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1 在 Agilent HC(2)/TC(2) 反相柱上分离合成 / 人造的食用色素应用报告食物和调味品作者傅荣杰安捷伦科技有限公司上海英伦路 2 号浦东, 上海市 2 中国摘要为了改善食品和饮料的外观, 要使用许多合成或人造色素 ( 号红, 日落黄, 等 ), 这些化合物很容易用反相液相色谱进行分离 [], 使用一种新的 C8 反相柱和磷酸盐缓冲液 - 甲醇流动相, 进行梯度洗脱可以分离 7 种食用色素这一方法适合于许多样品, 这里是把它用于饮料中这类色素的分析素在某些国家受到限制, 要保证符合国际食品质量控制标准在食品的质量控制中检测这些化合物的量也因此变得十分重要这 7 种色素的化学结构见图, 多为偶氮染料这些化合物用于饮料使其色泽鲜艳诱人在这一应用报告中, 着重于开发一个使用 Agilent TC-C8(2) 色谱柱分离七种食用色素的方法, 然后使用这一方法分析饮料样品中的这些色素新的色谱柱中装填 5µm 表面键合 C8 的高纯硅胶 (B 型 ), 硅胶比表面为 29 m 2 /g, 碳载量为 2%, 它是在这种比表面硅胶上键合中等碳载量的色谱柱, 因此它比高碳载量色谱柱有更强的亲水性对硅胶表面进行特殊处理并改进了封端方法, 使色谱柱具有优良的性能, 特别有利于极性和碱性化合物的分离前言合成和人造食用色素几乎都是水溶性的, 用 HPLC 反相柱分析它们是理想的方法, 这些化合物一般来讲是安全的, 但是一些化合物会有有害作用, 包括使儿童有过敏和多动的反应由于有这些反应, 人造食用色

2 a H a a H a a. 酒石黄 Tartrazine 2. 苋菜红 Amaranth a H a H a a a. 藓红 Ponceau R R. 日落黄 unset yellow a a CH H H H 2 a a I I a H C a I I 号红 Red Allura Allura 红 red 7. a 7. 赤藓红 Erythrosine 图. 色素的结构式 HPLC 的条件仪器 Agilent 2 L 配有二极管阵列检测器色谱柱 Agilent TC-C8(2),.6 mm x 5 mm, 5 µm 流动相 A: 2 mm 磷酸缓冲溶液,pH 7. B: 甲醇梯度 5, % B 9% B 流速 ml/ 检测波长 25 nm 温度 C 进样量 5 µl 在 Agilent TC-C8(2) 柱上 7 种极性水溶性食用色素标准的分离图中所示的色素是极性水溶性的化合物, 在分子上有磺酸基可增加它们的水溶性, 实际上在食品中是使用它们的盐类化合物, 选择 C8 色谱柱分离这些化合物, 使用安捷伦公司的两种新的常规或用于 QC/QA 的色谱柱, 它们是 Agilent HC-C8(2) 柱, 碳载量 7%, 和 TC-C8(2) 柱, 碳载量 2% 碳含量的不同设计是为了优化非极性很强和极性很强化合物的分离分析极性化合物, 通常需要高含水量的流动相, 使其有适当的保留性能, 针对人造食用色素要使用梯度洗脱, 从低有机组分的流动相开始开发这一方法较好的选择是使用碳载量为 2% 的 TC-C8(2) 柱, 流动相要从高水组分含量开始, 可用于极性和非极性混合物样品的分离 2

3 图 2 显示 7 种色素在.6 mm x 5 mm,5 µm Agilent TC-C8(2) 柱上的分离, 用 ph 7. 磷酸盐缓冲液 - 甲醇做流动相, 所有化合物都呈现对称峰, 以美国药典 (UP) 衡量拖尾因子接近, 而且得到基线分离, 具有很好的重现性由于它们的酸性很强, 化合物的峰形和分离度强烈地受所选择流动相 ph 值的影响, 使用三种 ph 值的流动相进行重复分离, 所得色谱见图色谱图明显显示峰形和分离度受到 ph 值的影响, 特别是前面三个酸性和极性最强的化合物尤为突出可以看出在低 ph 值 ph 2.2 情况下, 和 2 号峰和 5 号峰的峰形很差, 但是对后面流出的色谱峰的分离度受 ph 值的影响就不大了, 如第 7 号峰赤藓红在这些化合物中赤藓红的疏水性最强这些化合物的总流出次序受到化合物疏水性的影响, 这和反相 LC 预期的特性一样 orm 酒石黄 Tartrazine 2 苋菜红 Amaranth 藓红 Ponceau R R 日落黄 unset yellow 5 Red 号红 6 Allura Allura 红 red Erythrosine 7 赤藓红图 2. 在 Agilent TC-C8(2) 柱上色素标样的分离 Rs,5=. Tf=.2 Tf=.2 Tf=.98 Rs,5=.7 ph 图 Tf=. Tf=. Rs,5=.7 Tf=. ph Tf=. Tf=.5 Rs,5=2. Tf= 色素标样在不同 ph 流动相情况下在 Agilent TC-C8(2) 柱上的色谱图 ph7.

4 批与批之间的重复性在稳定的 HPLC 方法和常规检测中色谱柱批与批之间的重复性十分重要, 图是用于评估 TC-C8(2) 柱, 用这一方法检测其重复性在相同的色谱条件下, 用三个不同批次的色谱柱进行检测, 色谱图显示不同批次的色谱柱几乎没有保留时间的漂移和峰形的差异, 这证明所用色谱柱具有良好的的制作工艺和装填技术在饮料中人造食用色素的分析合成和人造食用色素存在于许多常见饮料和食品中, 如有水果味道的饮料和苏打水, 饼干和糖果, 在这一应用报告中有两种不同饮料里的一些色素进行分离, 选择了两种常见的饮料一种是橙味苏打水和饮料粉, 为了进行样品制备, 对橙味苏打水要进行脱气, 通过.5 µm 的滤膜进行过滤, 然后进行分析饮料粉要溶于水, 通过.5 µm 的滤膜进行过滤, 进样分析图 5 是分析这些样品的色谱图批次 Lot 批次 Lot 2 5 批次 Lot 图. TC-C8(2) 柱 (.6 mm x 5 mm, 5 µm) 批与批之间的重复性

5 标准样品 tandards 5 橙味苏打水 range flavored soda 橙味饮料粉 range beverage powder 图 5. 两个样品的色谱图在橙味苏打水样品中发现三种色素并得到完全的分离, 基于标样得知第一个已知峰可以和位于它前面的未知峰得到分离在饮料粉中样品中找到两个目标色素, 得到足够的分离, 可以进行有效的定量分析在饮料粉样品中加入的食用色素比较少, 对这种低浓度样品的分析, 需要注射大体积的样品, 以适应定性和定量分析的需要图 6 是两张大体积进样的色谱分离情况仍然很好, 峰形对称, 有少许谱带加宽对橙味苏打水样品, 第一个峰可以和未知峰得到完全分离所有这些情况证明 TC-C8(2) 柱具有高比表面带来的高容量 eparated with 5 unknown 与未知物分离 compound 进样 range 5 µlflavored soda 橙味苏打水 5-µL injection 进样 range 5 µlbeverage powder 橙味饮料粉 5-µL injection 图 6. 5-µL 大体积进样的色谱图 5

6 与 HC-C8(2) 色谱柱的比较如前所述,HC-C8(2) 柱的碳载量高于 TC-C8(2) 柱, 因此它对非极性化合物有很强的保留作用, 但是对极性化合物的保留作用较弱图 7 表明 HC-C8(2) 色谱柱保留极性较强食用色素的能力略低于 TC-C8(2) 柱碳载量的变化也影响两支色谱柱对号和 5 号峰分离的不同, 在图中有显示图 8 表明橙味苏打水样品在 HC-C8(2) 柱和 TC-C8(2) 柱上分离的色谱在 TC-C8(2) 柱上, 号峰和主要干扰化合物的分离次序与 HC-C8(2) 柱的次序相反使用 HC-C8(2) 柱, 可使干扰目标化合物分离的组分先于目标化合物出峰, 并得到很好的分离在使用大体积进样时仍然可以得到基线分离当两个峰颠倒时即使改变流动相组成, 也不能使二者得到基线分离因为这一方法的梯度是从低有机成分 ( 只有 %) 含量开始的, 因此我们选择低碳载量的 TC-C8(2) 柱用于分析值得注意的是, 有这两种色谱柱可供选择, 为方法开发提供了更多色谱柱可供选择 orm TC-C8(2) orm HC-C8(2) 图 7. 色素标样在 TC-C8(2) 和 HC-C8(2) 柱上的色谱 6

7 8 Interferential compound 内标物 6 HC-C8(2) 2 TC-C8(2) 图 8. TC-C8(2) 和 HC-C8(2) 柱不同的选择性结论使用简单的梯度洗脱方法, 许多合成食用色素可以在 TC-C8(2) 柱上得到分离, 这一方法可以使许多合成食用色素达到基线分离, 色谱峰对称并具有很好的重复性 Agilent TC-C8(2) 色谱柱可以用于食品和饮料中合成色素的日常 QC 分析参考文献. Fang Yanyan, Agilent Technologies, publication CHC. 要获得更多的信息要获得我们产品和服务的更多的信息, 请访问我们的网站 7

8 安捷伦公司不对本手册中可能有的错误或与装置性能及材料使用有关内容而带来的意外伤害和问题负任何责任本手册所提及的信息说明和技术规格如有变动, 恕不另行通知安捷伦科技公司, 28 中国印刷 28 年月 27 日 CHC

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5990-9029CHCN_5989_5672.qxd 将中国药典测定胰岛素的方法转换为使用 Agilent Poroshell 色谱柱的方法应用报告生物制药作者 Rongjie Fu 安捷伦科技有限公司 ( 上海 ) 英伦路 4 号上海 3 中国摘要中国药典 (Ch. P) 规定的检验胰岛素的方法需使用传统的 4.6