前言在药物开发的每个阶段均需深入分析治疗性蛋白的理化性质, 以确保药物的安全性及有效性通常采用一些基于液相色谱的试验对蛋白药物进行鉴定并确定其完整性, 例如肽图分析,SEC 及 IEX P128 是一种抗葡萄球菌蛋白, 名义分子量为 28 kda 它在大肠杆菌中重组表达本应用简报证实了 Agi

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采用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统通过肽谱分析 SEC 和 IEX 对治疗性蛋白质进行理化表征应用简报生物制药作者 Srividya Kailasam Jochen Strassner Faizy Ahmed 和 Martin Vollmer 安捷伦科技有限公司印度班加罗尔和德国瓦尔德布隆 45 4 35 3 25 2 15 5 2 4 6 8 1

1 采用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统通过肽谱分析 SEC 和 IEX 对治疗性蛋白质进行理化表征应用简报生物制药作者 Srividya Kailasam Jochen Strassner Faizy Ahmed 和 Martin Vollmer 安捷伦科技有限公司印度班加罗尔和德国瓦尔德布隆 P.M. Sundaram,Bharathi Sriram Gangagen 生物技术有限公司, 印度班加罗尔摘要本文利用新型 Agilent 126 生物惰性四元液相色谱系统开发了用于表征治疗性蛋白质 P128 的高灵敏快速液相色谱方法其中采用亚 2 µm 色谱柱技术得到最优肽图, 缩短了这种蛋白的分析时间利用新型安捷伦生物惰性高效液相色谱柱进行体积排阻色谱 (SEC) 及离子交换色谱 (IEX) 分析, 以检测蛋白制剂中可能存在的杂质或异型体具有生物惰性和耐腐蚀性的仪器与简单且重现性良好的方法相结合, 使得该解决方案适用于 QA/QC 实验室的常规应用

2 前言在药物开发的每个阶段均需深入分析治疗性蛋白的理化性质, 以确保药物的安全性及有效性通常采用一些基于液相色谱的试验对蛋白药物进行鉴定并确定其完整性, 例如肽图分析,SEC 及 IEX P128 是一种抗葡萄球菌蛋白, 名义分子量为 28 kda 它在大肠杆菌中重组表达本应用简报证实了 Agilent 126 生物惰性四元液相系统通过反相色谱法适用于分析胰酶消化 P128 所得的肽段, 并且可结合新型生物液相色谱柱及 IEX 和 SEC 法用于鉴定结构异构体实验部分完全生物惰性且生物兼容最高耐压达 6 bar 的 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统由以下几个模块组成 : Agilent 126 生物惰性四元液相色谱泵 (G5611A) Agilent 126 生物惰性高性能自动进样器 (G5667A) Agilent 12 系列柱温箱 (G133B) 包含生物惰性加热元件的 Agilent 126 柱温箱 (G1316C 选项 19) 配有 6 mm 最大光强高灵敏度流通池的 Agilent 126 DAD(G4212B 选项 33) 软件 :ChemStation B.4.2 在整个样品流路中没有任何金属组件, 因肽图分析此样品不会接触到金属表面溶剂输送管样品前处理路中没有任何不锈钢或铁质组件蛋白在含有尿素的条件下用 DTT 进行还化学品与试剂原, 然后采用碘乙酰胺进行烷基化样品 P128 由 Gangagen 生物技术有限公司提稀释并超滤后, 在 tris 缓冲液 (ph 7.6) 中供, 三羟甲基氨基甲烷尿素二硫苏糖消化过夜酶解时, 酶与底物的比例保持醇 (DTT) 及碘乙酰胺均购自 Sigma Aldrich 为 1:2 通过加入 1µL 的 1% 甲酸溶液公司, 三氟乙酸磷酸氢二钠磷酸氢钠和淬灭酶活性样品用真空浓缩干燥, 然后氯化钠均购自 Fluka 公司乙腈 (LiChrosolv) 采用 µl 的.25 M tris 缓冲液 (ph 7.6) 及 Millipore 水用于配制流动相进行复溶色谱条件色谱柱色谱柱 1: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱,3. mm x mm,1.8 µm ( 部件号 ) 色谱柱 2: AdvanceBio 肽图分析色谱柱,3. x 15 mm,2.7 µm ( 部件号 ) 液相色谱分析方法进样量 : 2 µl 流动相 A: 含.1% TFA 和 2% ACN 的水溶液流动相 B: 含.8% TFA 的 % ACN 流速 :.2 ml/.4 ml/ 分钟 %B 分钟 %B ml/.8 ml/ 分钟 %B 分钟 %B 紫外检测器 : 23 nm/4 nm, 参比 :4/6 nm ( 也在 214 nm 24 nm 26 nm 和 28 nm 波长下采集数据 ) 2

3 体积排阻色谱色谱柱色谱柱 1: Agilent Bio-SEC-3 色谱柱,3 µm,3 Å,7.8 mm 3 mm( 部件号 ) 色谱柱 2: Agilent Bio-SEC-5 色谱柱,5 µm,3 Å,7.8 mm 3 mm( 部件号 ) 色谱柱 3: 品牌 A SEC-5 色谱柱,5 µm,3 Å,7.8 mm 3 mm 液相色谱方法进样量 : 1 µl 流动相 A: 含有 15 mm 氯化钠的 15 mm 磷酸钠 (ph = 7.) 流速 : 1 ml/ UV 检测器 : 22 nm/4 nm 参比 : 关闭 ( 同时也采集 23 nm 和 28 nm 波长下的数据 ) 离子交换色谱样品经超滤脱盐, 萃取至 2 mm 磷酸钠 (ph = 6) 中色谱柱色谱柱 1: Agilent Bio MAb NP 5 色谱柱,PK, mm,5 µm( 部件号 ) 色谱柱 2: Agilent Bio MAb NP 1 色谱柱,PK, mm,1 µm( 部件号 ) 色谱柱 3: 品牌 B WCX-1 色谱柱,4. mm 25 mm,1 µm 液相色谱方法进样量 : 2 µl 流动相 A: 2 mm 磷酸钠 (ph = 6.) 流动相 B: 含 1. M 氯化钠的 2 mm 磷酸钠 (ph = 6.) 流速 : UV 检测器 :.5 ml/ 分钟 %B nm/4 nm, 参比 : 关闭 ( 同时也采集 22 nm 23 nm 24 nm 和 28 nm 波长下的数据 ) 3

4 结果和讨论肽图分析通常采用肽图分析确证蛋白种类首先通过蛋白酶消化治疗性蛋白质, 然后采用高分离度反相 HPLC 进行分析, 从而获得肽图分析的目标是色谱分离并检测所有蛋白片段, 以实现完整序列覆盖由于被分析样品很复杂, 其中含有数百种不同的化合物, 因此肽图分析需要很长的分析时间在药物开发的早期, 选用质谱作为鉴定所有肽段碎片的检测技术而在后期和 QA/QC 过程中, 确证肽段谱图最常使用 UV 检测生物惰性仪器对疏水性的肽段及蛋白尤其具有优势, 由于这些成分常常粘附在金属表面在本研究中, 我们展示了一个 26 kda 的重组表达新型生物制剂 (NBE) 的数据, 这是 Gangagen 生物技术公司正在开发的一种用于治疗人类疾病的抗菌素蛋白 P128 结合 Agilent Bio HPLC 色谱柱以及开发用于生物大分子分析的 Agilent 126 Inifinity 生物惰性四元液相色谱仪器, 可对这种蛋白进行肽图分析 SEC 及离子交换色谱分析图 1 展示了采用 Agilent 126 Inifinity 生物惰性四元液相色谱系统获得的肽图, 其中应用了两种反相色谱柱 : Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱,3. mm,1.8 µm AdvanceBio 肽图分析色谱柱, mm,2.7 µm 在该示例中,Agilent Eclipse Plus 色谱柱所得的分离度略好因此, 采用该色谱柱作进一步研究 A Agilent ZORBAX Eclipse Plus C B AdvanceBio 图 1. 利用两种色谱柱在.6 ml/ 流速下分别以相应梯度进行 P128 酶解物的分析, A)Agilent ORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱,3. mm mm,1.8 µm, B)AdvanceBio 肽图分析色谱柱,3. mm 15 mm,2.7 µm 基于 UV 的肽图分析常用于 QA/QC NBE 环境以检测重组蛋白药物在生产或加工过程中发生的所有序列异常 4

5 分析非常复杂的混合物时需要尽可能高的分离度, 因此通常导致分析时间过长, 例如肽图分析亚 2µm(STM) 填料技术与 UHPLC 仪器相结合, 可显著缩短分析时间, 同时保持高分离度 ( 图 2a - 2d) B.4 ml/ RT = ml/ 45 C RT = D.8 ml/ RT = 图 2a-2d. 利用 Agilent ORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱 (3. mm mm,1.8 µm), 在不同梯度和流速下进行 P128 酶解物的分析 5

6 分析的稳定性和重现性是表征治疗药物以验证所选 NBE 的特性和完整性的最重要因素, 同时也是满足监管部门需求的最重要因素我们利用 Agilent 126 Inifinity 生物惰性四元液相色谱仪在 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱 (3. mm, 1.8 µm) 上进行了五次重复进样分析 ( 图 3 显示了五次分析后保留时间和峰面积的重现性极好 ) 检测微量杂质时需要高灵敏度的分析采用最大光强流通池技术的 Agilent 126 Inifinity DAD 的灵敏度比采用旧版流通池设计的 Agilent 126 Inifinity DAD VL Plus 高出十倍 ( 图 4) 该技术可检测修饰, 例如克隆表达发生变异所产生的修饰它还可降低珍贵样品的消耗据观察发现, 配备 6 mm 最大光强流通池的 Agilent 126 Inifinity DAD (G4212B) 的灵敏度是 Agilent 126 Inifinity DAD VL Plus 检测器 (G1315C) 的十倍图 3. 采用 Agilent ORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱 (3. mm mm,1.8 µm) 在.6 ml/ 流速下以相应梯度进行五次 P128 酶解物分析的叠加图 a) Agilent 126 Infinity DAD 6 mm b) Agilent 126 Infinity DAD VL Plus 1 mm 图 4. 应用配备 A)Agilent 126 Infinity DAD,6 mm 最大光强流通池或 B)Agilent 126 Inifinity DAD VL Plus (G1315C) 的 Agilent 126 Infinity 生物惰性高效液相色谱系统, 采用 Agilent ORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱,3. mm mm,1.8 µm 在.6 ml/ 流速下以相应梯度分别进行 P128 酶解物分析的色谱图叠加 6

7 体积排阻色谱为了证实蛋白的完整性或证明天然构象中未形成二聚体或多聚体, 体积排阻色谱 (SEC) 结合 UV 检测是一种常用的分析技术体积排阻的缺点是分离度较低采用小粒径 SEC 色谱柱可得到出众的分离度并可最大限度地减少次级相互作用, 因此是检测杂质或多聚体形成的有力工具采用肽图分析中的相同蛋白进行 SEC 实验其中比较了两种 5-µm 粒径色谱柱和一种 3-µm 粒径色谱柱的结果混合物中的第二种化合物只在使用 Agilent Bio-SEC 3-µm 色谱柱的条件下才可被检测 ( 图 5) Agilent SEC-3 3 µm 3 Å 7.8 mm 3 mm Agilent SEC-5 5 µm 3 Å 7.8 mm 3 mm A SEC-5 5 µm 3 Å 7.8 mm 3 mm 图 5. 应用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统以及不同的 SEC 色谱柱进行 P128 治疗性蛋白样品的体积排阻分析 7

8 离子交换色谱离子交换色谱可用于分离生产或加工过程中末端赖氨酸残基发生氧化脱酰胺化或截断所产生的 NBE 电荷异构体为了从主峰中分离碱性或酸性异构体, 分离度必须高且次级表面相互作用需要尽可能小采用 Agilent 126 Infinity 生物惰性及防腐蚀的四元液相系统并使用 Agilent Bio Mab 5 及 Bio Mab 1 色谱柱及一种尺寸相似的商用色谱柱 ( 品牌 B) 对 P128 蛋白脱盐样品进行分离应用 Agilent Bio Mab 5 色谱柱可获得最佳峰形及最高效率 ( 图 6) 结论 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相系统及 Agilent Bio 高效液相色谱柱系列为表征治疗性蛋白药物 P128 的理化性质提供了一个强大的多功能工具用于分析治疗性蛋白的安捷伦解决方案可实现生物惰性卓越的分离度抗腐蚀性高灵敏度及快速的分离 Agilent Bio MAb mm 25 mm Agilent Bio MAb mm 25 mm B WCX-1 4. mm 25 mm 图 6. 应用 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统以及不同的阳离子交换色谱柱进行 P128 治疗性蛋白样品分析所得的弱阳离子交换色谱图安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 12 月 1 日出版号 CHCN

前言在诸如离子交换 (IEX) 或体积排阻色谱 (SEC) 法中使用的高盐流动相, 对于不锈钢材质的液相色谱系统而言是一项严峻挑战由于长期使用含盐缓冲液所引发的腐蚀效应, 导致此类液相色谱系统存在损坏的风险其结果就是需要执行繁杂的清洗步骤因此, 强烈建议使用不含铁的系统, 避免受到高盐浓度的

前言在诸如离子交换 (IEX) 或体积排阻色谱 (SEC) 法中使用的高盐流动相, 对于不锈钢材质的液相色谱系统而言是一项严峻挑战由于长期使用含盐缓冲液所引发的腐蚀效应, 导致此类液相色谱系统存在损坏的风险其结果就是需要执行繁杂的清洗步骤因此, 强烈建议使用不含铁的系统, 避免受到高盐浓度的性能验证采用阴离子交换色谱法对蛋白质进行分析 Agilent 126 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统用于高盐缓冲液应用领域的可行性应用简报化学和药物分析作者 8 7 6 pl 6.9 a- pl 4.5 Sonja Schneider 安捷伦科技有限公司德国瓦尔德布隆 5 4 3 2 1 pl 6.9 pl 6.24 pl 4.5 5 1 15 2 25 摘要在本应用简报中,