方法开发涉及到简单及复杂混合物的分离 选择性受固定相 有机改性剂类型 梯度斜率 流速以及温度等多个因素的影响 对于可离子化的化合物来说, 缓冲液的 ph 值也是一个重要参数 优化可离子化化合物的分离以寻找稳定条件已经成为液相色谱方法开发的重要组成部分 [] 大部分制药和生物化合物都含有可离子化的官能

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1 在高 ph 下使用 Agilent Poroshell HPH-C 色谱柱作为方法开发的工具 技术概述 前言 开发出适合化学分析和药物分析的 HPLC 方法是一项极具挑战性的任务 为获得足够的分离度并实现稳定分离, 涉及到对各种色谱参数的筛选 尽管开发方法的途径有很多, 比如一次一因子实验法, 以及质量源于设计 (QbD), 不过优化分离的目标和因子还是相同的 有很多因素影响色谱分离度 (RS), 如效率 (N, 取决于粒径 粒子形态以及色谱柱长度 ) 保留因子 (k, 取决于溶剂强度 ) 和选择性 (a, 取决于键合相和流动相 ) 的 ( 图 ), 其中选择性 a 是最重要的因素 N a k'. 9 9 a:..... k : R S = N (a ) k a (k + ) 图. 典型的方法开发参数 ; 选择性 效率以及保留时间对分离度的影响

2 方法开发涉及到简单及复杂混合物的分离 选择性受固定相 有机改性剂类型 梯度斜率 流速以及温度等多个因素的影响 对于可离子化的化合物来说, 缓冲液的 ph 值也是一个重要参数 优化可离子化化合物的分离以寻找稳定条件已经成为液相色谱方法开发的重要组成部分 [] 大部分制药和生物化合物都含有可离子化的官能团 ( 如羧基或氨基 ) 在反相液相色谱 (RPLC) 分离方面, 使用 ph 是一种增加选择性的有效工具 低 ph 下可分离质子化的酸和碱, 但是高 ph 条件下这些酸与碱会去质子化 分析物在反相色谱上的保留很大程度取决于其电荷, 因此可利用 ph 使选择性发生较大的变化 在酸性 ph 下, 酸会呈中性, 因此保留时间最长 ; 碱由于完全带电荷而保留时间最短 在碱性 ph 下 ( 高于化合物的 pka), 碱则呈中性, 因此保留时间最长 ; 而酸会完全离子化使得保留时间最短 为了使碱性分析物在 RPLC 上获得最佳的峰形 保留时间以及样品上样量, 流动相的 ph 至少应该比目标化合物的 pka 高两个单位 中性化合物的保留则不受 ph 影响 在本文中, 使用专门设计的且在高 ph 流动相中能保持稳定的 Agilent Poroshell HPH-C 色谱柱, 通过 ph 的调节来达到对选择性的控制 材料与方法本文使用 Agilent Infinity 液相色谱系统 Agilent Infinity 二元泵 GB 安捷伦自动液体进样器 (ALS) GC Agilent Infinity 柱温箱 (TCC) SL GC Agilent 9 Infinity 二极管阵列检测器 (DAD) GA ( 光程 mm, 体积 µl) 使用 OpenLab(C.. 版 ) 控制 HPLC 并处理数据 Agilent Poroshell HPH-C,. mm,. µm ( 部件号 99-) 或 Poroshell HPH-C,. mm,. µm( 部件号 999-) 某些实验中还采用了 Agilent D 单四极杆液质联用系统 表. 保留相关性实验中用到的化合物,-.-,,- -,,-,,-.-, , , β- (DMSO) Ultranox

3 使用的流动相由挥发性缓冲液如甲酸铵 乙酸铵和碳酸氢铵缓冲液组成, 可与质谱兼容 将适量的甲酸铵或碳酸氢铵溶于水中, 制成 mm 的溶液, 然后用浓酸 ( 甲酸或乙酸 ) 或浓碱 ( 氢氧化铵 ) 调至所需的 ph, 即可得到上述缓冲液 用于评估的混合物包括酸 ( 乙酰水杨酸和二氟尼柳 ) 碱 ( 普鲁卡因酰胺 双嘧达莫和地尔硫卓 ) 以及中性化合物 ( 苯己酮及杂质苯戊酮 ) 非离子化的咖啡因也进行了评估 使用 ph 影响选择性 图 展示了由酸性 碱性及中性化合物组成的混合物的洗脱顺序是如何随流动相的 ph 值的改变而变化 在本研究中, 添加了有机改性剂乙腈于普通梯度中 ( 浓度在 分钟内从 % 升至 9%) 该图分别给出了使用质谱兼容的 ph ( 甲酸铵 ) ph.( 乙酸铵 ) 以及 ph ( 碳酸氢铵 ) 的缓冲液得到的色谱图 流速为 ml/ 如图所示, 三张色谱图中使用了相同的梯度和色谱柱 中性化合物 ( 苯己酮 ) 和非离子化化合物 ( 咖啡因 ) 的洗脱时间保持不变 这两种化合物的洗脱不受 ph 改变的影响 随着流动相的 ph 从. 升至, 酸性化合物开始带电荷, 保留时间也变短了 从图 中的红箭头可以清楚地看到这一点 随着 ph 的升高, 如蓝箭头所示, 碱的保留时间变长 各个峰的洗脱顺序变化很大, 同样发生变化的还有峰间距 在这三张色谱图中, 峰形都非常出色 在本研究中, 使用 ph 的缓冲液得到化合物的峰间距比使用其他二个缓冲液的大 与使用低 ph 流动相相比, 使用高 ph 流动相时碱的保留时间更长, 峰形也更好 观察选择性的另一种方法是对两种不同条件下酸 碱和中性化合物的保留时间作图 该研究中用到的化合物见表 在本例中, 使用 Poroshell HPH-C 色谱柱, 采用相同梯度以及两种不同有机改性剂 ( 甲醇和乙腈 ), 在两种不同 ph 条件 (ph 和 ph ) 下对 种化合物进行了分析 采用的普通梯度为流速. ml/, 起始时有机相比例为 %, 在 分钟内升至 9%, 保持 分钟 % % MeCN ml/ mn Agilent Poroshell HPH C-,. mm,. µm mau mau mau ph, mm HCO NH 图. 使用 Agilent Poroshell HPH-C,. mm,. µm 液相色谱柱时通过改变 ph 控制选择性 (ph 分别为. 和 ) ph., mm NH C H O ph, mm NH HCO

4 如图 A 所示, 一部分分析物呈现了斜率为 的完美直线 使用甲醇作为有机改性剂时这些化合物为中性或不可离子化 它们包括取代苯类化合物 类固醇 酚类和苯酮 正如所预料的那样, 这些物质的保留时间不受流动相 ph 的影响 以往的研究中应用了这一方法并做了讨论, 在该研究中, 研究人员在相似的色谱条件下对两种极其相似的色谱柱 (Agilent Poroshell EC-C 和 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C) 进行了对比 [] 在直线上面的是碱类分析物 ph 时, 这些化合物带电荷, 当 ph 升至 时, 它们不带电荷, 保留时间也变长了 保留时间相关系数可用于衡量在两种不同 ph 条件下分离的差异 高度相关的图其相关系数接近 这表明两种 ph 条件下色谱分离相似 相反, 如果相关系数很小 ( 接近. 甚至更低 ), 则表明分离更为正交或是不同 图 B 所示为第二种对比, 即用乙腈作为有机改性剂, 对比低 ph 和高 ph 的梯度时保留时间的情况 在本例中, 相关系数比使用甲醇时的更小 [,,] 高 ph 下提高了 LC/MS 对碱性化合物的灵敏度在第三个实验中, 在正离子电喷雾模式下使用普通梯度比较了几种碱在高 ph 和低 ph 条件下的 LC/MS 分析结果 人们通常认为分析物分子的离子化情况取决于流动相的 ph, 使用高 ph 流动相时,LC/MS 正离子电喷雾模式下的离子化效率会显著降低, 因为此时化合物成为中性了 但是, 许多研究人员对不同类型的样品 ( 包括蛋白质 肽和氨基酸 ) 作了观察, 结果在高 ph 下发现离子化效率对流动相 ph 不敏感, 甚至会提高效率 已有报道称, 使用高 ph 缓冲液的流动相在 ESI+ 模式下成功测定了碱性化合物 [-] 在 ESI+ 模式下, 高 ph 流动相不会抑制碱性化合物的离子化 ; 相反, 会生成大量正离子, 而且在高 ph 条件下分析物的响应通常比使用酸性流动相的响应更强 这一发现极为重要, 它将普通洗脱方法的适用性, 扩展到之前很难保留的极性碱性化合物的分析 A ph ph R =.99 ph () ph () B ph ph R =.99 ph () ph () 图. 使用 Agilent Poroshell HPH-C 柱在 ph 和 ph 下分析所得的保留时间的相关性 A) 甲醇,B) 乙腈在本实验中, 使用乙腈作为有机改性剂来运行梯度 水相溶剂含.% 甲酸 低 ph 流动相改性剂或 mm ph 的碳酸氢铵 在上述的示例中, 制备了. mg/ml 利多卡因的水溶液 进样量为 µl 如图所示, 使用的色谱柱为 Poroshell HPH-C 柱, 下图为低 ph 下分析所得的色谱图, 分析物在柱上只有轻微保留, 而且峰出现拖尾 上图中, 分析物的峰保留更好, 峰形更佳, 而且峰高是下图的 倍 由于上图中流动相中有机相的含量更高, 有利于 LC/MS 检测, 因此峰面积也明显比下图的大 总而言之, 有机相越易挥发, 离子化效率越高, 而导致较高的信号强度

5 另外还对普鲁卡因酰胺和地尔硫卓进行了分析 这两种化合物信号强度的增加没有利多卡因那么显著 雾滴形成过程中溶剂挥发速率是流动相蒸汽压的函数 乙腈 : 水比例越大, 流动相挥发性越强, 对 ESI 离子化也越有利 图 A 至 C 的结果表明, 在对碱性化合物进行 ESI+LC/MS 分析时, 高 ph 流动相是替代低 ph 流动相的理想选择. mm Agilent Poroshell HPH-C mm NH HCO / ph =. %B 9 9. ml/.% / ph. =. pka = 9. log P =. 图 A. 使用正离子电喷雾模式时高 ph 及低 ph 条件下碱 ( 普鲁卡因酰胺 ) 的 LC/MS 分析结果的对比, pka 9.,logP. Agilent Poroshell HPH-C,. mm. mm Agilent Poroshell HPH-C mm NH HCO / ph. =. %B 9 9. ml/.% / ph..9 =.9 pka =. log P =. 图 B. 使用正离子电喷雾模式时高 ph 及低 ph 条件下碱 ( 利多卡因 ) 的 LC/MS 分析结果的对比, pka.,logp. Agilent Poroshell HPH-C,. mm

6 . mm Agilent Poroshell HPH-C mm NH HCO / ph.9 %B 9 9. ml/ =..% / ph.. =. pka =.9 log P =. 图 C. 使用正离子电喷雾模式时高 ph 及低 ph 条件下碱 ( 地尔硫卓 ) 的 LC/MS 分析结果的对比, pka.9,logp. Agilent Poroshell HPH-C,. mm 高 ph 条件下 Poroshell HPH-C 的稳定性 HPLC 色谱柱的稳定性是影响方法性能的关键因素之一, 人们对此开展了广泛研究 温度 水相缓冲液类型及浓度 有机溶剂的选择 添加剂 以及流动相的 ph 对色谱柱的稳定性都有影响 预筛查化合物及色谱柱可帮助科学家们更快地实现成功分离 HPLC 色谱柱的稳定性是影响方法性能的关键因素之一 采用一根耐用的色谱柱而获得稳定的 HPLC 方法是对新临床及制造项目的重要支持 如果方法开发过程中色谱柱不稳定, 会使得结果不准确并导致开发失败 色谱柱恶化是由硅胶溶解 键合相消除 或者封端流失 ( 水解 ) 导致硅醇暴露等引起的 众所周知, 硅胶柱的溶解或水解与 ph 和温度有关 (ph/ 温度越高, 恶化速率越快 ) 色谱柱恶化的其他原因还包括样品前处理不充分 ( 样品脏 ) 以及柱床不稳定 特定 ph 下衡量色谱柱稳定性的一个很好的标准是进样 次 这有利于在方法已建立的条件下开发 调整并使用色谱柱 在本研究的这一部分, 使用碳酸氢铵和乙腈在 ph 下对 Poroshell HPH-C 色谱柱进行了评估 分析物包括酸性 中性以及碱性化 合物 为了评估来自不同制造商的色谱柱, 采用了常规的压力梯度, 通过改变分析物来适应选择性方面的差异 在所有情况下, 至少使用了两种酸 碱以及中性化合物 此处讨论的方案评估了流动相改性剂对色谱柱稳定性的影响 [] 样品溶液的影响可忽略不计, 因为样品的上样量只有几 µg 所选择的测试混标用于评价色谱柱性能, 而不是评价测试样品本身对色谱柱稳定性的影响 开发过程中, 为了最大限度减少来自柱床稳定性的问题, 采用了低的流速 如图 A 所示, 除了去甲替林外, 进样 次期间, 其他所有化合物的保留时间均相当稳定 去甲替林的 pka 非常接近流动相的 ph, 保留时间变得越来越长 在同样的实验条件下对其他品牌的另一根色谱柱进行了测试 在进样 次期间, 大部分分析物的保留时间保持不变 去甲替林的洗脱时间迅速变得越来越晚 进样在 次以内时, 去甲替林与邻近的中性化合物苯己酮开始共流出 峰继续向苯己酮峰移动, 在进样 次后完全共流出 这一实验表明与 Poroshell HPH C 色谱柱相比, 非安捷伦的色谱柱恶化程度更大 随着样品的改变, 峰高也会发生变化

7 图 A. 即使在高 ph 碳酸氢铵条件下 Agilent Poroshell HPH-C,. mm,. µm 色谱柱也获得了出色的保留 ( 方法总运行时间 =, 流速. ml/) 图 B. 竞争者 µm 色谱柱在高 ph 碳酸氢铵条件下出现了更严重的降解

8 结论 采用 Agilent Poroshell HPH C 色谱柱时, 可利用 ph 调整选择性, 而且不会牺牲色谱柱在高 ph 下的寿命 保持梯度不变而改变 ph, 种酸 碱以及中性化合物的洗脱顺序会发生很大的变化, 色谱分离度也因此会有所改变 在第二个实验中, 使用普通梯度对 ph 和 ph 下的保留时间作图并确定相关系数 用 R 衡量正交性 我们发现两种 ph 条件提供了不同的选择性 使用 ph 作为方法开发的工具非常有效, 尤其当样品含有酸性或碱性化合物时更是如此 我们还研究了高 低 ph 下几种碱性化合物在梯度 HPLC 上的正离子电喷雾质谱特性 在本例中, 我们发现碱性化合物的峰形得到了改善, 而且保留时间也延长了 我们还发现, 从峰面积角度来说, 信号增强了 这一影响并非普遍现象, 有可能与化合物有关 在任何情况下, 碱类化合物在高 ph 时的信号都没有变弱 最后, 我们确定, 在 C 下使用 ph 的碳酸氢铵时,Poroshell HPH C 色谱柱的使用寿命更长 ( 可超过 次进样 ) 在 Poroshell HPH C 柱上利用 ph 作为方法开发的工具, 色谱工作者可最大限度提高方法开发和分析的灵活性, 而 Agilent Poroshell 系列产品的耐用特性和长寿命也能让其从中获益 参考文献. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan. Introduction to Modern Liquid Chromatography, rd Edition, p. 9. John Wiley & Sons, Inc., New York (). Anon., Poroshell EC C 和 ZORBAX Eclipse Plus C 色谱柱之间的方法转换, 安捷伦科技公司技术概览, 出版号 99-CHCN,. K. Croes, A. Steffens, D. Marchand, L. Snyder. J. Chromatog. A. 9, (). W. Long,A. Mack, Comparison of Selectivity Differences Among Different Agilent ZORBAX Phenyl Columns Using Acetonitrile or Methanol ( 对比使用乙腈或甲醇时不同 Agilent ZORBAX Phenyl 色谱柱在选择性方面的差异 ), 安捷伦科技公司应用简报, 出版号 99-EN, 9. Raluca-Iona Chirita-Tampu, C. West, L. Fougere, C. Elfakir, LC.GC Europe,, (). H. P. Nguyen, K. A. Schug, J. Sep. Sci.,, (). S. Zhou, K. D. Cook, J. Am. Soc. Mass Spec.,, 9 (). B. E. Boyes, Separations and Analysis of Peptides at High ph, th WCBP, San Francisco, Ca. () 9. F. E. Kuhlmann, A. Apffel, S. M. Fischer, G. Goldberg, P. Goodley, J. Am. Soc. Mass Spec.,, (99). C. R. Mallet, Z. Lu, J. R. Mazzeo, Rapid Commun. Mass Spec.,, 9 (). C. Ye, G. Terfloth, Y. Li, A. Kord, J. Pharmaceut. Biomed.,, (9) 安捷伦不对本文可能存在的错误或由于提供 展示或使用本文所造成的间接损失承担任何责任 本文中的信息 说明和技术指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 月 日, 中国印刷 99-9CHCN

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