前言托非索泮 [1-(3,4- 二甲氧基苯基 )-4- 甲基 -5- 乙基 -7,8- 二甲氧基 -5H-2,3- 苯二氮卓 ] 属于 2,3- 苯二氮卓类化合物它是一种治疗焦虑症和用于戒酒的药物 1,2 由于其立体中心在 C(5) 原子上, 托非索泮有两种对映异构体 (R(+) 和 S(

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奎姬
5 years ago
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1 托非索泮对映异构体和构象异构体的分离在 Agilent 126 Infinity 分析型 SFC 系统上应用 Daicel 固定化多糖衍生型手性柱应用简报制药作者 Tong Zhang Dung Nguyen Pilar Franco Chiral Technologies, Europe Parc d Innovation Bd. Gonthier d Andernach B.P Illkirch Cedex France Martin Vollmer Agilent Technologies GmbH Hewlett-Packard Str Waldbronn, Germany 摘要由于对映体具有不同的生理活性, 因此对其进行色谱分离是药物研发的一个重要任务通常采用超临界流体色谱 (SFC) 结合手性固定相, 测定对映异构体过量值 (ee) 由于很难预测哪种固定相最适合用于分离待测对映异构体, 因此, 最好对不同固定相和流动相进行自动化筛选本应用简报将介绍 Agilent 126 Infinity 分析型 SFC 和 Daicel 固定化多糖衍生型手性柱用于分离托非索泮对映异构体和构象异构体时对流动相和固定相进行的筛查

2 前言托非索泮 [1-(3,4- 二甲氧基苯基 )-4- 甲基 -5- 乙基 -7,8- 二甲氧基 -5H-2,3- 苯二氮卓 ] 属于 2,3- 苯二氮卓类化合物它是一种治疗焦虑症和用于戒酒的药物 1,2 由于其立体中心在 C(5) 原子上, 托非索泮有两种对映异构体 (R(+) 和 S( )) 溶解后, 其二氮杂环结构将存在两种船式构象, 因而每个对映体各有两种构象异构体 ( 图 1) 构象异构体跃迁的驱动力归因于 C(4)- 甲基和 C(5)- 乙基之间出现的空间排斥效应 3 托非索泮的药理作用已引起人们的关注, 为了分别评价各同分异构体的不同生物活性理解其动力学和热力学的特性以及控制该药物的质量, 需要一种简便耐用的方法来分离这四种异构体在本应用简报中, 我们用固定化多糖衍生型手性固定相 (CSP) 填充色谱柱, 并结合 Agilent 126 Infinity 分析型 SFC 系统的先进 SFC 技术, 通过一种简便耐用且快速的色谱方法, 对托非索泮所有的对映异构体和构象异构体的分离作了评价实验部分化学品本研究所用的手性柱 CHIRALPAK IA CHIRALPAK IB CHIRALPAK IC 和 CHIRALPAK ID 由大赛璐 (Daicel) 化学工业株式会社生产, 规格为 mm 内径, 填充有 5 µm 的固定化直链淀粉或纤维素所衍生的 CSP 颗粒本研究使用超临界 CO 2 ( 工业质量 4.8) 作为主要流动相成分对不同流动相改性剂, 如甲醇 (H) 异丙醇 (2-PrOH) 和乙腈 (ACN) 在不同浓度下进行筛选所有试剂均为 HPLC 级由于托非索泮分子具有碱性, 所有流动相中均加入了二乙胺 (DEA) (.1% v/v) 仪器 2 3 N N OMe 图 1 托非索泮对映体的构象平衡所有 SFC 实验均在 Agilent 126 Infinity 分析型 SFC 系统上完成该系统包括用于 CO 2 预处理和后处理的 A5 fusion 模块以及经改进的 Agilent 126 二元泵液相色谱系统, 可以精确恒定地对流动相进行计量该系统 (G439A) 包括如下模块 : SFC Fusion A5 模块 Agilent 126 Infinity SFC 二元泵 Agilent 126 Infinity 标准型脱气机 Agilent 126 Infinity 标准自动进样器 Agilent 126 Infinity 二极管阵列检测器, 配置高压 SFC 流通池 R-(+) Eq. S-( ) Eq. H N N Et Me OMe OMe Me N N Et H 另外, 所用的安捷伦 SFC 方法开发工具包包括 : 两个内置阀驱动的 Agilent 126 Infinity 柱温箱 Agilent ZORBAX 方法开发的阀工具包, 6 bar 色谱条件在整个实验中, 流速均设置为 3. ml/min, 柱温箱温度为 35 C,CO 2 超临界流体的反压为 15 bar OMe R-( ) Ax. Me N N H Et Et N N H Me S-(+) Ax. OMe 2

3 结果与讨论基于多糖衍生物的 CSP 具有卓越的对映选择性和多功能性, 因此被广泛用于各种对映异构体或立体异构体的液相色谱和 SFC 分离自 24 年以来, 先进的固定化多糖 CSP 已成为一种有效的手性分离工具这种新型色谱柱的优点包括通用的溶剂兼容性全新的选择性以及耐用的填 4-6 料另外, 由于 SFC 的扩散性和传质性更佳并且有较低的流动相粘度, 有利于提高分离速度, 因此被认为是一种比液相色谱更具优势的技术我们实验室将 SFC 与下列四种固定化手性柱, 即 CHIRALPAK IA CHIRALPAK IB CHIRALPAK IC 和 CHIRALPAK ID 相结合, 对托非索泮对映异构体和构象异构体的同时分离进行了评价对包括 H 2-PrOH 和 ACN 在内的各种流动相改性剂也进行了系统的检查如图 1 所示,R(+)- 和 S( )- 是托非索泮的主要构象异构体, 其中连接 C(5) 原子的乙基具有近乎平伏的取向 (Eq.) 根据溶解该产物的溶剂不同, 构象平衡向利于形成 R( )- 或 S(+)- 构象异构体方向移动, 此时连接 C(5) 原子的乙基将改变为直立取向 (Ax.) 我们对各种样品介质中(H EtOH 2-PrOH 甲基叔丁基醚/H 9/1 和 ACN) 托非索泮的构象异构体的跃迁研究, 表明了 H 能最快地诱导出 R( )- 或 S(+)- 构象异构体的最大形成比例 ( 高达 26%), 而 ACN 形成同样分子的动力学过程最慢且比例最低 ( 最高仅为 16.5%) 7 在任何情况下, 样品混合物中的 R( )- 和 S(+)- 构象异构体都不会超过 R(+)- 和 S( )- 对映异构体因此,R(+) 和 S( ) 对映异构体 (Eq.) 总是作为色谱主峰被洗脱, 而 R( )- 或 S(+)- 构象异构体 (Ax.) 则总是小峰但由于缺乏标准品, 我们的研究还不能确定 R(+)- 和 S( )-, 以及 R( )- 和 S(+)- 异构体之间的相对洗脱顺序为便于讨论, 在此我们将小峰标记为 P (Ax.), 主峰标记为 P (Eq.), 而没有指认每对对映异构体 - 构象异构体中的分子绝对构型 H 似乎是用于溶解托非索泮异构体的最通用的共溶剂如表 1 所示, 用 CHIRALPAK IA 和 CHIRALPAK ID 可使四个峰得到最佳分离, 分析时间分别短至 3 分钟 ( 图 2 (a)) 或 5 分钟 ( 图 2 (b)) 有趣的是, 在 CHIRALPAK IA CHIRALPAK IC 和 CHIRALPAK ID 柱上的洗脱顺序也相同, 即,P (Ax.) -P (Eq.) -P (Ax.) -P (Eq.) 两个 P(Ax.) 和 1 个 P(Eq.) 在 CHIRALPAK IB 上共洗脱 CHIRALPAK IA CHIRALPAK IB CHIRALPAK IC CHIRALPAK ID tr 1 (min) tr 2 (min) tr 3 (min) tr 4 (min) Rs (12) Rs (23) Rs (34) 表 1 在 H/CO 2 中托非索泮对映异构体和构象异构体的分离度共溶剂 :2% (H/DEA 1/.5 v/v) 用于 CHIRALPAK IA 和 IC 柱 ;1% (H/DEA 1/1. v/v) 用于 CHIRALPAK IB; 4% (H/DEA 1/.25 v/v) 用于 CHIRALPAK ID 柱 3

4 CHIRALPAK IA CHIRALPAK IB CHIRALPAK IC CHIRALPAK ID (a) 2% H (b) 1% H (c) 3% H (d) 4% H min min min min (e) 5% 2-PrOH (f) 2-PrOH (g) 5% ACN (h) 4% 2-PrOH min min min min CHIRALPAK IA CHIRALPAK IA CHIRALPAK IC CHIRALPAK ID 图 2 分离实例改性剂 ( 溶剂通道 B, 按体积划分 ): 2% (H/DEA 1/.5 v/v) 对应于 (a);1% (H/DEA 1/1. v/v) 对应于 (b);3% (H/DEA 1/.33 v/v) 对应于 (c);4% (H/DEA 1/.25 v/v) 对应于 (d); 5% (2-PrOH/DEA 1/.2 v/v) 对应于 (e); 梯度 (2-PrOH/DEA 1/.2 v/v) 对应于 (f);5% (ACN/DEA 1/.2 v/v) 对应于 (g);4% (2-PrOH/DEA 1/.25 v/v) 对应于 (h) * 梯度程序 :-1.5 分钟 2% B; 分钟 2%-5% B; 分钟 5% B; 分钟 2% B SFC 改性剂的性质对四个色谱峰的分离度有很大影响例如, 当从 H( 图 2 (a)) 变为 2-PrOH( 图 2 (e)) 时, 前两个峰在 CHIRALPAK IA 柱上从完全分离变为不完全分离实验表明, 为了让前两个峰在使用这种改性剂时得到完全分离, 梯度洗脱不失为一种好方法 ( 图 2(e),Rs (12) = 1.27; 图 2(f),Rs (12) = 4.18) 改性剂对托非索泮峰的洗脱图谱也有影响以在 CHIRALPAK IC 和 CHIRALPAK ID 柱上的分离为例, 在 CHIRALPAK IC 柱上, 使用 2% H 洗脱时, 洗脱顺序为 P (Ax.) - P (Eq.) -P (Ax.) -P (Eq.) ( 图 2 (c)), 但使用 5% ACN 洗脱时, 洗脱顺序则变成 P (Ax.) -P (Eq.) - P (Eq.) -P (Ax.) ( 图 2 (g)) 在 CHIRALPAK ID 柱上, 用 4% H 洗脱时, 四个峰的洗脱顺序为 P (Ax.) -P (Eq.) -P (Ax.) -P (Eq.) ( 图 2 (d)), 但改用 4% 2-PrOH 时, 洗脱顺序则变为 P (Eq.) -P (Ax.) -P (Ax.) -P (Eq.) ( 图 2 (h)) 4

5 托非索泮异构体的 SFC 分离重现性非常好在给定的色谱条件下在 CHIRALPAK IC a 5. 柱上连续 2 小时进样托非索泮 12 次的结果可以证明这一点图 3 这也归功能与精确的流动相计量相结合能提供卓越的前后 CO 2 调节图 4 显示了通 tr4 tr3 4. ԍ क़ (min) 于 Agilent 126 Infinity SFC 系统的高性 6. tr2 3. tr1 2. 过 CO2 反压或出口压力 (a) 和 Agilent Infinity SFC 二元泵的压力 (b) 来说明该系统的性能 2 4 结论 ᄣ ຕ 4.5 填充固定化多糖衍生型手性固定相的 Daicel 4. b Rs (12) 映异构体和构象异构体的多种分离解决 3. Rs (34) 方案 2.5 Rs (23) ݴ 3.5 柱具有极高的耐用性适用于托非索泮对使用 SFC 和 HPLC 对托非索泮异构体进行分析时在同一组手性柱7上只需运行一 1. 次色谱分析即可使该异构体完全分离 SFC.5 是实现托非索泮更快速分离的最佳选择 Agilent 126 Infinity 分析型 SFC 系统的 2 4 高仪器性能使得托非索泮的分析分离更为耐用和重现 6 ᄣ ຕ 图3 CHIRALPAK IC 柱上的分离重现性 3% (H/DEA 1/.33 v/v) 流速 3 ml/min 温度 35 C (a) 保留时间 (b) 分离度 bar bar (a) CO2 ג ଣহ ੨უ (b) HPLC - SFC ԭუ ݴ ဆ क़ (min) 6 图4 Agilent 126 Infinity 分析型 SFC 系统的压力稳定性改性剂 3% (H/DEA 1/.33 v/v) 流速 3 ml/min 温度 35 C min

6 参考文献 1. T. Seppala, E. Palva, M.J. Mattila, R.C. Shrotriya, Psychopharmacology 69 (198) A. Bond, M. Lader, European Journal of Clinical Pharmacology, 22 (1982) M. Hu, P. He, Y. Chen, G. Carr, J. Guo, N. Ye, Journal of Chromatogr. A, 1129 (26) T. Zhang, D. Nguyen, P. Franco, J. Chromatogr. A 1191 (28) P. Franco, T. Zhang, J. Chromatogr. B 875 (28) T. Zhang, P. Franco, Chiral Separation Techniques: A practical approach (3rd revised and updated Edition, Subramanian, G., ed.), VCH, Weinheim, pp T. Zhang, N. Nguyen, P. Franco, M, Vollmer, Posters at Chirality ISCD 23,July 211 (Liverpool, UK) and at SFC 211, July 211 (New York, USA) 6

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8 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 11 月 1 日, 中国印刷出版号 CHCN

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前言 托非索泮 [1-(3,4- 二甲氧基苯基 )-4- 甲基 -5- 乙基 -7,8- 二甲氧基 -5H-2,3- 苯二氮卓 ] 属于 2,3- 苯二氮卓类化合物 它是一种治疗焦 虑症和用于戒酒的药物 1,2 由于其立体中心在 C(5) 原子上, 托非索 泮有两种对映异构体 (R(+) 和 S(

前言托非索泮 [1-(3,4- 二甲氧基苯基 )-4- 甲基 -5- 乙基 -7,8- 二甲氧基 -5H-2,3- 苯二氮卓 ] 属于 2,3- 苯二氮卓类化合物它是一种治疗焦虑症和用于戒酒的药物 1,2 由于其立体中心在 C(5) 原子上, 托非索泮有两种对映异构体 (R(+) 和 S(