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1 0 年月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI:0.374/SP.J 伏马菌素 B 单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立 许杨 邹龙 刘师文 刘京 陈波 ( 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室, 中德联合研究院, 南昌 ) ( 江西省疾病预防控制中心, 南昌 33009) 摘要制备了高亲和力的伏马菌素 B (FB ) 单克隆抗体, 进而建立了谷物中 FB 的直接竞争化学发光酶联免疫检测方法 () 采用碳化二亚胺法成功合成了 FB 人工抗原, 经杂交瘤技术获得分泌 FB 特异性抗体的细胞株, 高碘酸钠法酶标单克隆抗体后, 建立了 FB 的, 本方法的 IC 50 值为.43 mg/l, 线性范围为 0.3~8.40 mg/l, 检出限为 0.3 mg/l, 竞争反应时间仅需 0 min 玉米样品加标回收率为 00.% ~ 5.4%, 相对标准偏差小于 8.7%, 谷物样品的检测结果与高效液相色谱法及商业化 ELISA 试剂盒检测结果相符 关键词 伏马菌素 B ; 单克隆抗体 ; 化学发光酶联免疫分析 ; 谷物 引言 伏马菌素主要是由镰刀菌属产生的一类结构类似的真菌毒素, 常污染玉米等谷物, 其中伏马菌素 B (Fumonisin B, FB ) 是主要组成成分, 也是毒性最强的成分 [] 伏马菌素不仅能引起马脑白质软化 症 猪肺水肿综合症和大鼠肝癌, 而且与人类食管癌和肝癌的发生有关, 国际癌症研究中心已将伏马菌 素列为 B 类致癌物质 [~ 4] 欧盟规定人食用玉米中伏马菌素的限量为 mg/kg [5] 目前, 用于谷物及其制品中伏马菌素的检测方法主要有仪器分析 ( 高效液相色谱 质谱分析等 ) [6,7] 和免疫学检测法 [8,9] 基于抗原抗体反应建立的免疫学检测法具有样品处理简单 灵敏度高 特异性强 等优点, 能实现高通量样品的同时快速检测 免疫学检测法的灵敏度在很大程度上取决于特异性抗体 的亲和力和检测信号的放大倍数, 而对于真菌毒素等半抗原, 获得高亲和力抗体的关键取决于合成的全 抗原的质量 化学发光反应信号放大可以提高免疫分析法灵敏度, 化学发光免疫分析技术已广泛用于 生物化学分析 临床诊断和环境监测 [0~ ] 本实验采用简便的碳化二亚胺法成功合成了 FB 人工抗原, 并制备了高亲和力和特异性的 FB 单 克隆抗体, 进而建立了谷物中 FB 的直接竞争化学发光酶联免疫检测法 (Direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay, ) 本方法灵敏度高, 检测时间短, 有望用于开发适用于谷物中 FB 常规检测的商业化试剂盒 实验部分. 仪器和试剂 伏马菌素 B 酶联免疫测定试剂盒 ( 天津生物芯片技术有限责任公司 );96 孔可拆化学发光板 / 酶标 板 ( 深圳金灿华实业有限公司 ); 小鼠抗体分型试剂盒 (Hycult biotechnology;waters 公司 );Thermo MK3 酶 标仪 化学发光仪 (Thermo 公司 ) 伏马菌素 B 伏马菌素 B 黄曲霉毒素 B (AFB ) 玉米赤霉烯酮 (ZEN) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 赭曲霉毒素 A(OTA) 辣根过氧化物酶 (HRP) 鲁米诺 对碘苯酚 过氧化脲 匙孔血蓝蛋白 (KLH) 弗氏完全佐剂和不完全佐剂, 均购自 Sigma 公司 ; 卵清白蛋白 (OVA) 碳化亚二胺盐酸盐 (EDC HCl), 均购自上海生工生物工程公司 ; 其它试剂纯度均为国产分析纯 收稿 ; 接受本文系国家 863 计划资助项目 (No. 007AA0Z47) * xuyang95@ 63.com

2 分析化学 BALB/c 小鼠 ( 雌性,4~6 周龄 ) 购自南昌大学医学院实验动物科学部. 人工抗原的合成采用碳化二亚胺法合成人工抗原, 参考文献 [9] 并做适当修改, 具体如下 : mg FB 溶解于 ml PBS (0.0 mol/l, ph 7.4) 中,5 mg 血蓝蛋白 (KLH) 溶解于 ml PBS 中, 两者混匀后加入 0. ml 0 g/l 新鲜配制的 EDC 溶液 ; 在室温下缓慢搅拌反应 h, 静置 30 min; 在 4 于 PBS 中透析后,-0 冻存备用, 即为免疫抗原 (FB -KLH) 检测抗原 (FB -OVA) 合成方法同上, 以 OVA 替换 KLH.3 单克隆抗体的制备将免疫抗原按 50 mg/ 只的剂量与等体积弗氏佐剂充分乳化后腹部皮下多点注射免疫 4 只 6~8 周龄雌性 BALB/c 小鼠, 免疫后第 7~0 d, 尾静脉采血, 间接 ELISA 检测血清效价 杂交瘤技术和腹水制备参考文献 [4], 将免疫效果较好的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞 SP/0 通过 PEG 介导融合, 间接 ELISA 筛选阳性克隆 ; 阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株, 细胞株扩大培养后, 接种经降植烷致敏的 BALB/c 小鼠腹腔内诱导生产单克隆抗体 Hycult biotechnology 小鼠抗体分型试剂盒测试细胞株培养液, 鉴定单克隆抗体的类别和亚型.4 酶标抗体的制备 [3,4] 采用改良的过碘酸钠法, 将辣根过氧化物酶与 Protein G 琼脂糖凝胶纯化的单克隆抗体偶联, 制备酶标抗体 IgG-HRP 复合物.5 化学发光底物液的制备以 HRP- 羊抗鼠抗体 ( 000 倍稀释度,00 ml/ 孔 ) 包被的化学发光板为基质, 单因素实验分别考察鲁米诺 增强剂和过氧化物 3 种组分浓度对底物液发光强度和稳定性的影响 采用 BOX-Behnken 响应面法设计, 分析上述 3 种组分 ( 因素 ) 的作用及其交互作用, 选择合理的模型模拟最佳的底物配方, 具体方法及数据分析参考文献 [5].6 直接竞争化学发光酶联免疫检测方法 () 的建立.6. 步骤用 PBS 稀释检测抗原至工作浓度, 每孔 00 ml, 于 4 过夜包被化学发光板, 用 PBST 洗涤 3 次, 每孔加入 300 ml 5% 脱脂牛奶, 在 37 温育封闭 h, 倾去封闭液,PBST 洗涤 3 次 FB 标准品或稀释的样品提取液 (50 ml/ 孔 ) 和酶标抗体稀释液 (50 ml/ 孔 ) 加入到抗原包被好的板孔中, 混匀,37 温育 0 min,pbst 洗涤 4 次, 每孔加发光底物液 00 ml, 用化学发光检测仪测量相对发光强度单位 (Relative light units, RLU).6. 参数的优化参考文献 [0], 以 RLU max /IC 50 比值作为各影响因素优化的指标, 选择 RLU max /IC 50 比值较高时的条件作为最佳参数 按照.6. 节操作步骤分别对检测抗原包被浓度 酶标抗体工作稀释度和竞争反应时间等参数进行优化.6.3 玉米样品加标回收率及谷物样品分析将 FB 标准品加到 g 粉碎的玉米样品 (HPLC 检测为 FB 阴性 ), 添加浓度为 和 500 mg/kg, 每个加标质量浓度重复 3 次 样品提取方法参照文献 [9], 取上清液进行 测定, 计算平均加标回收率 3 结果与讨论 3. 单克隆抗体的制备与鉴定细胞融合后筛选到 株能稳定分泌抗 FB 抗体的杂交瘤细胞 (8A6) 单克隆抗体经小鼠抗体分型试纸条鉴定为 IgG, κ 型 间接 ELISA 测定原始腹水中抗体的效价高达 通过间接竞争 ELISA, 绘制了 FB 及常见真菌毒素抑制曲线并计算交叉反应率 ( 图 ), 此抗体与 FB 与 FB 交叉反应率分别为 00% 和 9.7%, 不能识别其它常见真菌毒素 结果表明, 此单克隆抗体亲和力高, 且特异性强 3. 化学发光底物液的配制单因素实验确定鲁米诺 对碘苯酚和过氧化脲较佳浓度范围分别为 3.75~5.00 mmol/l, 0.3 mmol/l,.5~3.0 mmol/l 采用 Box-Behnken 响应面法分析表明, 对碘苯酚与鲁米诺和过氧化脲的交互作用不

3 第期许杨等 : 伏马菌素 B 单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立 显著 ; 鲁米诺与过氧化脲的交互作用显著 模拟并验证得到最佳底物配方为 : 鲁米诺浓度为 mmol/l 过氧化脲浓度为 3.0 mmol/l 对碘苯酚浓度为 0.4 mmol/l 3.3 参数的优化为建立 FB 的 检测方法, 本实验优化了检测抗原 (FB -OVA) 包被浓度 酶标抗体稀释度以及竞争反应时间等参数 RLU max /IC 50 比值是评价某个特定参数对 DC-CLEIA 反应体系影响的重要指标, 比值越高, 表明此参数对检测体系的影响越 [0] 大 此外,IC 50 值通常也是评价检测体系的重要指标 因此, 在进行条件优化时需综合考虑两者, 以获得最佳条件 图 表明, 最佳 FB -OVA 包被浓度为 0.4 mg/l, 最佳酶标抗体的稀释度为 3000, 最佳竞争反应时间为 0 min 图 anti-fb 单克隆抗体与常见真菌毒素的竞争抑制曲线 Fig. Inhibitive curves of anti-fumonisinb (FB ) monoclonal antibody (McAb) with common mycotoxin 图 参数优化 :(a) FB -OVA 抗原包被浓度,(b) 酶标抗体稀释度,(c) 竞争反应时间 Fig. Optimization of parameters: (a) concentration of FB -ovalbumin (OVA), (b) dilution factor of HRP-antibody, (c) competitive reaction time 3.4 直接竞争酶联免疫 (dc-elisa) 和 的标准曲线在优化条件下, 分别建立了检测 FB 的 dc-elisa 和 方法, 绘制标准曲线, 结果见 图 3 两种检测方法的实验条件与结果对比见表 相对于 dc-elisa, 表现出对 FB 更高的灵 敏度和更短的反应时间 dc-elisa 检测抗原包被浓 度为 的 3 倍, 提示检测信号的放大导致检 测抗原包被浓度降低, 有利于提高检测体系的灵敏 度 以 IC 50 值相对标准偏差 (n= 6) 计算得到 dc- 图 3 dc-elisa 和 的标准抑制曲线 CLEIA 的批内与批间平均相对标准偏差分别为. Fig. 3 Standard inhibitive curves of dc-elisa 4% 和 9.% and 3.5 玉米样品加标回收率与谷物样品检测 将 FB 标准品加入 g 阴性玉米样品, 检测的回收率为 00.% ~5.4%, 相对标准偏差 小于 8.7% 分别采用 和 HPLC 法, 以及商业化 ELISA 试剂盒, 分别对 40 份谷物样品进行检测, 结果 见表 结果表明, 采用 时,40 份样品中 FB 的检出率明显高于 HPLC 法和商业试剂盒 ; 对 于同一样品,dc-ELISA 检测结果偏高, 可能与样品提取方法的回收率 样品基质干扰和方法的检出限有 关 检测结果与 HPLC 和商业化 ELISA 试剂盒的检测结果拟合相关系数分别为 0.96 和 0.979

4 分析化学 表 dc-elisa 与 的参数对比 Table Parameters comparison of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-elisa)and direct competitive chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay() 方法 Method FB -OVA 浓度 Concentration of FB -OVA HRP-antibody 稀释度 Dilution factor of IgG-antibody 反应时间 Reaction time (min) IC 50 线性范围 (IC 0~IC 80 ) Iinear concentration range 检出限 (IC 0 ) Limit of detection dc-elisa ~ ~ 表 40 份谷物样品中 FB 含量检测结果 (n=3) Table Detection result of FB concentration in 40 cereal samples (n=3) 样品 Sample 本方法 高效液相色谱法 HPLC [9] 商业试剂盒 Commercial kit 样品 Sample 本方法 高效液相色谱法 HPLC [9] 商业试剂盒 Commercial kit 注 : 表示阴性 ; HPLC 商业化 ELISA 剂盒检出限分别为 0.3,6.6 和.0 mg/kg Note: represents negative result; the detection limits of dc-elisa, HPLC and commercial ELISA kit were 0.3, 6.6 and.0 mg/kg. 实验表明, 制备的 FB 单克隆抗体亲和力高 特异性强, 基于其建立的直接竞争化学发光免疫检测 方法灵敏度好, 检测时间短, 适用于谷物中 FB 的高通量快速筛查 References ThomasS W,AbbasH K,Abou-Karam M.J.Toxicol.Toxin.Rev.,003,(4):59-66 IARC,InternationalAgencyforResearchonCancer.FumonisinB.IARC,Lyon,France,00,8: VossK A,SmithG W,Haschek W M.Anim.Feed.Sci.Technol.,007,37(3-4): DomijanA M,AbramovA Y.Int.J.BiochemCelBiol.,0,43(6): EU CommissionRegulation (EC)No.6/007of8September007Amendingregulation (EC)No.88/006 6 NdubeN,WesthuizenLvd,ShephardGS.Mycotox.Res.,009,5(4):5-8 7 ArcoG,Fern 췍ndeẕFranzón M,FontG,DamianiP,MañesJ.J.Chromatogr.A,008,09(-): WangS,QuanY,LeeNanju,KennedlvanR.J.Agric.FoodChem.,006,54(7): LIUShi-Wen,HE Qing-Hua,ZOU Long,XU Yang.ChineseFoodSci.,00,3(8): 刘师文, 何庆华, 邹龙, 许杨. 食品科学,00,3(8): QuanY,ZhangY,WangS,LeeNanju,KennedlvanR.Anal.Chim.Acta,006,580():-8 G췍 miẕgracial,garcía-campañaa M,Huertas-PérezJF,LaraFJ.Anal.Chim.Acta,009,640(-):7-8 ZongC,WuJ,WangC,JuH G,YanF.Anal.Chem.,0,84(5): MarqueteC A,CouletPR,Blum LJ.Anal.Chim.Acta,999,398(-3):73-8

5 第期许杨等 : 伏马菌素 B 单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立 4 SassolasA,CwaratananteG,HayatA,StewartLD,EliotCT,MartyJL.FoodControl,0,DOI:0.06/ j.foodcont YANGJi-Yan,HU Lei,XU Yang.ChineseFoodSci.,009,30(06):9-33 杨冀艳, 胡磊, 许杨. 食品科学,009,30(06):9-33 ProductionofMonoclonalAntibodiesforDetectionofFumonisionB bychemiluminescenceenzyme-linkedimmunosorbentasaay XU Yang *,ZOU Long,LIUShi-wen,LIUJing,CHENBo (StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,Sino-GermanyJointResearchInstitute, NanchangUniversity,Nanchang330047,China) (JiangXiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang33009,China) Abstract Based on monoclonal antibodies with high afinity against fumonisin B,a direct competitivechemiluminescenceenzymeḻinkedimmunosorbentassay()fordetectionoffb incerealwasdeveloped.fb artificialantigens weresynthesized bythecarbodimidecrosslinking methods,andthenahybridomacelthatsecretedtheantibodyselectivelyidentifiesfb wasselected throughcelfusion.the monoclonalantibodytiterwasfoundashigheras.8 0 6,which was labeledwithhorseradishperoxidase (HRP)throughsodium periodateactivationfordevelopmentof dc-celia.agoodlinearitywasachievedoveraconcentrationrangeof mg/l,theic50 valueandthelimitofdetection were.43 mg/l and0.3 mg/l,respectively.meanwhile,the competitivereactiontimewasonly0min.therecoveriesoffbinaltissueswerebetween00.% -5.4% andtherelativestandarddeviation waslessthan8.7%.the wasappliedin quantificationoffbeliminationincereal,theresultsshowedgoodcorrelationsoftheresultsobtained byhplcandacommercialelisakit. Keywords FumonisinB;Monoclonalantibody;Chemiluminescenceenzymeimmunoassay;Cereal (Received9February0;accepted4June0)

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