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钗兹仇
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1 在 LC/MS 分析中充分使用安捷伦高效柱应用报告方法开发作者 nne E. Mack 安捷伦科技公司 8 Centerville Road Wilmington, DE 988 US 摘要对于液相色谱技术的新进展如 UHPLC 和 LC/MS, 在优化方法参数时, 需要格外谨慎本文通过各种应用实例说明了不同流动相对 MS 检测离子抑制的影响, 以及不同色谱柱粒径和数据采集速率对 MS 检测灵敏度和峰容量的影响前言新的小粒径色谱柱, 包括亚 µm 和表面多孔 µm 柱, 由于提供了更高的分离度和更快的分析速度, 提高了液相色谱的效率同类色谱柱也可以用于 LC/MS 应用但这些色谱柱在与 LC/MS 和其它提高效率选件的兼容性上, 出现了许多问题第一个问题是 MS 是否具有足够的检测器速度, 以及 MS 可以检测分离速度多快的多少种完全分离的化合物其它问题还包括如何采用 LC/MS 兼容的流动相以得到良好峰形在本应用报告的实例中, 我们对不同粒径的色谱柱进行了比较, 说明检测器的速度完全可以匹配这些色谱柱的高柱效本文还探讨了获得最佳 LC/MS 结果的流动相和峰形优化问题

2 实验本实验使用 gilent 快速分离 LC (RRLC) 柱 gilent 9 Infinity UHPLC 和 gilent 64 三重串联四极杆质谱仪所有连接均使用长度尽可能短的. mm 小内径毛细管, 以确保最大限度地减少柱外体积和样品谱带扩宽造成的柱效损失具体的方法参数分别在色谱图中显示我们将用条件峰容量来评价不同的方法参数峰容量是指在一定梯度时间范围内理论上可以分离的峰的个数, 见方程方程. 条件峰容量结果和讨论用质谱检测不同粒径色谱柱的分离结果有一个有关 LC/MS 的错误概念, 使用质谱检测时小粒径柱与稍大粒径柱相比, 因柱外体积增大使谱带展宽, 而失去了优势图显示实际情况并非如此虽然小粒径柱的某些优势确实减弱了, 但它们却依然存在以种镇痛药物的分离为例, 当从. µm 柱升级为.8 µm 柱时, 用 UV 检测可以看出, 峰容量增加了 7%, 而用 MS 检测只增加了 6% 尽管质谱仪中的柱外体积使小粒径柱的优势有所减弱, 但高效柱还是明显改善了分离条件峰容量 = = t R,n t R, W t R,n 和 t R, : 最后一个峰和第一峰的保留时间 W: W /: W / 4 ( 平均峰宽 4s). 是半峰高处的平均峰宽 mu UV gilent ZORX Eclipse Plus C8. mm mm,. µm ve W / =. = 4 MS gilent ZORX Eclipse Plus C8. mm mm,. µm ve W / =. = 4 mu gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8. mm mm.8 µm ve W / =.84 = gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8. mm mm,.8 µm ve W / =. = vs. ( ) gilent 9/64 UHPLC/MS/MS 离子源 C, L/min, psi, V.% 甲酸水裂解电压 V 乙腈扫描 4, ms 扫描时间 ml/min. amu 步进,8.6 周期 /s T.. ms/ 周期 % 9 用质谱鉴别的化合物 ( 按出峰顺序 ): 停止时间 min 扑热息痛 : m/z 9 非那西丁 : m/z 79 后运行时间. min 咖啡因 : m/z 94 水杨酸 : m/z 样品 µg/ml 标准品水溶液进样 µl 邻乙酸胺基邻酚 : m/z 9 舒林酸 : m/z 6 TCC 室温, 无温度控制 ( 约 4 C) 乙酰苯胺 : m/z 吡罗昔康 : m/z DD Sig = 6, 4 nm; Ref = 关闭乙酰水杨酸 : m/z 托美汀 : m/z 7 图.. 与.8 µm 柱用 UV 和 MS 扫描检测的性能比较如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN 酮洛芬 : m/z 4 双氟尼酸 : m/z 双氯芬酸 : m/z 9 塞来昔布 : m/z 8 布洛芬 : m/z 6

3 为了了解较小粒径柱用 MS 检测时是否具有优势, 我们用 LC/MS/MS 对复杂的种毒物化合物进行了分析,4 种粒径的比较如图所示上方色谱图显示的是表面多孔.7 µm 柱的分析结果, 下面的三张色谱图分别是.8. 和 µm 全多孔柱的分析结果三种全多孔柱具有相同的键合化学结构, 而表面多孔填料则具有非常相似的键合化学结构 ; 四种分析得到了近乎一致的选择性 µm 柱在进行这种复杂分析时的弊端马上就显露出来了, 使用 µm 柱时, 所有峰都比另外三种小粒径柱要宽得多, 有大量共洗脱峰, 尤其是对于先洗脱的那些化合物在这个毒物分析实例中,.7.8 和. µm 柱之间的差异很小. µm 柱在梯度洗脱范围内得到的峰略宽, 而.7 和.8 µm 柱基本相当 x gilent Poroshell EC-C8,. mm,.7 µm W / =.9 W W / =.8 / =.49 W / =.44 W / = (%) vs. (min) W / =.8 gilent ZORX RRHT Eclipse Plus C8,. mm,.8 µm W W / =.4 / =.49 W / =.4 W / = (%) vs. (min) gilent ZORX Eclipse Plus C8,. mm,. µm W / =.4 W / =. W / =.47 W / =.47 W / = (%) vs. (min) gilent ZORX Eclipse Plus C8,. mm, µm W / =.99 W / =.6 W / =.69 W / =.8 W / = (%) vs. (min) gilent /64 RRLC/MS/MS mm 甲酸铵含.% 甲酸乙腈含.% 甲酸. ml/min T % 9 9 停止时间 6 min 后运行时间 min 样品安捷伦 LC/MS 毒物分析测试混合物 ( 部件号 9-47),: 用水稀释, 进样 µl TCC 6 C MS C, L/min, psi, V, P-ESI+, dmrm 化合物 ( 按洗脱顺序排列 ): 可待因 MDE 氧可酮海洛因安非他明可卡因 MD 哌替啶氢可酮曲拉唑酮甲基安非他明 PCP MDM 奥沙西泮士的宁硝基安定苯丁胺维拉帕米劳拉西泮美沙酮阿普唑仑替马西泮普罗地芬安定 THC 图. 表面多孔.7 µm 柱与全多孔. 和.8 µm 柱用 MS/MS 检测时的性能比较如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 99-64CHCN

4 较大粒径的.7 µm 柱可以得到与.8 µm 较小粒径填料相似的性能, 因为其粒径分布更窄, 薄多孔壳的传质距离较短图显示了通过对种常用镇痛药的更简化分析, 对.7.8 和. µm 柱进行的更近一步的比较同样, 三根柱子的选择性非常相近对于需要转移方法的实验室来说, 这是安捷伦液相色谱柱产品系列的优势特点从色谱图左侧显示的压力可以看出,. µm 柱适用于在 4 bar HPLC 仪上进行这一分析, 而安捷伦 Poroshell 柱最好在 6 bar 上使用,.8 µm 柱在 > 6 bar UHPLC 系统上使用更为有利较小粒径柱的条件峰容量比. µm 柱高 % 以上而且, 灵敏度 ( 信噪比 ) 提高了 4% 以上, 与. µm 柱相比,.8 和.7 µm 柱的峰更高更尖 gilent ZORX Eclipse Plus C8, mm,. µm P max = bar gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8, mm,.8 µm P max = 647 bar gilent Poroshell EC-C8, mm,.7 µm P max = 466 bar PW / =.4 S/N = 8 = 4 PW / =. S/N = = 4 PW / =. S/N = 6 = 6 gilent 9/64 UHPLC/MS/MS.% 甲酸水乙腈 ml/min T. % 9 停止时间 min 后运行时间. min 样品 µg/ml 标准品水溶液进样 µl TCC 室温, 无温度控制 ( 约 4 C) 离子源 C, L/min, psi, V 裂解电压 V 扫描 4, ms 扫描时间,. amu 步进, 8.6 周期 /s,. ms/ 周期用质量鉴别的化合物 ( 按洗脱顺序 ): 扑热息痛 : m/z 9 咖啡因 : m/z 94 邻乙酸胺基邻酚 : m/z 9 乙酰苯胺 : m/z 乙酰水杨酸 : m/z 非那西丁 : m/z 79 水杨酸 : m/z 舒林酸 : m/z 6 吡罗昔康 : m/z 托美汀 : m/z 7 酮洛芬 : m/z 4 双氟尼酸 : m/z 双氯芬酸 : m/z 9 塞来昔布 : m/z 8 布洛芬 : m/z 6 图. 表面多孔.7 µm 与全多孔. 和.8 µm 柱 MS 扫描检测性能比较如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN 4

8 µm, mm 柱可以升高到 bar 以上, 则分析时间将比原来的 mm,. µm 分析缩短 8% 7. gilent ZORX Eclipse Plus C8 mm,. µm ml/min bar PW / =. = 4. 7.8.6....4..6.7.8.9....4..6.7.8.9 gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8 mm,.

5 由于.8 和.7 µm 柱比. µm 柱的柱效高得多, 所以可以使用较短的柱子, 如图 4 所示在相同下, 对 mm.8 和.7 µm 柱与 mm. µm 柱进行比较,.8 和.7 µm 柱的分析时间缩短了一半三次分析所得的峰容量相似, 但.8 和.7 µm 柱在. µm 柱一半的时间内, 理论上可以分离同样数量的色谱峰这个例子中的压力也值得注意, 因为 Poroshell, mm 柱产生的压力与 mm,. µm 柱相当, 都是在 4 bar 以下, 所以, 这类分析可以在任何液相色谱系统上进行在压力没有问题的情况下, 安捷伦 ZORX RRHD Eclipse Plus C8.8 µm, mm 柱可以升高到 bar 以上, 则分析时间将比原来的 mm,. µm 分析缩短 8% 7. gilent ZORX Eclipse Plus C8 mm,. µm ml/min bar PW / =. = gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8 mm,.8 µm ml/min bar PW / =.9 = gilent Poroshell EC-C8 mm,.7 µm ml/min 6 bar PW / =.86 = gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8 mm,.8 µm.7 ml/min 7 bar PW / =. = 样品 TCC 离子源裂解电压 gilent 9/64 UHPLC/MS/MS.% 甲酸水乙腈 µl (mm 柱为 µl) µg/ml 标准品进样室温, 无温度控制 ( 约 4 C) C, L/min, psi, V V 扫描 4, ms 扫描时间,. amu 步进,8.6 周期 /s,. ms/ 周期 mm, ml/min, 9% in. min mm, ml/min, 9% in.7 min mm,.7 ml/min, 9% in.7 min 用质量鉴别的化合物 ( 按洗脱顺序 ): 扑热息痛 : m/z 9 吡罗昔康 : m/z 咖啡因 : m/z 94 托美汀 : m/z 7 邻乙酸胺基邻酚 : m/z 9 酮洛芬 : m/z 4 乙酰苯胺 : m/z 双氟尼酸 : m/z 乙酰水杨酸 : m/z 双氯芬酸 : m/z 9 非那西丁 : m/z 79 塞来昔布 : m/z 8 水杨酸 : m/z 布洛芬 : m/z 6 舒林酸 : m/z 6 图 4. 表面多孔.7 µm 和全多孔.8 µm 柱与. µm 柱相比,MS 检测可能达到的高速分析示例如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN

6 虽然如此快速的分析将损失一定峰容量, 出现一些共洗脱峰, 但高选择性的 MS 检测器仍具有在.4 分钟内分辨这种镇痛剂的能力图中的分析实例说明了可以达到多好的峰容量这是空白血浆提取物和加标全血提取物的重叠色谱图安捷伦 Poroshell 柱可以产生如此尖锐的色谱峰, 从而得到了高峰容量, 可以在样品基质的背景峰中分离出个分析物有时, 两个化合物的共洗脱峰可能抑制了其中一个的信号, 因此, 对这种离子抑制的最好保护就是使所有峰都得到色谱分离 7... ng/ml , gilent /646 RRLC/MS/MS mm 醋酸铵,pH ; :8 甲醇 : 水 mm 醋酸铵乙腈.4 ml/min T. 7. % 7 7 样品全血提取物 µl 进样色谱柱 gilent Poroshell EC-C8. mm,.7 µm 离子源 4 C, L/min, 4 psi, V 裂解电压 8 V MS 扫描质量范围 8 扫描时间秒 ESI 正极 QuEChERS 全血提取 : 将 ml 全血加至离心试管中, 并加入适当体积标准混合物的浓缩储备液, 使混合组分浓度达到 ng/ml, 加入 µl 内标储备溶液 ( 去甲替林 ), 以及两个陶瓷搅拌棒, 然后进行涡旋混合加入一定量预先混合的提取盐, 猛烈振摇, rpm 离心分钟将毫升提取物转移到含 mg PS 和 mg MgSO 4 的 d-spe 试管 ( ml 离心管 ) 中进行基质净化 ; 涡旋震荡分钟, 并于 8 rpm 离心分钟将 µl 提取物转入含 8 µl 水的液相色谱样品瓶中, 涡旋混合, 并分析图. 用高效表面多孔.7 µm 柱和 MS 扫描检测, 从全血样品基质背景中分离各分析物 6

7 用 MS 优化数据采集速率, 达到灵敏度和峰容量的最佳平衡图 6 显示了用安捷伦 ZORX RRHD S-C8 柱进行的茶叶分析, 说明各种数据采集速率对色谱质量的影响, 包括 UV MS 扫描 MS SIM 和 MS/MS 等检测模式用方程, 对每张色谱图的条件峰容量和信噪比计算值进行了比较可以看出所有色谱图的轮廓都是相同的质谱仪的数据采集速率比该分析所需要的快得多, 当太多数据点需要采集时, 就显示出了较快数据采集速率的负面影响最快的数据采集速率得到最窄的色谱峰, 从而获得最高的峰容量 ; 但是, 最快的数据采集速率也产生了最多的基线噪音, 使信噪比降低当灵敏度成为分析的最重要因素时, 数据采集速率应稍慢一些 ; 虽然这会减少条件峰容量将 MS 扫描与 MS/MS 检测进行比较时, 可以看出灵敏度方面出现了有趣的现象, 信噪比提高了倍 UV MS MS SIM MS/MS dmrm mu. s 6 ms 6 ms 6 ms PW / =.8 PW / =.4 PW / =.4 PW / =. S/N = 9 S/N = S/N = min mu. s 6 ms 6 ms 8 ms PW / =.8 PW / =.4 PW / =.7 PW / =. S/N = 4 S/N = 98. S/N = min mu. s 6 ms 6 ms ms PW / =.9 PW / =.7 PW / =. PW / =. S/N = 86 S/N = 74 S/N = min mu. s ms 6 ms 6 ms PW / =. PW / =. PW / =.9 PW / =.8 S/N = 8 S/N = 744. S/N = min ms 6 7 ms mu. s ms PW / =.4 6 PW / =.49 PW / =. PW / =. S/N = 9 S/N = 77 S/N = min gilent 9/64 UHPLC/MS/MS.% 醋酸水乙腈 ml/min T. % 7 停止时间 min 后运行时间 min 样品 6 µg/ml 标准品水溶液进样 µl TCC 4 C 色谱柱 gilent ZORX RRHD S-C8. mm,.8 µm DD Sig =, 4nm; 参比 = 关闭离子源 C, L/min, psi, V MS, 正离子 SIM 7, 7, 9, 9, 49, 44 dmrm 离子对 ( 裂解电压 = V) 五倍子酸 7 & 9, 7 (CE=) 表没食子儿茶素 7 & 9, (CE=) 异位儿茶素 9 & 9, (CE=) 咖啡因 9 & 8, (CE=) 表没食子儿茶素没食子酸酯 49 & 9, 89 (CE=) 异位儿茶素没食子酸酯 44 & 9, (CE=4) 图 6..8 µm 色谱柱配合 UV MS 扫描 MS SIM 和 MS/MS 不同检测器数据采集速率的比较如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN 7

8 对质谱工作者来说, 峰容量和基线分离并不一定是最重要的因素但在类似于本例的分析中, 检测到 4 对相同质量单位的差向异构体, 要对其进行准确可重复的定量测定, 必须进行基线分离 ; 最值得注意的是最后两个峰, 表没食子儿茶素没食子酸酯 (ECG) 和儿茶素没食子酸酯 (CG), 出峰相近, 而且质量都是 m/z 44 图 7 显示了用速度足够快的 MS 检测器对茶叶中儿茶素进行快速分析, 其中用配色显示差向异构体 ;.9 分钟左右洗脱的黑色色谱峰是本分析的关键化合物对本分析使用安捷伦 Poroshell 高效色谱柱, 分钟内所有个色谱峰都能得到基线分离, 用稍大粒径的. µm 柱是不可能做到的 P max = 8 bar gilent /64 RRLC/MS/MS.% 醋酸水乙腈. ml/min T.6.7 % 7 停止时间 min 后运行时间. min 样品 µg/ml 标准品水溶液进样. µl TCC 4 C 色谱柱 gilent Poroshell S-C8. mm,.7 µm DD Sig =, 4 nm; 参比 = 关闭离子源 C, L/min, psi, ± V 裂解电压 V MS, SIM- (69,, 89, 47, 44), SIM+ (9) 样品 : 五倍子酸 : m/z 7 表没食子儿茶素 : m/z 7 异位儿茶素 : m/z 9 咖啡因 : m/z 9 表没食子儿茶素没食子酸酯 : m/z 49 异位儿茶素没食子酸酯 : m/z 44 图 7. 用高效表面多孔.7 µm 柱进行快速 MS 扫描分析的实例如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN 8

9 图 8 显示了用 RRHD Eclipse Plus C8 柱在.4 分钟内对种镇痛剂进行的超快速分离图 7 已经表明,MS 的快速足以采集所有色谱峰的足够数据点, 即使出现共洗脱峰上方的总离子流图 (TIC) 显示有几个部分共洗脱的色谱峰, 尤其是在托美汀周围, 用红色箭头标明由于每个化合物都能用特定的质量识别, 提取离子色谱图 (EIC) 可以让分析人员分别浏览各个组分, 恰如底部色谱图 ( 托美汀 m/z 7EIC) 所示分别显示 EIC 可以对任何化合物进行简单积分和定量 6 TIC P max =7 bar EIC m/z 7 ( ) EIC gilent 9/64 UHPLC/MS/MS.% 甲酸水乙腈.7 ml/min T.7 % 9 停止时间.4 min 运行后时间.7 min 样品 µg/ml 标准品水溶液进样 µl TCC 室温, 无温度控制 ( 约 4 C) 图 8. 色谱柱 gilent ZORX RRHD Eclipse Plus C8 mm,.8 µm 离子源 C, L/min, psi, V 裂解电压 V 扫描 4, ms 扫描时间,. amu 步进, 8.6 周期 /s,. ms/ 周期用质量鉴别的化合物 ( 按洗脱顺序 ): 扑热息痛 : m/z 9 非那西丁 : m/z 79 咖啡因 : m/z 94 水杨酸 : m/z 邻乙酸胺基邻酚 : m/z 9 舒林酸 : m/z 6 乙酰苯胺 : m/z 吡罗昔康 : m/z 乙酰水杨酸 : m/z 托美汀 : m/z 7 用高效.8 µm 柱进行快速 MS 扫描分析的实例如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN 酮洛芬 : m/z 4 双氟尼酸 : m/z 双氯芬酸 : m/z 9 塞来昔布 : m/z 8 布洛芬 : m/z 6 9

10 通过选择最佳流动相优化灵敏度图 9 显示了几种质谱兼容的流动相用于安捷伦 Poroshell S-C8 柱分析茶叶时的结果对比不管用什么流动相, 选择性和峰形都保持不变, 因此, 我们根据分析物的信号强度选择最佳流动相使用醋酸铵, 以及三氟醋酸流动相时, 出现明显的离子抑制两个最佳竞争者是甲酸和醋酸, 醋酸的信号略强一些最不灵敏的醋酸铵流动相与最灵敏的醋酸流动相相比, 灵敏度相差倍..% HCOOH S/N =..% CH COOH S/N =.% CF COOH. S/N = 68 mm CH COONH 4, ph.6 ( mm CH COOH ph ). S/N = (%) vs. (min) gilent /64 RRLC/MS/MS 酸化水乙腈.79 ml/min T.4.86 % 7 停止时间.6 min 后运行时间.7 min 样品 µg/ml 标准品水溶液进样 µl TCC 4 C 色谱柱 gilent Poroshell S-C8. mm,.7 µm DD Sig =, 4 nm: 参比 = 关闭离子源 C, L/min, psi, ± V 裂解电压 V MS, SIM- (69,, 89, 47, 44), SIM+ (9) 样品 : 五倍子酸 : m/z 7 表没食子儿茶素 : m/z 7 异位儿茶素 : m/z 9 咖啡因 : m/z 9 表没食子儿茶素没食子酸酯 : m/z 49 异位儿茶素没食子酸酯 : m/z 44 图 9. 使用表面多孔.7 µm 柱和质谱扫描检测, 流动相对信噪比的影响比较如需了解具体应用的更多信息, 请参考安捷伦出版物 CHCN

11 结论小粒径色谱柱, 包括亚 µm 和表面多孔 µm 柱, 改善了 LC/MS 和 LC/MS/MS 结果实验表明, 与. 和 µm 柱质谱检测结果相比, 灵敏度分离度和峰容量都有提高当样品中含有异构体需要进行精确定量, 或要从复杂基质背景中分离目标化合物, 避免共洗脱峰造成离子抑制时, 高效柱特别有用另外, 为防止 MS 检测的离子抑制, 优化分析物的峰形选择性和灵敏度时, 还应考虑流动相的选择更多信息以上数据为典型结果如需了解我们产品和服务的更多信息, 请访问我们的网站

12 安捷伦对本文中可能存在的错误, 以及由于提供展示或使用本文造成的损失不承担责任本文中的信息描述和性能指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 中国印刷年 7 月日 99-86CHCN

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