2009,29(1) 张海棠等 : 高亲和力莱克多巴胺单克隆抗体的研制及 cielisa 检测方法的建立 51 工抗原 BSA?RAC, 用 UV 和 SDS?PAGE 鉴定 1.3 细胞融合备用小鼠的选择 BSA?RAC 免疫 6 周龄雌性 Balb/C 小鼠 5 只, 剂量为只 50μg 蛋白质

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耸韵向
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(1):50~55 高亲和力莱克多巴胺单克隆抗体的研制及 cielisa 检测方法的建立 1 张海棠 1 王自良 2 邓瑞广 2 张改平 1 范国英 1 姜金庆 (1 河南科技学院动物科学学院新乡河南省动物免疫学重点实验室郑州 ) 摘要用混合酸酐法 (MA) 将莱克多巴胺 (RAC) 偶联于牛血清白蛋白 (BSA), 合成人工抗原 BSA?RAC, 用 UV 和 SDS?PAGE 鉴定 ; 用 BSA?RAC 免疫 Balb/c 小鼠, 细胞融合技术建立高亲和力 RAC 单克隆抗体 (mab) 杂交瘤细胞株, 体内诱生腹水法制备 RACmAb; 应用 RACmAb 研制 RAC 残留快速检测 cielisa 试剂盒 (RAC?Kit), 并测定其性能结果表明,BSA?RAC 偶联成功, 分子结合比为 ; 筛选出 3 株杂交瘤细胞, 其中最好的 4D8 株亲和常数 (Ka) 为 L/mol;RAC? Kit 的检测限为 0.5ng/ml, 检测范围为 0.5~151ng/ml, 饲料样猪尿样的平均添加回收率为 87.2%,89.4%, 平均批内和批间变异系数小于 15%, 与多巴酚丁胺的交叉反应率 (CR%) 为 9.7%, 与其它化合物无 CR,RAC?Kit 在 4 保存期为 180d 关键词莱克多巴胺人工抗原单克隆抗体竞争 ELISA 快速检测试剂盒中图分类号 Q819 莱克多巴胺 (ractopamine,rac) 和克伦特罗 ( 瘦肉精 ) 同属于苯乙醇胺类 β 2? 肾上腺素受体激动剂, 其在猪肉食品中残留对食用者具有心脏生殖等危害作用, 除美国 FDA 外, 世界各国均禁止将 RAC 用于生猪生产, 尤其近年来, 随着我国政府对非法使用克伦特罗打击力度的加大,RAC 的非法使用日趋严重 RAC 残留传统的检测方法如 HPLC,LC?MS 等由于存在需要昂贵的仪器设备熟练的专业人员烦琐费时周期长费用高不能现场操作等缺陷, 不能满足实际检测工作的需求 [1] ELISA 技术具有敏感特异快速简便的特点, 近年来已被应用于 [2] RAC 残留检测,Haasnootet 等建立了阻断 ELISA 方法, [3] Shelver 等建立了间接竞争 ELISA(ciELISA) 方法, 国内 [4] [5] 于洪侠等对 RAC 多克隆抗体 (RACpAb) 曲? 等对 RAC 单克隆抗体 (RAC mab) 进行了研究, 但有关 cielisa 检测方法的建立尚未见报道本研究应用细胞融合技术在建立分泌高亲和力 RAC 单克隆抗体 (RAC mab) 杂交瘤细胞株的基础上, 成功研制出 RAC 残留快速检测 cielisa 试剂盒 (RAC?Kit), 并对其性能进行了测定收稿日期 : 修回日期 : 国家十一五科技支撑计划重大项目资助 (2006BAK02A21/1) 通讯作者, 电子信箱 :wangzl_2008@yahoo.com.cn 1 材料与方法 1.1 动物细胞试剂与溶液 Balb/c 小鼠购自郑州大学医学院小鼠骨髓瘤细胞 NS0 由英国国家动物健康研究院惠赠 RAC 盐酸克伦特罗硫酸沙丁胺醇盐酸多巴酚丁胺肾上腺素去甲肾上腺素和异丙肾上腺素为 Sigma 产品 ;BSA 和 OVA 为 Pierce 产品 ; 弗氏佐剂 FCA FIA 细胞培养基 RPMI?1640 HAT HT PEG4000 和胎牛血清为 Gibco 产品 ; 羊抗鼠 IgG(GaMIgG) HRP 标记 GaMIgG(GaRIgG? HRP) 四甲基联苯胺 (TMB) 为 Amresco 产品 ;HRP 标记 RAC(HRP?RAC) 为本课题组制备其它化学试剂均为国产 AR 级用 0.01mol/LpH7.4 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 配制不同浓度的 RAC 标准液 ;ELISA 所用洗液 (PBST) 为 PBS 含 0.05% Tween?20, 包被液为 0.05 mol/lph9.6 的碳酸盐缓冲液 (CBS), 封闭液稀释液为含 5% 猪血清的 PBST; 酶底物为 TMB 的磷酸? 柠檬酸缓冲液 ; 终止液为 2mol/L 的硫酸溶液 1.2 人工抗原的合成 [6] 参照 Shelver 等所述的混合酸酐法 (MA) 合成人

2 2009,29(1) 张海棠等 : 高亲和力莱克多巴胺单克隆抗体的研制及 cielisa 检测方法的建立 51 工抗原 BSA?RAC, 用 UV 和 SDS?PAGE 鉴定 1.3 细胞融合备用小鼠的选择 BSA?RAC 免疫 6 周龄雌性 Balb/C 小鼠 5 只, 剂量为只 50μg 蛋白质溶解于 0.2mlPBS, 背部皮下分点注射, 免疫程序参见文献 [7] 最后 1 次免疫后 10d 断尾采血分离血清, 间接 ELISA 检测抗 RAC 多克隆抗体 (RACpAb) 效价, 阻断 ELISA 检测 RACpAb 对 RAC 的 50% 抑制浓度 (IC 50 ), 挑选效价 < 且 IC 50 最低的小鼠, 超免用于细胞融合 [8] 1.4 杂交瘤细胞株的制备与亲和力测定细胞融合融合细胞培养及阳性杂交瘤筛选与克 [9] 隆, 按常规技术操作体内诱生腹水法制备 RAC mab 饱和 ELISA [10] 测定其亲和常数 (Ka) 1.5 cielisa 方法的建立 RACmAb 与 HRP?RAC 工作浓度的确定方阵法 [11] cielisa 的操作步骤第 1 步,GaMIgG10μg/ ml 包板, 每孔 100μl,37 2h, 洗板 ; 第 2 步, 封闭液封闭, 每孔 250μl,37 1h, 洗板 ; 第 3 步, 加入工作浓度 RACmAb, 每孔 50μl, 设阴性和空白对照,37 15min, 洗板 ; 第 4 步, 加入工作浓度 HRP?RAC, 每孔 50μl, 同时等体积加入 RAC 标准液 ( 浓度分别为 0,0.11,0.33, 1,3,9,27,81ng/ml),37 30min, 洗板 ; 第 5 步, 加入酶底物, 每孔 100μl, 室温 5min; 第 6 步, 加入终止液, 每孔 100μl; 第 7 步, 读 A 450 值, 记录结果 RAC?Kit 的标准曲线绘制与曲线拟合 cielisa 测定 RACmAb 对 RAC 不同浓度标准液的抑制率 B/B 0 %(B 是 RAC 不同浓度标准液的 A 450 值,B 0 是 RAC 零浓度标准液的 A 450 值 ), 以 B/B 0 % 为 y 轴, 以不同浓度标准液的对数值 (lg[rac]) 为 x 轴, 绘制标准曲线, 进行回归分析 RAC?Kit 的配置 GaMIgG 包被并封闭好的 8 12 孔酶标板,C1 号液 ( 工作浓度 RACmAb),C2 号液 ( 工作浓度 HRP?RAC),C3,C4 号液 ( 底物缓冲液 ), C5 号液 ( 终止液 ),RAC 标准品 1~10(0,0.5,1,2,4, 8,16,32,64,128ng/ml),PBST 等待测样品的预处理饲料样, 用研钵研碎, 称取 10g, 加入 40mlPBS 和 5ml1mol/LNaOH 溶液, 搅拌 30min,4000r/min 离心, 上清液用 5ml1mol/LHCl 调 ph 值 7.2, 加热浓缩至 10ml, 冷却至室温后用于检测猪尿样, 直接检测, 若浑浊不清, 可离心或过滤后用于检测 1.6 RAC?Kit 的性能测定灵敏度 RAC?Kit 测定 20 个不同批次的空白标准品, 计算 A 450 值的平均值 (X) 和标准差 (SD), 按照公式 LOD% =(X -2SD)/X 100%, 确定检测限 (LOD) 准确度将 RAC 标准品添加到饲料样猪尿样中, 使终浓度分别为 0.5,2,8,32ng/ml, 设 6 个重复, 以回收率和变异系数 (CV) 确定其准确度特异性 RAC?Kit 测定 RAC 与各竞争物的 IC 50, 按照 CR% =IC 50 (RAC)/IC 50 ( 竞争物 ) 100 计算其交叉反应率 (CR%) 保存期取同一批次 RAC?Kit, 保存于 4, 测定保存 6 个月中各月份的 A 450,IC 50,R 2 变化情况, 确定保存期应用符合实验应用自制 RAC?Kit 对郑州市许昌市新乡市南阳市等地养殖场户采集的 3000 多份生猪尿样进行筛检, 对检出的 96 份阳性尿样用英国 Randox 产品 RAC?Kit 和 GC?MS 进行符合实验 2 结果 2.1 人工抗原的鉴定 UV 鉴定结果见图 1 BSA 最大吸收峰在 280nm,RAC 最大吸收峰在 272nm, 两者偶联后, 其峰叠加并位移至 276nm, 表明偶联成功 ; 依据朗伯? 比尔定律, 推算出 BSA?RAC 的分子结合比为图 1 BSA,RAC 和 BSA?RAC 的紫外扫描光谱 Fig.1 UVscanningspectrum ofbsa, RACandBSA?RAC SDS?PAGE 鉴定结果见图 2 BSA 的泳动速度大于 BSA?RAC, 说明 BSA?RAC 的分子量大于 BSA, 证明 RAC 与 BSA 已成功偶联 ; 用紫外凝胶成像系统分

52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.12009 析软件分析得出,BSA?RAC 的分子量为 7.45 10 4, BSA 的分子量为 6.62 10 4,BSA 与 RAC 的分子结合比约为 1 24.5, 与 UV 鉴定结果一致图 4 RACpAb 对 RAC 的抑制曲线 Fig.

3 52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 析软件分析得出,BSA?RAC 的分子量为 , BSA 的分子量为 ,BSA 与 RAC 的分子结合比约为 , 与 UV 鉴定结果一致图 4 RACpAb 对 RAC 的抑制曲线 Fig.4 InhibitivecurveofRACpAbagainstRAC byblockingelisa 图 2 BSA?RAC 的 SDS?PAGE 图 Fig.2 IdentificationofBSA?RACconjugationby SDS?PAGE James 等 [12] Ka 为 10 7 ~10 12 L/mol 为高亲和力抗体的理论,3 种 mab 亲和力均较高,4D8 最好 2.2 杂交瘤细胞株的建立细胞融合小鼠的选择结果见图 3 图 4 免疫的 5 只小鼠抗体效价均达到了 10?3, 说明获得了较好的免疫效果, 其中 2 号鼠最高为 ,IC 50 最低为 270ng/ml, 选择 2 号鼠用于细胞融合图 5 RACmAb 的亲和常数测定曲线 Fig.5 Theasociationconstant(Ka) curveofracmab 2.3 cielisa 方法的建立方阵法确定 HRP?RAC 与 RACmAb 的工作浓度分别为和 RAC?Kit 标准曲线见图 6, 曲图 3 RACpAb 效价测定曲线 Fig.3 ThetitersofRACpAbbyindirectELISA 线回归方程为 y= x ,r 2 = ,IC 50 为 3.88ng/ml, 线性范围为 0.5~151ng/ml 阳性杂交瘤细胞株的筛选融合后 10d 观察融合效果,6 块细胞培养板 576 孔中有细胞克隆形成的 528 孔, 融合率为 91.7%; 间接 ELISA 检测阳性 84 孔, 阳性率为 14.6%; 阻断 ELISA 和 cielisa 测定其 IC 50,3 次有限稀释法亚克隆后获得 3 株高效价敏感特异的杂交瘤, 分别命名为 3F10,3H12,4D8, 经 10 次传代冻存及复苏, 杂交瘤分泌抗体稳定 Ka 测定结果见图 5, 3F10,3H12,4D8 所分泌的 mab 与 BSA?RAC 结合达到 50% 饱和所需浓度分别为 3.78,4.71,0.97μg/ml,Ka 分别为 , , L/mol, 根据图 6 RAC?Kit 标准曲线 Fig.6 CalibrationcurveofRAC?Kit

4 2009,29(1) 张海棠等 : 高亲和力莱克多巴胺单克隆抗体的研制及 cielisa 检测方法的建立 RAC?Kit 的性能测定灵敏度 cielisa 检测 20 个不同批次的空白标准品,X= Xi/n=1.036,SD={[n X 2 -( X) 2 ]/[n (n-1)]} 1/2 =0.087,LOD% =(X-2SD)/ X 100% =83.2%,LOD=0.342ng/ml, 即 RAC?Kit 的灵敏度, 但考虑到实际检测工作的需要和用户操作方面的误差, 其检测限确定为 0.5ng/ml 准确度结果见表 1 饲料样的回收率在 79.4% ~108%, 平均 87.2%,CV 在 11.3% ~14.7%, 平均 13.2%; 猪尿样的回收率在 83.8% ~94%, 平均 89.4%,CV 在 9.2% ~13.8%, 平均 10.7%; 平均 CV 小于 15%, 表明 RAC?Kit 具有较高的准确度表 1 RAC?Kit 添加回收试验 (n=6) Table1 RecoverytestofRACaddedtodiferent samplesbyrac?kit 样品 Sample 饲料 Feed 尿液 Urine RAC 添加量测定值 AmountofRAC Measuredvalue (ng/ml) (ng/ml) ± ± ± ± ± ± ± ±4.18 回收率 Recovery (%) 93± ±13 86± ±12 94±14 93± ± ±13.1 CV (%) 特异性结果见表 2 RACmAb 对多巴酚丁胺的 CR% 为 9.7%, 与其它化合物的 CR% 小于 0.01%, 说明 RAC?Kit 特异性强表 2 RAC?Kit 与 RAC 类似化合物的交叉反应 Table2 Thepercentcros?reactivityofRAC?Kitwith RACanalogouscompounds 化合物 Compounds IC 50 (ng/ml) 交叉反应率 Cros?reactivity(%) 莱克多巴胺 Ractopamine 多巴酚丁胺 Dobutamine 克伦特罗 Clenbuterol > <0.1 沙丁胺醇 Salbutamol > <0.1 肾上腺素 Adrenalin > <0.1 去甲肾上腺素 Norepinephrine > <0.1 异丙肾上腺素 Isoprenaline > < 保存期结果见表 3 随着 RAC?Kit 保存期延长, 各标准品的 A 450 值有所减小, 但其 IC 50,R 2 变化不大, 曲线拟合良好, 说明 RAC?Kit 在 4 180d 保存期内质量稳定表 3 RAC?Kit 的保存期 Table3 ValidityofRAC?Kit IC 50 保存天数 (d) R Conservationdays 最大吸光值 (ng/ml) Amax 应用符合实验结果见表 4 对用自制 RAC? Kit 检测出的阳性样品 96 份, 用 Randox 标准 RAC?Kit 进行符合, 其中有 1 份为阴性, 其阳性符合率为 99.0%; 用 GC?MS 进行符合, 其中有 2 份为阴性, 其阳性符合率为 98.1 自制 RAC?Kit 与标准 RAC?Kit 和 GC?MS 具有较好的一致性表 4 自制 RAC?Kit 与标准 RAC?Kit, GC?MS 的应用符合实验结果比较 Table4 Comparisonofapplicationcoincidenceresultsby self?maderac?kit,standardrac?kitandgc?ms 比较项目 Comparisonitems 自制 RAC?Kit Self?made RAC?Kit 标准 RAC?Kit Standard GC?MS RAC?Kit 样品数 PositiveSamplenumber 阳性数 Positive 阴性数 Negative 阳性符合率 Positivecoincidencepercentage(%) 讨论 3.1 RAC 人工免疫原的合成 [2] Haasnootw 等研究证实 RAC 的抗原决定簇是两个苯酚中的酚羟基和亚氨基结构因此, 合成 RAC 人工抗原可采用两种方法, 一是 1,4? 丁二醚法, 碱性条件下 (ph10.8),1,4? 丁二醚上游离的环氧基团与酚羟基反应即可偶联 ; 二是 MA 法,RAC 与戊二酸酐反应引入活性基团羧基, 再与氯甲酸异丁酯反应通过单酰胺键将其偶联起来笔者进行了对比试验, 前者引入的间隔臂较长,13 个碳原子, 易产生桥抗体, 后者为单酰胺键,2 个碳原子位, 长度适宜, 免疫效果更好 3.2 高亲和力 RACmAb 杂交瘤细胞株的筛选成功制备半抗原的高亲和力 mab 必须建立一个可靠的杂交瘤细胞筛选体系, 要求该体系能够准确测定

5 54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 半抗原抗体效价排除载体蛋白和桥抗体的干扰确定 mab 的敏感性和亲和性本实验采用 MA 法制备免疫抗原 BSA?RAC( 单酰胺键为桥 ),1,4? 丁二醚法制备异质包被抗原偶 OVA?RAC( 丁二醚键为桥 ), 间接 ELISA 测定细胞培养上清效价, 排除载体蛋白与桥抗体的干扰, 阻断 ELISA 和 cielisa 测定阳性杂交瘤对 RAC 的敏感性, 饱和 ELISA 测定 Ka, 从而筛选出了效价高敏感性强亲和力高的杂交瘤细胞株 3.3 RAC?Kit 的质量性能 RAC?Kit 的灵敏度由抗体亲和力决定, 实验所用 RACmAb 为高亲和力抗体,RAC?Kit 具有较高的灵敏度, 检测限为 0.5ng/ml; 准确性由标准曲线标准点的设同类产品 Congenericproducts 表 5 RAC?Kit 同类产品性能比较置决定, 本实验将标准点 B/B 0 % 与 RAC 浓度的对数值设置在同一条曲线上体现其线性, 通过添加回收试验证实, 所设标准点线性关系好, 准确性高 ; 特异性由抗体的特异性决定, 采用交叉反应实验鉴定了 RAC?Kit 的特异性研制的 RAC?Kit 具有较高的敏感性准确性和特异性, 可用于 RAC 残留检测的推广应用 3.4 与国内外同类产品的性能比较 RAC?Kit 同类产品性能比较结果见表 5 本课题研制的 RAC?Kit 通过与国内外同类产品性能指标的对比分析, 结果表明, 自行研制 RAC?Kit 的质量性能与国内同类产品相当, 与国外同类产品接近 Table5 PerformancecomparisonofRAC?Kithomogeousproducts 检测限 Detectionlimit(ng/ml) 性能指标 Performanceindex 回收率 Recovery(%) 交叉反应率 Cros?reactivity(%) CV(%) 本实验研制 RAC?Kit RAC?Kitofthestudy ±20 多巴酚丁胺 9.7, 其它 <0.1 <15 北京望尔生物技术公司 RAC?Kit RAC?KitofBeijingWangerBiotechnologyCo.,Ltd ±20 多巴酚丁胺 12.4, 其它 <0.1 <15 广州弗赛生物科技公司 RAC?Kit RAC?KitofGuangzhouMandraxBiotechnologyCo.,Ltd ±20 多巴酚丁胺 3.0, 其它 <0.1 <25 深圳绿诗源生物技术公司 RAC?Kit RAC?KitofShenzhenLvshiyuanBiotechnologyCo.,Ltd ±15 多巴酚丁胺 13, 其它 <0.1 <20 常州赛沃生物科技公司 RAC?Kit RAC?KitofChangzhouSEOBiotechnologiesCo.,Ltd ±15 多巴酚丁胺 5.3, 其它 <0.1 <20 RAC?KitofGermanyGreenspringDiagnosticCorporation ±15 多巴酚丁胺 10, 其它 <0.1 <15 RAC?KitofEnglandRandoxLaboratoriesLtd ±15 多巴酚丁胺 7.9, 其它 <0.1 <15 参考文献 [1]DicksonLC,MacneilJD,LeeS,etal.Determinationofbeta? agonistresiduesinbovineurineusingliquidchromatography? tandemmasspectrometry.jaoacint,2005,88(1):45~46 [2]HaasnootW,StoutenP,LommenA,Determinationoffenoterol andractopamineinurinebyenzymeimmunoasay.analyst, 1994,119(12):2675~2680 [3]ShelverW L,SmithDJ.Developmentofanimmunoasayfor theβ?adrenergicagonistractopamine.journalofimmunoasay, 2000,21(1):1~23 [4] 于洪侠, 杨曙明, 朱宇. 莱克多巴胺多克隆抗体的制备. 中国兽医科学,2006,36(1):62~65 YuH X,YangSM,ZhuY.VeterinaryScienceinChina, 2006,36(1):62~65 [5] 曲?, 齐孟文. 莱克多巴胺单克隆抗体的制备与初步鉴定. 核农学报,2005,19(5):393~396 QuQ,QiM W.JournalofNuclearAgriculturalSciences, 2005,19(5):393~396 [6] ShelverW L, Smith D J, Bery E S. Production and characterizationofamonoclonalantibodyagainstthebeta? adrenergicagonistractopamine.journalofagriculturalfood Chemistry,2000,48(9):4020~4026 [7] 王琳, 齐孟文, 冯才伟, 等. 邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定. 中国生物工程杂志,2006,26(2):66~68 WangL,QiM W,FengCW,etal.ChinaBiotechnology, 2006,26(2):66~68 [8] Tijsen P. Practice and theory ofenzyme immunoasay. Amsterdam:Elsever,1985:173~210 [9] 朱力平, 陈学清. 免疫学实验方法. 北京 : 人民军医出版社,2000:356~357 ZhuLP,ChenX Q.ExperimentalMethodsofImmunolog. Beijing:People,sMilitaryMedicinePres,2000:356~357 [10] BatyJD, BeatyB G, WlanosW G. Measurementof monoclonalantibody afinity by non?competitive enzyme immunoasay.journalofimmunologymethods,1987(100): 173~179 [11] 沈建忠, 何方洋, 何继红, 等. 动物组织中磺胺二甲嘧啶残

6 2009,29(1) 张海棠等 : 高亲和力莱克多巴胺单克隆抗体的研制及 cielisa 检测方法的建立 55 留检测 ELISA 试剂盒的研制. 中国兽医杂志,2003,39 (6):6~8 ShenJZ, HeF Y, HeJH, etal. ChineseJournalof VeterinaryMedicine,2003,39(6):6~8 [12]JamesW G.Monoclonalantibodies:principlesandpractice. Academicpres,IncLtd,1983:142~147 GenerationofHighAfinityMonoclonalAntibodyandDevelopment ofcielisakitforrapiddetectionofractopamine ZHANGHai?tang 1 WANGZi?liang 1 DENGRiu?guang 2 ZHANGGai?ping 2 FANGuo?ying 1 JIANGJin?qing 1 (1ColegeofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang ,China) (2HenanProvincialKeyLaboratoryforAnimalImmunology,Zhengzhou ,China) Abstract Mixedanhydride(MA)wasusedtoconjugateractopamine(RAC)tobovineserum albumin (BSA)andobtainedartificialantigenBSA?RACidentifiedbyUVandSDS?PAGE.Balb/cmicewereimmunized withbsa?rac andhybridomalinesthatsecreterac monoclonalantibody(mab) weregeneratedwithcel fusion.acielisakitfordetectionofrac(rac?kit)wasdevelopedwithracmabanditstraitsweretested. TheresultsindicatedthatBSA?RACwassynthesizedsuccesfulyanditsconjugationratioofRACtoBSAwas about Threehybridomalineswerefilteredandthebestonewas4D8,itsafinityconstant(Ka)was L/mol.ThedetectionlimitofRAC?Kitwas0.5ng/mlanditsdetectionrangewas0.5to151ng/ml. TherecoveriesofRACspikedinfeedwere87.2% andinswineurinewere89.4%.theprecisionandaccuracy oftheasayasdeterminedbyinter?asayandintra?asaycoeficientvariationwerelesthan15%,andhad9.7% cros?reactivity(cr%)todobutamine,andlitleornocrtoothercompounds.thevalidityofrac?kitin4 wasin180d. Keywords Ractopamine Artificialantigen Monoclonalantibody CompetitiveELISA Rapidtestkit