分析检测食品科学 21, Vol. 31, No 近年来, 瘦肉精克伦特罗常被发现非法添加在动物饲料中以增加饲料报酬率, 导致严重的瘦肉精中 [1-3] 毒事件时有发生, 政府监

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镰席匡
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1 27 21, Vol. 31, No. 2 食品科学分析检测 ELISA 王保玲 1,2, 袁利鹏 2, 雷红涛 2, *, 徐振林 2, 杨金易 2, 孙远明 2, 丁武 1, 庞杰 3 (1. 西北农林科技大学食品科学与工程学院, 陕西杨凌 7121;2. 广东省食品质量安全重点实验室, 华南农业大学食品学院, 广东广州 51642;3. 福建农林大学食品科技学院, 福建福州 352) : 建立沙丁胺醇的直接竞争 ELISA(dcELISA) 快速检测方法, 采用高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体, 棋盘滴定法确定包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数, 通过单因素试验, 考察反应体系中表面活性剂离子浓度甲醇体积分数 ph 值因素对 dcelisa 性能的影响, 确定最优检测条件, 同时考察方法的特异性结果表明 : 酶标抗体克分子比为 2.1 时偶合物的滴度最高, 最佳反应条件为包被抗原质量浓度 1μg/mL, 酶标抗体稀释 256 倍,.1mol/L ph7.4 的磷酸盐抗体稀释液 (PBS) 中含体积分数.5% 的 Tween-2.5mol/L NaCl 溶液和体积分数 5% 的甲醇时 dcelisa 具有最高的灵敏度和最好的稳定性, 所建立方法的 IC5 为 1.3ng/mL, 检测限为.49ng/mL, 线性范围.3~76.3ng/mL, 批内变异系数 13.8%, 批间变异系数为 22.38%, 与克伦特罗交叉反应率为 %, 与溴布特罗交差反应率为 29.9%, 与其他结构类似物没有明显交叉反应本研究所建立的 dcelisa 可用于沙丁胺醇和克伦特罗的多残留检测 : 沙丁胺醇 ; 酶标抗体 ; 直接竞争 ELISA Direct Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Rapid Determination of Salbutamol WANG Bao-ling 1,2,YUAN Li-peng 2,LEI Hong-tao 2, *,XU Zhen-lin 2,YANG Jin-yi 2, SUN Yuan-ming 2,DING Wu 1,PANG Jie 3 (1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 7121, China;2. Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 51642, China ;3. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 352, China) Abstract:A direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dcelisa) was developed for rapidly determining salbutamol. Horseradish peroxidase-labeled salbutamol monoclonal antibodies were synthesized by sodium periodate method. The optimal coating concentration and antibody dilution were determined by chequerboard titration. The effects of surfactants, ion concentration, methanol content and ph on the sensitivity of dcelisa were investigated by single-factor experiments. The results showed that the optimal molar ratio of enzyme-labeled antibody was 2.1. The optimized assay conditions for both the highest sensitivity and the best stability were as follows: coating antigen concentration, 1μg/mL; and dilution fold of antibodyenzyme conjugate in.1 mol/l ph 7.4 PBS dilution containing.5 % Tween-2,.5 mol/ml NaCl, and 5% methanol, 256. The developed method presented an IC5 of 1.3 ng/ml, a detection limit of.49 ng/ml, a linear range of.3 to 76.3 ng/ml, with an intra-batch CV of 13.8 % and an inter-batch CV of 22.38%, and % and 29.9% cross-reactivity rates with clenbuterol and brombuterol, respectively, without notable cross-reactivity with other structural analogues of salbutamol. This study provides valuable experimental data for developing a commercial immunoassay kit for the rapid determination of multiresidues of salbutamol and clenbuterol. Key words:salbutamol;enzyme-labeled antibody;direct competitive ELISA 中图分类号 :S 文献标识码 :A 文章编号 :12-663(21) 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (287729;37663); 十一五国家科技支撑计划项目 (26BAD27B2-5); 广东省科技计划项目 (29B452;zgzhzd88) 作者简介 : 王保玲 (1984 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品质量与安全 wbl1326@foxmail.com * 通信作者 : 雷红涛 (1973 ), 男, 副教授, 博士, 研究方向为食品安全生物分析化学 hongtao@scau.edu.cn

2 分析检测食品科学 21, Vol. 31, No 近年来, 瘦肉精克伦特罗常被发现非法添加在动物饲料中以增加饲料报酬率, 导致严重的瘦肉精中 [1-3] 毒事件时有发生, 政府监管力度也因此不断加强, 为逃避监管, 不法者不断寻找新的瘦肉精替代品沙丁胺醇 (salbutamol,sal) 是一种类似克伦特罗的 β- 肾上腺素兴奋剂, 在临床上常用于防治哮喘和支气管痉挛, 但摄入过量则会导致心悸头疼目眩恶心 [4] 甚至损害肝肾, 其残留严重危害着人们的身体健康和生命安全作为一种潜在的瘦肉精替代品, 很有必要加强沙丁胺醇的监控目前国内外对沙丁胺醇残留的检测主要采用仪器分 [5-8] 析方法仪器设备检测虽然准确灵敏, 但设备昂贵, 样品前处理复杂, 需要专业人员才可操作, 不适于大量样品的筛选检测免疫分析方法操作简便快捷高通量灵敏度高, 目前已经成为食品安全快速 [9] [1] 筛选检测的主要方法之一 Pou 等和 Collins 等分别建立沙丁胺醇放射免疫分析, 其检测限可以达到.1ng/mL 和.4ng/g, 但由于放射免疫分析的特殊性, 使这一技术无法得到普遍的应用尽管已有沙丁胺醇 ELISA 的研 [11-13] 究报道, 但都为间接竞争法, 至今国内外尚未见采用酶标抗体模式的沙丁胺醇的直接竞争 ELISA(dcELISA) 报道本实验通过研究酶标抗体克分子比, 优化 dcelisa 检测条件, 建立一种酶标抗体直接竞争的沙丁胺醇 ELISA 检测方法 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器硫酸沙丁胺醇 ( 纯度 99.5%) 华南农业大学兽药厂 ; 克伦特罗 ( 纯度 99.5%) 莱克多巴胺 ( 纯度 99.5%) 美国 Sigma 公司 ; 异丙肾上腺素 ( 纯度 99%) 溴布特罗 ( 纯度 99%) 去甲肾上腺素 ( 纯度 99%) 广州伟伯化工有限公司 ; 沙丁胺醇单克隆抗体本实验室制备 ; 辣根过氧化物酶 (HRP) 武汉博士德生物工程有限公司 ; 高碘酸钠 ( 分析纯 ) 硼氢化钠乙二醇广州化学试剂厂 ; 硫酸铵广州台山粤桥化工厂 ;Tween-2( 进口分装 ) 广州市医药公司 ; 四甲基联苯胺 (TMB) 国药集团化学试剂公司 ; 其他均为国产分析纯 96 孔可拆酶标板厦门运鹏科技有限公司 ; Multiskan MK3 酶标仪 Wellwash MK2 洗板机美国 Thermo 公司方法.1 酶标记抗体 [14] 采用高碘酸钠法, 用 HRP 辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体.2 dcelisa 操作步骤包被液 (CBS) 稀释液 (PBS) 洗涤液 (PBST) 封闭液 TMB 底物溶液终止液均按文献 [14] 方法配制用包被液稀释 SAL-OVA 到质量浓度为 1μg/mL, 加到酶标板孔中,1μL/ 孔,4 冰箱过夜 ; 甩干孔中液体, 用蒸馏水洗涤 4 次, 甩干每孔加入 3g/1mL 脱脂奶粉 ( 用包被液溶解 )2μL,37 温箱中孵育 3h, 甩干孔中液体用蒸馏水洗涤 1 次, 置 37 烘箱中 2h 备用 ; 称量皿称取 SAL 2mg, 用 1mL 抗体稀释液溶解, 连续 1 倍稀释成 ng/ml; 抗体稀释液稀释 256 倍 ; 每孔加入 SAL 标准液和 HRP- McAb 各 5μL, 轻摇混合,37 温箱中孵育 1h, 蒸馏水洗涤 4 次, 甩干, 加显色液,37 温箱中显色 15min, 加入终止液, 测 A 45nm 值.3 数据分析采用 Origin 7.5 软件的四参数对数函数进行曲线拟合, 见式 (1) A - D y= (1) [1+(x/C) B ] + D 式中 :y 为 45nm 波长处的吸光度 ;x 为沙丁胺醇的质量浓度 ;A 为曲线渐进线最大值, 沙丁胺醇浓度等于时的吸光度, 即 A max;b 为曲线回折点处的斜率, 即 5% 的在曲线上对应点的斜率 ;C 为曲线回折点对应的 x 值, 等于 5% 的所对应的沙丁胺醇质量浓度, 即 IC5;D 为曲线渐进线最小值, 等于背景值绘制出竞争性 ELISA 检测曲线后, 通过比较和 IC5 以及 /IC5 评价曲线性能 [15-16].4 理化因素影响采用棋盘滴定法确定出不同包被抗原质量浓度下的酶标抗体工作质量浓度, 然后比较不同包被抗原质量浓度下的 dcelisa 曲线参数, 筛选出最适工作质量浓度通过单因素试验, 考察稀释液中不同含量的 Tween-2 NaCl 溶液有机溶剂甲醇溶液以及 ph 值对 dcelisa 检测性能的影响.5 沙丁胺醇 dcelisa 特异性分析以交叉反应率 (CR) 评价方法的特异性沙丁胺醇的 IC5 CR/%= 1 (2) 各结构类似物的 IC5 2 结果与分析 2.1 酶标抗体筛选表 1 酶标抗体克分子比对滴度的影响 Table 1 Effect of molar ratio of enzyme-labeled antibody on its titer 酶标抗体结合物中酶结合物中的 IgG 量 /(mg/ml) 酶量 /(mg/ml) 克分子比滴度

3 272 21, Vol. 31, No. 2 食品科学分析检测一般酶标抗体克分子比在 1.5~2. 活性最好, 过低过高都有可能影响酶活或抗体结合亲和力本实验制备 3 种不同结合比的酶标抗体, 分别与包被抗原反应, 活性鉴定 ( 表 1) 发现, 克分子比为 2.1 的偶联物的滴度最高, 可达 3, 明显高于克分子比 1.4 和 2.7 的酶标抗体, 因此, 最终采用抗体克分子比为 2.1 的酶标记抗体进行随后实验文献报道克分子比在 1.5~2. 时效果最好, 本研究结果与其报道基本一致 2.2 包被抗原质量浓度的筛选图 1 包被抗原质量浓度对 A max IC5 和 A max/ic5 的影响 Fig.1 Effect of coating concentration on, IC5 and /IC5 包被抗原质量浓度会影响标准曲线的灵敏度, 包被的质量浓度越小, 与游离抗原的竞争力就会减弱, 这样会使曲线的灵敏度增加, 但是包被质量浓度太小, 就会影响 A max 和曲线的稳定性由图 1 可知,A max 和 IC5 在包被抗原质量浓度.5~2μg/mL 呈现逐渐增大的趋势,2 μ g/ml 达最大, 以后又明显降低 A max/ic5 在 1.μg/mL 达最大值由于 1.μg/mL 包被抗原质量浓度时 IC5 值较小, 且 A max/ic5 最大, 表明该包被抗原质量浓度下灵敏度最高因此, 在以后的实验中选择包被抗原质量浓度 1μg/mL 2.3 Tween-2 体积分数对反应的影响 IC5 /IC IC5 /IC Tween-2 体积分数 /% IC5/(ng/mL) 图 2 Tween-2 体积分数对 IC5 和 /IC5 的影响 Fig.2 Effect of Tween-2 amount on, IC5 and /IC5 Tween-2 是免疫分析中一种常用的表面活性剂, 可以减少非特异性吸附, 且可以保护抗体减少失活, 尤其是可以提高酶标抗体的滴度本研究在稀释缓冲液包被质量浓度 /(μg/ml) IC5/(ng/mL) /IC5 /IC5 中添加不同体积的 Tween-2, 分析其对 SAL-dcELISA 的影响 ( 图 2) 稀释液不含 Tween-2 时抗体的效价很低, 灵敏度很低 Tween-2 体积分数为.25%~.5% 时, IC5 从 2.ng/mL 降低到 1.1ng/mL, 从 1.1 升高到, /IC5 从 1.1 大幅度增加到 2., 即 Tween-2 体积分数为.5% 时达到最大值, 说明此时曲线的灵敏度最高 Tween-2 体积分数.1% 以上时, 大致呈上升趋势, 趋于平稳 IC5 变化不大,A max/ic5 开始大幅度降低, 即灵敏度开始降低综合比较后 Tween-2 体积分数为.5% 时, 灵敏度最高, 因此确定稀释液中 Tween-2 体积分数为.5% 时为最佳 2.4 NaCl 浓度对 dcelisa 的影响图 3 NaCl 浓度对 IC5 和 /IC5 的影响 Fig.3 Effect of NaCl concentration on, IC5 and /IC5 溶液的离子浓度通常会影响抗体和酶的活性, 所以会影响抗原抗体相互作用为考察离子浓度对沙丁胺醇 dcelisa 的影响, 本研究选用 ph7.4 的.1mol/L 的 PBS 配制含 mol/L NaCl 的反应体系进行反应, 结果如图 3 所示在.5~.15mol/L NaCl 浓度范围内, 随着 NaCl 浓度增大,A max 值迅速增大, 这说明在低离子浓度范围内, 增大离子浓度有利于抗原抗体结合反应 ; 在.15~1.5mol/L NaCl 浓度范围内, 和 IC5 随着 NaCl 浓度增大而呈现先降低又升高的趋势, 在 1.5mol/L 时达到最大 /IC5 在.5mol/L 时达到最大, 此时灵敏度最高, 故在以后反应体系中使用.5mol/L NaCl 2.5 甲醇体积分数对 dcelisa 的影响 1..8 IC5 2 /IC NaCl 浓度 /(mol/l) IC5 12 /IC 甲醇体积分数 /% IC5/(ng/mL) 图 4 甲醇体积分数对 A max IC5 和 A max/ic5 的影响 Fig.4 Effect of methanol amount on, IC5 and /IC5 6 4 IC5/(ng/mL) /IC5 /IC5

4 分析检测食品科学 21, Vol. 31, No 甲醇经常作为一种促溶剂使用在 ELISA 中本研究考察反应体系中甲醇体积分数对沙丁胺醇 dcelisa 的影响 ( 图 4) A max 随着甲醇体积分数的增大逐渐降低, IC5 的整体表现为先降低又升高, 甲醇体积分数为 5% 时降到最低点, 此时 /IC5 在 5% 甲醇溶液时达到最大, 在 1.8~1.9 之间, 吸光度比较稳定, 灵敏度也较高, 故在以后反应体系中甲醇体积分数为 5% 2.6 最适 ph 值的确定 A45nm IC5 /IC ph 图 5 ph 值对 A max IC5 和 /IC5 的影响 Fig.5 Effect of ph on, IC5 and /IC5 图 6 沙丁胺醇标准曲线 Fig.6 Standard curve of salbutamol IC5/(ng/mL) SAL 质量浓度 /(ng/nl) ph 值主要影响抗体和酶的等电点, 从而影响抗原抗体的相互作用本研究发现 ( 图 5)A max 随着 ph 值增大出现减小的趋势, 对抗原抗体的结合影响较大 ph 值在 5.~6. 时 IC5 太大,A max/ic5 很小, 表明灵敏度较差 ph 值大于 7.4 时, 已经明显影响了抗体和酶的活性,A max 小于.7, 不适合 ELISA 检测, 综合考虑, ph7.4 时,IC5 较低,A max 达到 1.1, 灵敏度较好, 故确定反应最佳的 ph 值为标准曲线的绘制根据以上优化的条件建立标准曲线 ( 图 6), 该曲线 IC5 为 1.3ng/mL, 检测限 (9% 结合率时沙丁胺醇质量浓度 ) 为.49ng/mL, 检测范围 (2%~8% 结合率时的沙丁胺醇质量浓度 ) 为.23~76.3ng/mL, 批内变异系数 13.8%, 批间变异系数为 22.38% 2.8 dcelisa 的特异性 /IC5 交叉反应药物分子结构 IC5/(nmol/mL) 交叉反应率 /% 沙丁胺醇 HN.42 1 Cl H2N 克伦特罗 Cl N H Br 溴布特罗 H2N Br NH 莱克多巴胺 N H 异丙肾上腺素 NH 去甲肾上腺素 NH2 大于 1 在几种 β- 兴奋剂对 SAL 酶标记抗体的交叉反应曲线中, 发现 SAL 单克隆抗体与克伦特罗溴布特罗都有高的交叉反应 ( 表 2), 其中与克伦特罗交叉反应率为 %, 与溴布特罗交差反应率为 29.9%, 与其他结构类似物几乎没有明显交叉反应 3 讨论表 2 沙丁胺醇的交叉反应 Table 2 Cross-reactivity of the method 对于农兽药小分子的 ELISA 检测模式一般包括间接竞争 ELISA 和直接竞争 ELISA 两种模式间接竞争 ELISA 模式需要孵育 2 次, 洗板 2 次, 一般整个过程需要 9~ 12min, 操作时间偏长本实验室长期从事农兽药小分子的免疫快速检测研究, 已经成功建立多个对象的直接 [18-19] 竞争 ELISA 方法该方法只需孵育 1 次, 洗板一次, 相对于间接竞争 ELISA 的操作时间减少一半以上, 在实际应用中具有显著优势, 非常利于开发商业试剂盒 ELISA 反应条件如包被抗原质量浓度抗体稀释倍数离子浓度 ph 值对其灵敏度具有重要影响例如非水介质对免疫反应的影响一直是低水溶性化合物免 [18] 疫方法建立过程中的一个重要问题沙丁胺醇微溶于水, 较易溶于甲醇, 本实验重点研究样品稀释液对 ELISA 检测沙丁胺醇的影响, 结果表明 : 甲醇体积分数为 5% 时可以提高反应的灵敏度同时, 研究发现 PBS 中含.5mol/L NaCl 可以增强沙丁胺醇免疫分析灵敏度, 其主要原因可能是溶液的离子强度增加, 其疏水作用增加, 而疏水作用是抗原抗体相互反应的一种主要作用力此前, 已有关于沙丁胺醇抗体制备研究报道邱 [2] 阳生等所制备沙丁胺醇单抗对克伦特罗有 5% 的抑制

5 274 21, Vol. 31, No. 2 食品科学分析检测 [21] 率, 史利军等得到的单抗对克伦特罗交叉反应率达 1% 本实验制备的沙丁胺醇单抗对克伦特罗交叉反应率为 %, 这种反应性能尚未在其他沙丁胺醇反应模式中报道过沙丁胺醇和克伦特罗结构上都具有叔丁氨基团, 这个共有结构叔丁氨基可能是与抗体结合的特异性表位本研究同时发现, 沙丁胺醇单克隆抗体与莱克多巴胺和异丙肾上腺素几乎没有交叉反应, 尽管莱克多巴胺和异丙肾上腺素的异丙胺基与沙丁胺醇的叔丁氨基很相似, 这表明抗体的识别能力非常精细本实验所建立的酶标抗体直接竞争模式适合同时检测沙丁胺醇和克伦特罗, 用于两种药物的同时筛查参考文献 : [1] 吴日钧. 关于瘦肉精检测的几点思考 [J]. 猪业科学, 29, 26(6): [2] 庞苏纳, 于芳. 瘦肉精及其危害简介 [J]. 新疆畜牧业, 29(3): 17. [3] 肖新李, 黄飞平, 臧清华. 盐酸克伦特罗引起食物中毒 225 例 [J]. 广东医学, 22, 23(1): 14. [4] 刘宣兵, 庞玉芳, 侯玉泽, 等. 沙丁胺醇的毒副作用及其残留检测 [J]. 上海畜牧兽医通讯, 28(4): [5] GABIOLA C, CALONGE M A G, PORTILLO M P, et al. Validation of a method for the determination of salbutamol in animal urine by gas chromatography-mass spectrometry and its application to treated lamb samples[j]. Microcolumn Separations, 1996, 8: [6] COUPER B R, FIONA J, DRUMMER A D. Gas chromatogra mphicmass spectrometric determination of β2-agonists in post mortem blood: application in forensic medicine[j]. Chromatography Biomedical Scienceand Application, 1996, 685(2): [7] ZHANG Yantu, ZHANG Zhujun, SUN Yonghua, et al. Development of analytical method for the determination of β-agonist residues in animal tissues by high-performance liquid chromatography with on-line electrogenerated [Cu(HIO6)2] 5- -luminol chemiluminescence detection[j]. Agriculture and Food Chemistry, 27, 55(13): [8] SOMSAK S, PROESPICHAYA K. Rapid analysis of clenbuterol, salbutamol, procaterol,and fenoterol in pharmaceuticals and human urine by capillary electrophoresis[j]. Talanta, 28, 76(5): [9] POU K, ONG H, ADAM A, et al. Combined immunoextraction approach coupled to a chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of trace levels of salbutamol and clenbuterol in tissue samples[j]. Analyst, 1994, 119: [1] COLLINS S, O'KEEFFE M, SMYTH M R, et al. Mutli-residue analysis for beta-agonists in urine and liver sample using missed phase cloumns with deterrnination by radioimmunoassay[j]. Analysy, 1994, 119(1): [11] LEI Yichih, TSAI Yifen, TAI Yungte, et al. Development and fast screening of salbutamol residues in swine serum by an enzyme-linked immunosorbent assay in Taiwan[J]. Food Chem, 28, 56(14): [12] SHEU Shiyuan, LEI Yichih, TAI Yungte, et al. Screening of salbutamol residues in swine meat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan[J]. Analytica Chimica Acta, 29, 654(2): [13] MALUCELLI A, ELLENDORFF F, MEYER H H. Tissue distribution and residues of clenbuterol, salbutamol, and terbutaline in tissues of treated broiler chickens[j]. Animal Science, 1994, 72(6): [14] 朱立平, 陈学清. 免疫学常用实验方法 [M]. 北京 : 人民军医出版社, 2: [15] GUO Yongen, CHEN Jiahua, WANG Nengdong, et al. Preparation and application of polyclonal antibody to butachlor[j]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, 22, 38(4): [16] MERCADER J V, MONTOYA A. A monoclonal antibody-based ELISA for the analysis of azinphos-methyl infruit juices[j]. J Agric Food Chem, 1997, 47(1): 杨利国, 胡少昶, 魏平华, 等. 酶免疫测定技术 [M]. 南京 : 南京大学出版社, 1998: [18] 雷红涛, 冯伟雯, 沈玉栋, 等. 除草剂丁草胺直接竞争 ELISA 检测方法研究 [J]. 农业环境科学学报, 26, 25(4): [19] 董雪, 钟青萍, 黄安诚, 等. 河豚毒素直接竞争 ELISA 检测方法的研究 [J]. 现代食品科技, 29(8): [2] 邱阳生, 杨根海, 何方洋. 沙丁胺醇单克隆抗体的制备及鉴定 [J]. 中国兽医科学, 22, 32(1): [21] 史利军, 杨正涛, 王艳, 等. 沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立 [J]. 中国兽医杂志, 26, 42(6):

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<453A5CCAB3C6B7BFC6D1A73131C4EA3134C6DA5C3134C6DA5C3032B7D6CEF6> 227 ELISA 刘沙洲 1,2, 桑小雪 1, 欧阳华学 3, 雷绍荣 3, 白林含 1, * (1. 四川大学生命科学学院, 四川成都 610065;2. 成都市食品药品检测中心, 四川成都 610045; 3. 四川省农业科学院分析测试中心, 四川成都 610066) 目的 : 比较

分 析 检 测 食 品 科 学 21, Vol. 31, No 近 年 来, 瘦 肉 精 克 伦 特 罗 常 被 发 现 非 法 添 加 在 动 物 饲 料 中 以 增 加 饲 料 报 酬 率, 导 致 严 重 的 瘦 肉 精 中 [1-3] 毒 事 件 时 有 发 生, 政 府 监

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