实验 SPE 萃取 : 在空白的尿液样品中加入不同浓度的被分析药物 ( ppb) 和内标物质 (d5- 安定 d3- 多虑平各 50ng/ ml) 尿液 (300μL) 使用 PerkinElmer 的 HLB 固相萃取柱 (30 mg/1 ml 滤芯, 30μm, 产品型号 N9306

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1 应用文章 Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry 作者 Sharanya Reddy Blas Cerda PerkinElmer, Inc. Shelton, CT USA 利用 UHPLC 与精确质量的 AxION 2 TOF 质谱仪联用分析尿液中的滥用药物 简介常规采用免疫技术 (EMIT) 对滥用药物进行筛查, 使用 GC/ MS 或者 LC/MS/MS 检测技术进行确证 我们提出了一种替代的分析方法, 利用时间飞行 (TOF) 质谱仪定量和确认这些药物 PerkinElmer AxION 2 TOF MS 配有 ADC 检测器技术, 提供了较宽的动态线性范围, 非常适合于目标药物的定量分析 与全扫描模式不是很灵敏的四级杆仪器相比,TOF 可用于未知化合物的定性筛查 AxION 2 TOF MS 提供的精确质量和同位素比例的信息, 与保留时间一起, 用于鉴定和确认已知及未知目标化合物的存在, 且无需碎片的信息 AxION 2 TOF MS 配 有双探头的 Ultraspray 2 ESI 离子源, 允许同时注入已知质荷比的校准混合物和 LC 洗脱组分, 因此, 通过连续的锁定质量修正, 使整个分析过程的质量精度保持在低 ppm 的水平

2 实验 SPE 萃取 : 在空白的尿液样品中加入不同浓度的被分析药物 ( ppb) 和内标物质 (d5- 安定 d3- 多虑平各 50ng/ ml) 尿液 (300μL) 使用 PerkinElmer 的 HLB 固相萃取柱 (30 mg/1 ml 滤芯, 30μm, 产品型号 N ) 进行萃取 使用甲醇 (1mL), 水 (1mL) 依次淋洗萃取柱 然后加入尿液样品, 以 1mL/min 速度的流过萃取柱, 萃取柱使用 5% 的甲醇水溶液 (1mL) 冲洗, 在真空条件下抽干约 1min, 然后使用甲醇 (1mL) 淋洗 淋洗液干燥后, 再使用 300μL 的水定溶 LC 条件泵 : PerkinElmer Flexar FX-10 流速 : 0.4mL/min 流动相 A: 0.1% 甲酸水溶液流动相 B: 0.1% 甲酸的乙腈溶液梯度条件 : 95%A/5%B 保持 1min 随后的 5min 变为 95%A/5%B( 线性梯度 ) 最后的 1.5min, 维持 10%A/90%B 进样体积 : 4μL 部分环注射模式色谱柱 : PerkinElmer Brownlee SPP C-18,2X 50mm,2.7 μm, 25 C MS 条件质谱仪 : PerkinElmer AxION 2 TOF MS 离子源 : PerkinElmer Ultraspray 2 ( 双喷 ESI 源 ) 离子化模式 : 阳离子质谱扫描速率 : 3 spectra/sec 毛细管出口电压 : 100V 捕集脉冲模式 : m/z (D7:68, D8:91) 内部校准使用 m/z 和 作为锁定质量离子 结果在 7min 之内完成 21 种不同类别的滥用药物分离 分析, 这些药物包括阿片类 苯二氮平类药物 安非他命和大麻 ( 图 1) 几乎所有通过 SPE 萃取柱的被分析药物 ( 尿液中的加标浓度为 20ppb) 回收率都 80% 利用 AxION 2 TOF MS 的专利捕集脉冲技术, 我们在分析多数药物 (1-5ppb, 表 1) 时均获得了良好的检测限 (LODs, 基于 S/N 3) 在捕集脉冲的操作模式,TOF 的占空率 ( 即离子利用率 ) 增加, 导致信号显著改善 AxION 2 TOF MS 测定的 LODs 比 EMIT 方法分析大多数滥用药物的极限水平要低 倍, 由此证明该仪器具有优越的灵敏度 图 1 7min 分析不同类别的 21 种滥用药物 Table 1. LODs of some representative drugs of abuse in 表 1 人体尿液中一些典型的滥用药物的检测限 human urine. Drug LOD in urine (ng/ml or ppb) Methamphetamine 1 Amphetamine 5 Diazepam 1 Haloperidol 4 Alpralozam 1 Fluorazepam 5 Codeine 5 Morphine 5 Doxepine 1 Haloperidol 4 Cocaine 1 Benzoylecognine 1 Methadone 1 3, 4 MDA 1 MDEA 1 Oxycodone 1 代表性药物 - 氧可酮的线性响应如图 2 所示 线性相关系数 r 2 = 0.999,5 个数量级的动态范围, 从而进一步证明 AxION 2 TOF MS 的定量分析能力 图 2 浓度范围 ppb 氧可酮的回归曲线 (d3 多虑平作为内标物质 ) 2

3 Table 表 2 典型的滥用药物的理论质量 2. Shows theoretical mass,, observed 采集质量和质量误差 mass and mass error of representative drugs of abuse. Monoisotopic Mass Analyte Formula [M+H] + Observed Mass Mass Error (ppm) Methamphetamine C 10H 15N Amidarone C 25H 29I 2NO Amphetamine C 19H 13N Codeine C 18H 21NO Diazepam C 16H 13ClN 2O Doxepine C 19H 21NO Haloperidol C 21H 23ClFNO Morphine C 17H 19NO Flurazepam C 21H 23ClFN 3O Alprolazam C 17H 13ClN Cocaine C 17H 21NO EDDP perchlorate C 20H 24ClNO (fragment, [M-O 4Cl] + ) Benzoylecognine C 16H 19NO Methadone C 21H 27NO ,4 MDA C 10H 13NO MDEA C 12H 17NO MDMA C 11H 15NO Phenylpropylamine C 9H 13NO Oxycodone C 18H 21NO TOF-MS 的主要优势是提供准确的质量信息, 从而确认给定分析物的存在 表 2 罗列了 AxION 2 TOF MS 检测到的滥用药物的准确质量与理论质量 准确质量, 同位素比例和保留时间被用作确认已知分析物的存在 通过提取较窄离子质量的窗口, 尿液中分析物的检测限得到明显提升, 可低至 ppb 级, 如图 3(a-c) 安定的分析谱图所示 在较窄质量的窗口, 噪声显著减小,S/N 全面增加, 因而对于已知化合物可提供更有信心的分析 图 3 (a-c) 尿液中 1ppb 安定提取较窄质量窗口对 S/N 作用 蓝色表示控制尿液样品, 黑色表示加标尿液 3

4 除政府限制的已知化合物的检测项目外, 法医毒理学者经常面临的挑战是寻找样品中的未知化合物 由于 TOF 采集的是全扫描数据,TOF MS 技术使得用户可以再次利用已经采集的数据, 确定那些未知化合物的存在 例如, 我们分析了一个保留时间约为 2.5min 的未知化合物 ( 图 4) 利用 AxION EC ID 软件提供的准确质量和同位素比信息来鉴定该未知化合物 软件通过数据库检索, 获得了一个 给定元素组成的可能目标化合物的排序表, 该化合物被确定为咖啡因, 是一种最常规的兴奋剂 使用 AxION EC ID 软件进行类似的分析, 认为保留时间 1 和 1.8min 的两个未知化合物的最可能是可可碱 / 茶碱 / 副黄嘌呤, 这些化合物都是咖啡因代谢的异构体产物 通过与标准物质保留时间的匹配进一步确证咖啡因及其代谢产物在尿液中存在 图 4 插图 a: 利用 AxION EC ID 软件分析 AxION 2 TOF MS 采集的数据, 鉴定未知目标化合物是咖啡因及其代谢产物 ; 插图 b: 使用 AxION EC ID 软件,m/z 匹配第一的元素组成是 C 7 H 8 N 4 O 2 ; 插图 c: 为降低 AIDS 的排序,C 7 H 8 N 4 O 2 最可能的候选物是茶碱, 其次是副黄嘌呤, 两者都是咖啡因的代谢产物 4

5 本篇尿液中滥用药物分析的应用文献表明 :AxION 2 TOF MS 既可用于尿液的已知化合物的定量分析, 又可用于筛查尿液中存在的其它未知组分 TOF 分析几类滥用药物的检测限比对应的非特异性免疫的分析方法低 倍 与三重四级杆的仪器相比,AxION 2 TOF MS 除了具有宽的动态定量范围外, 也可提供全扫描的信息, 这可用于非目标化合物的筛查 本应用文献建立了 21 种滥用药物的分析方法, 然而, 该方法在仪器提供的易于定量和报告的软件包的帮助下, 可容易的被应用到更广泛的滥用药物筛查中 参考文献 1. Moeller, K.E., Lee, K.C., Kissack, J.C., Mayo Clin. Proc. 83 (2008) Thevis, M., Schanzer, W., Mass Spectrom. Rev. 26 (2007) Gallardo E., Barroso, M., Queiroz, J.A., Drug Test Anal. 1 (2009) 109. PerkinElmer, Inc. 珀金埃尔默仪器 ( 上海 ) 有限公司地址 : 上海张江高科技园区张衡路 1670 号邮编 : 电话 : 传真 : 要获取全球办事处的完整列表, 请访问 版权所有 2012, PerkinElmer, Inc. 保留所有权利 PerkinElmer 是 PerkinElmer, Inc. 的注册商标 其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产 _01_CN

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