanceBio SEC 色谱柱的方法符合胰岛素 QA/QC 分析的严格性能要求 LOD 和 LOQ 胰岛素创新药物的 LOD 和 LOQ 分别为 11.3 µg/ml 和 28 µg/ml, 表明该方法的灵敏度极高表 5 展示了胰岛素创新药物的 LOD 和 LOQ 测定值 A B 图 2. 在 Agilent AdvanceBio SEC, 13Å, mm, 2.7 µm 色谱柱上分离得到的胰岛素创新药物和生物仿制药的 6 次重复叠加色谱图表 2. RT 和峰面积精确度 (n = 6) RT 峰面积样品平均值 () RSD 平均值 (/) RSD 胰岛素创新药物胰岛素生物仿制药表 3. 可接受标准参数限值对称因子胰岛素类似物色谱峰的最大值为 2. 峰谷比最小值为 2 保留时间小于胰岛素类似物保留时间的所有杂质总和不高于色谱峰总面积的.3% 表 4. 系统适用性测试结果汇总 Agilent AdvanceBio SEC, 13Å, mm, 2.7 µm 色谱柱分析结果样品对称因子峰谷比保留时间小于胰岛素类似物保留时间的所有杂质总和通过 ( 是 / 否 ) 胰岛素创新药物是胰岛素生物仿制药 1.72 是表 5. 胰岛素创新药物的 LOD LOQ 和 S/N 结果 (n = 3) 浓度 (µg/ml) S/N 平均峰面积 1.6 (LOD) (LOQ)

5 线性使用面积响应与胰岛素浓度从 LOD 到本研究声明的最高浓度水平 (3.4 mg/ml) 构建了胰岛素创新药物的线性曲线图 3 显示了浓度范围为 µg 的胰岛素线性曲线 R 2 测定值大于.99, 表明峰面积与胰岛素浓度之间存在良好的剂量依赖相关性聚集 / 降解分析与定量生物治疗药物中的杂质分布对药品安全的重要性日益凸显尽管聚集体浓度极低, 但仍会对产品质量产生极大影响 AdvanceBio SEC 色谱柱设计用于最大限度减少与生物分子的相互作用, 从而实现胰岛素聚集体的完全基线分离这些胰岛素聚集体在 AdvanceBio SEC 色谱柱上的洗脱时间分别为和分钟, 如图 4 所示 (n = 3) y = x R² = DP (µg/ml) 图 µg/ml 胰岛素标准浓度的线性曲线, 显示出极佳的线性相关系数值图 4. 经加热处理胰岛素的 Agilent AdvanceBio SEC 色谱图表明胰岛素聚集体实现了基线分离 5

6 经济价值和使用寿命研究特别在对比 AdvanceBio SEC 色谱柱与其他色谱柱类型的成本时, 成本是实验室主管或团队负责人可能会重点关注的一个方面在 SEC 分离中, 除操作人员和仪器成本外, 最昂贵的开销就是色谱柱本身的成本如果色谱柱寿命不够长或柱间重现性出现问题, 那么就可能需要筛选多个色谱柱通过控制整个生产过程来确保批间重现性是必不可少的图 5 展示了 AdvanceBio 13Å 蛋白质标准品在 4 个不同批次 AdvanceBio SEC 13Å 介质中的分离, 确保对整个生产过程实现了完全控制我们的一个目标是确保色谱柱在整个用户开发过程中具有更长的使用寿命延长色谱柱使用寿命具有额外优势, 例如可大大缩短停机时间图 6 显示 3 mg/ml 胰岛素原料药共进样 25 次, 每隔 5 次选择一张色谱柱得到的 6 张叠加色谱图表 6 列出了所选进样的 RT 峰面积拖尾因子与理论塔板数结果清晰表明,RT 峰面积和拖尾因子在 25 进样中几乎未发生改变理论塔板数和柱效指标也未产生明显差异 II 图 5. AdvanceBio 13Å 蛋白质标准品在 4 个不同批次 AdvanceBio SEC 13Å, mm, 2.7 µm 介质中的分离图次进样中每隔 5 次选择一张色谱图得到的 6 次重复进样叠加色谱图 6

7 结论体积排阻色谱法是检测与监控生物药物聚集体和单体的常用方法本应用简报证明了 Agilent AdvanceBio SEC 13Å 色谱柱是进行胰岛素类似物研究的最佳选择我们采用药典方法草案开发了一个用于定义胰岛素生物仿制药品和创新药品之间生物相似性的紫外型简单方法, 方法采用了 AdvanceBio SEC 13Å, mm, 2.7 µm 色谱柱该方法具有优异的 RT 和峰面积精度, 并能满足系统适用性要求峰面积与胰岛素药品的 8 个标准浓度之间呈线性关系, 并具有出色的线性相关系数 LOD 和 LOQ 测定值分别为 1.6 µg/ml 和 31.8 µg/ml, 表明方法的灵敏度极高 AdvanceBio SEC 色谱柱可用于分离和监测强制应激研究中分析的聚集体我们还展示了使用 AdvanceBio SEC 色谱柱所具备的更大经济效益, 其中包括减少批间生产差异, 以及利用重现而稳定的结果延长色谱柱使用寿命将这一简单的重现方法与生物惰性和耐腐蚀仪器相结合, 可作为整个开发过程中胰岛素常规质量检查的可靠适用方法表 6. 胰岛素原料药 25 进样的 RT 峰面积拖尾因子和理论塔板数进样次数 RT () 峰面积拖尾因子理论塔板数

8 参考文献 1. Kannan V; Narayanaswamy P; Gadamsetty D; Hazra P; Khedkar A; Iyer, H. A tandem mass spectrometric approach to the identification of O-glycosylated glargine glycoforms in active pharmaceutical ingredient expressed in Pichia pastoris. Rapid Communications in Mass Spectrometry 29, 23(7), Pharmeuropa, Vol. 23, No. 2, April 211 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用不可用于诊断目的本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 5 月 1 日, 中国出版 CHCN

前言体积排阻色谱 (SEC) 是分离治疗性 mab 中单体低分子量 (LMW) 和高分子量 (HMW) 异构体的一种常用方法原始条件下的 SEC 根据不同分子大小在填料孔隙中的差异化扩散来实现单体及其异构体的分离 mab 型药物的成功开发还需要评估强制降解研究中产生的聚集体和片段, 这类研究中

前言体积排阻色谱 (SEC) 是分离治疗性 mab 中单体低分子量 (LMW) 和高分子量 (HMW) 异构体的一种常用方法原始条件下的 SEC 根据不同分子大小在填料孔隙中的差异化扩散来实现单体及其异构体的分离 mab 型药物的成功开发还需要评估强制降解研究中产生的聚集体和片段, 这类研究中利妥昔单抗聚集体和片段的高分离度 SEC 分离与定量分析 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统和 AdvanceBio SEC 3Å, 2.7 µm 色谱柱应用简报生物制剂与生物仿制药作者 M.Sundaram Palaniswamy 安捷伦科技公司 Bangalore, India 摘要单克隆抗体聚集可通过产品和环境因素等多种机制产生体积排阻色谱 (SEC)