前言质谱 (MS) 是一种高灵敏度分析技术, 常用于针对各种小分子的代谢组学研究哺乳动物细胞代谢组学一跃成为在多个研究领域中具备应用潜力的新兴工具, 研究细胞培养基中细胞消耗与分泌的多种代谢物变得越来越重要, 分析仍然面临一些挑战, 包括阴离子代谢物的保留样品基质效应 5, 以及螯合有机酸和磷

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镜潞缪
5 years ago
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1 应用简报代谢组学使用 HILIC LC/MS 对哺乳动物细胞培养基进行监测作者 Jordy J. Hsiao Genevieve van-de-bittner Te-Wei Chu Oscar G. Potter 和 Hongfeng Yin 安捷伦科技有限公司摘要将 Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色谱柱与 Agilent 55 Q-TOF LC/MS 结合使用, 对六天内采集的哺乳动物细胞培养基中的养分吸收和分泌废物进行监测 HILIC-Z 色谱柱可保持良好的峰形与保留时间重现性, 能适应高盐样品 ( 如细胞培养基 ) 该方法通过优化流动相梯度和仪器参数, 可用于在负离子模式下的单次分析运行中对生长培养基的养分 ( 即葡萄糖和氨基酸 ) 与代谢废物 ( 即乳酸及 TCA 循环相关的其他有机酸 ) 进行监测

2 前言质谱 (MS) 是一种高灵敏度分析技术, 常用于针对各种小分子的代谢组学研究哺乳动物细胞代谢组学一跃成为在多个研究领域中具备应用潜力的新兴工具, 研究细胞培养基中细胞消耗与分泌的多种代谢物变得越来越重要, 分析仍然面临一些挑战, 包括阴离子代谢物的保留样品基质效应 5, 以及螯合有机酸和磷酸化合物的分析性能为应对这些挑战, 开发了一种稳定且可重现的亲水相互作用色谱 (HILIC) LC/MS 方法, 方法中采用 InfinityLab 去活剂添加剂作为流动相改性剂, 以增强金属螯合有机酸和磷酸化分析物的峰形和检测信号作为色谱优化与 HILIC 色谱柱测试的一个步骤, 对样品基质中盐浓度的影响进行了研究研究中建立了一种分析细胞生长培养基中代谢物消耗和分泌的方法实验部分方法耐盐性研究 : 为进行 HILIC LC/MS 方法开发, 选择了一套涵盖磷酸化分析物与磷酸糖异构体的代谢物标准品使用 Milli-Q 纯化水配制 5 mg/ml 的分析物储备液然后用 8: 的乙腈 (ACN)/ 水将储备液稀释为 ng/µl (ppm) 的样品在实验中, 配制一份高盐储备液 ( mol/l 尿素和 mol/l 氯化钠 (NaCl) 水溶液 ) 作为盐加标样将高盐溶液按 % (8 mmol/l 尿素 mmol/l NaCl) 与 %( mmol/l 尿素 8 mmol/l NaCl) 加标至代谢物标准品 ( ng) 中因为盐不溶于样品基质 (8% ACN), 因此没有尝试采用更高的盐浓度 (> %) 细胞培养研究 : 在添加 % 胎牛血清的 RPMI 培养基中, 培养 K5 白血病细胞立即 ( 第天 ) 小时 ( 第天 ) 8 小时 ( 第天 ) 7 小时 ( 第天 ) 或天 ( 第天 ) 后采集部分细胞和培养基将样品在 5 g 条件下离心 5 分钟, 使细胞形成团块将生长培养基 ( µl) 转移至另一个离心管, 与 µl 5% ACN 混合, 再在 g 条件下离心 5 分钟然后, 对 µl 上清液进行 HILIC LC/MS 分析使用 Agilent MassHunter 定量分析软件分析结果分析物分离 : 在 InfinityLab Poroshell HILIC-Z,. mm 5 mm,.7 µm, PEEK 内衬 ( 部件号 ) 色谱柱上进行色谱分离首先配制一份倍流动相缓冲储备液 ( mmol/l 乙酸铵, ph 9.) 水溶液, 然后用水 (A 溶液 ) 或 ACN(B 溶液 ) 配制倍溶剂在水溶液和有机流动相中添加 InfinityLab 去活剂添加剂 ( 部件号 59-5), 确保浓度在梯度洗脱过程中保持不变仪器使用 Agilent 9 Infinity 液相色谱仪与配备安捷伦喷射流离子源的 Agilent 55 Q-TOF 的联用系统进行 LC/MS 分析液相色谱仪包括 : 带清洗密封垫的 Agilent 9 Infinity 二元泵 (GA) 带柱温箱 (GB) 的 Agilent 9 Infinity 自动进样器 (GA) 安捷伦柱温箱 (GC) 通过连续注入参比质量溶液, 实现动态质量轴校准表和表汇总了优化的 LC 和 MS 条件使用 Agilent MassHunter 软件套件进行数据采集与分析

3 表. 最佳 LC 参数 9 Infinity 液相色谱系统色谱柱 InfinityLab Poroshell HILIC-Z,. 5 mm,.7 µm( 部件号 ) A) mmol/l 乙酸铵水溶液,pH 9, 含 5 µm 去活剂添加剂 ( 部件号 59-5) 流动相 B) mmol/l 乙酸铵水 /ACN :9 (v:v) 溶液,pH 9, 含 5 µm 去活剂添加剂 ( 部件号 59-5) 流速.5 ml/min 分钟,B 为 95% 分钟,B 由 95% 降至 5% 梯度分钟,B 由 5% 升至 95% 分钟,B 为 95% 柱温 5 C 进样量 µl 自动进样器温度 C 结果与讨论利用 InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色谱柱宽范围的 ph 稳定性与高分离度, 开发了一种简单而稳定的 HILIC LC/MS 方法在本研究中,pH 9. 的流动相在色谱分离中获得了最佳整总体结果此外, 添加 InfinityLab 去活剂添加剂明显改善了鳌合有机酸与磷酸化合物的峰形, 同时增强了信号强度在 DMEM 与 RPMI 这两种最常用的培养基中, 含有的高浓度无机盐包括 (NaCl, 约 mmol/l) 氯化钾 (KCl, 约 5 mmol/l) 和硝酸钙 (Ca(NO ), 约. mmol/l) 这些无机盐可保持培养基渗透平衡, 并有助于调节培养细胞的膜电位为确定盐对保留时间重现性与代谢物峰形的影响, 我们使用 HILIC LC/MS 方法对浓度增加的尿素和 NaCl 加标样品进行分析 ( 图 ) 结果表明,HILIC 色谱柱保持了保留时间重现性, 同时高盐样品中的目标核苷酸 ( 如 AMP ADP ATP 和 GTP) 与磷酸糖异构体 ( 如葡萄糖 -- 磷酸盐和葡萄糖 -- 磷酸盐 ) 检测到极小的离子抑制 ( 图 ) 表. 最佳 MS 参数 55 Q-TOF LC/MS 电离模式安捷伦喷射流电离极性负干燥气温度 C 干燥气 L/min 雾化器压力 psi 鞘气温度 C 鞘气流速 L/min 毛细管电压 V 喷嘴电压 V 碎裂电压 5 V 锥孔电压 5 V 八极杆 RF 电压 75 V 采集范围 m/z 5 MS 采集速率质谱图 / 秒参比质量 m/z AMP. ADP 未加盐 % 盐 (8 mmol/l 尿素, nmol/l 氯化钠 ) % 盐 ( mmol/l 尿素,8 mmol/l 氯化钠 ) 5. 5 ATP.5. GTP 葡萄糖 -- 磷酸 / 5 葡萄糖 -- 磷酸图. 使用 HILIC LC/MS 得到的盐样品中分析物的保留时间重现性

4 接下来, 我们设计了一项实验, 用于监测细胞培养基在六天时间内的养分消耗与代谢物分泌 ( 图 ) 在生长培养基中, 乳酸作为代谢废物, 随时间推移而逐渐积累 ( 图, 第列 ) 此外, 在监测过程中, 有关 TCA 循环的其他有机酸 ( 即苹果酸 α- 酮戊二酸 (α-kg) 谷氨酸和柠檬酸) 在生长培养基中分泌并逐渐累积 ( 图 ) 相比之下, 细胞在代谢过程中消耗了糖, 因此葡萄糖浓度随时间推移逐渐降低 ( 图, 第列 ), 直至完全耗尽 ( 图, 第列, 第天 ) 氨基酸浓度也随时间推移而逐渐降低, 这是因为细胞消耗了生长培养基中的养分 ( 图 ) 结果表明, 在单次 HILIC LC/MS 运行中, 可对哺乳动物细胞培养基中包括有机酸与氨基酸在内的各种代谢物进行分析和监测数据分析哺乳动物细胞培养添加 µl 5% 乙腈分析 µl 在第天收获 µl HILIC-LC/MS 分析图. 用于监测哺乳动物细胞培养基中代谢物的时序研究的实验设计乳酸 α-d- 葡萄糖 / β-d- 葡萄糖苹果酸 α-kg 谷氨酸柠檬酸 7 ESI EIC(89.) ESI EIC(79.5) ESI EIC(.) ESI EIC(5.) ESI EIC(.) 5 ESI EIC(9.9) 第天 7 5 第天 7 5 第天 7 5 第天 7 5 第天图. 对生长培养基中累积的细胞代谢废物分泌的追踪 Counts

5 丝氨酸缬氨酸苏氨酸亮氨酸 / 异亮氨酸 L- 谷氨酰胺赖氨酸 5 ESI EIC(.5) 5 ESI EIC(.77) 5 ESI EIC(8.5) ESI EIC(.87) ESI EIC(5.) ESI EIC(5.98). 第天第天第天第天第天甲硫氨酸组氨酸苯丙氨酸精氨酸酪氨酸色氨酸 5 ESI EIC(8.) 5 ESI EIC(5.) 5 ESI EIC(.7) ESI EIC(7.) 5 ESI EIC(8.) ESI EIC(.8).5 第天第天第天第天第天图. 对细胞培养基中氨基酸养分消耗的监测

6 结论在进行哺乳动物细胞培养基中各种代谢物的分析时, 基于 HILIC 的色谱方法与 55 Q-TOF LC/MS 联用, 提供了卓越的分析性能带 PEEK 内衬硬件的 InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色谱柱可为 8 A 葡萄糖柠檬酸苹果酸谷氨酸乳酸 α-kg 高盐样品提供可靠的保留时间重现性与灵敏度 PEEK 内衬 HILIC-Z 色谱柱与 9 变化 % Infinity 液相色谱系统和 55 Q-TOF 系统联用, 具有卓越性能, 是代谢组学分析的理想平台总之, 这些特征能够在单一方法中对阴离子和疏水性更强的产物进行检测与分离, 并可用于监测生物制造过程天数变化 % 8 B 丝氨酸异亮氨酸组氨酸色氨酸缬氨酸 L- 谷氨酰胺苯丙氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸亮氨酸甲硫氨酸酪氨酸天数图 5. 对哺乳动物细胞培养基中的养分消耗与代谢分泌物的定量分析

7 参考文献. Wishart, D.S. Emerging applications of metabolomics in drug discovery and precision medicine. Nat. Rev. Drug Discov., 5(7), 7-8. Silva, L. P.; et al. Exometabolomics and MSI: deconstructing how cells interact to transform their small molecule environment. Curr. Opin. Biotechnol. 5,, 9-. Garcia-Manteiga J. M.; et al. Metabolomics of B to plasma cell differentiation. J. Proteome Res., (9), 5-7. Zhang, Z.; et al. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Anal. Chem., 8(), Panuwet, P.; et al. Biological Matrix Effects in Quantitative Tandem Mass Spectrometry-Based Analytical Methods: Advancing Biomonitoring. Crit. Rev. Anal. Chem., (), 9-5. Pesek, J. J.; et al. Improvement of peak shape in aqueous normal phase analysis of anionic metabolites. J. Sep. Sci., (),

8 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : ,-8-78( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_8@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用不可用于诊断目的本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,8 8 年月 7 日, 中国出版 599-ZHCN

前言多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中之前的研究中发现 1, 使用配备低 ph 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸, 能够获得出色的分离度与灵敏度本应用简报对这些条件进一步优化, 以对植物中的氨

前言多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中之前的研究中发现 1, 使用配备低 ph 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸, 能够获得出色的分离度与灵敏度本应用简报对这些条件进一步优化, 以对植物中的氨应用简报食品检测代谢组学农药化学环境使用 LC/MS 检测通过亲水相互作用色谱 (HILIC) 对植物基质中的未衍生化氨基酸进行定量分析作者 Yuxiong Huang Weiwei Li 和 Arturo Keller 美国加州大学圣塔芭芭拉分校 Tarun Anumol 和 Adam Bivens 安捷伦科技公司摘要本应用简报介绍了一种使用三重四极杆液质联用系统定量分析多种未衍生化氨基酸的方法