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彪糠詹
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1 ICS B 41 团体标准口蹄疫病毒 O A 和 Asia1 型分型荧光 RT-PCR 检测方法 Real-Time RT-PCR for Detection of Foot and Mouth Disease Viruses serotype O, A and Asia1 ( 征求意见稿 ) xx-xx 发布 xx -xx 实施发布

2 前言本标准按 GB/T 给出的规则起草本标准不涉及专利本标准由提出并归口本标准起草单位 : 中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人 : 刘湘涛何继军林密马维民杨光杨亚民高鹏程靳野郑海学郭建宏王传彬刘玉良 I

3 口蹄疫病毒 O A 和 Asia1 型分型荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围本标准规定了口蹄疫病毒 O A 和 Asia1 型分型荧光 RT-PCR 检测技术要求和结果判定本标准适用于临床发病动物水泡皮水泡液反刍动物食道 - 咽部分泌物 (O-P 液 ) 及其他组织和病毒培养物中口蹄疫病毒核酸检测 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 3 试剂 GB 实验室生物安全通用要求 GB/T 口蹄疫诊断技术 GB/T 口蹄疫病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 3.1 总 RNA 提取试剂无核酶水 : 将焦碳酸二乙酯 (DEPC) 按 0.1% 的量 (w/v) 加入三蒸水中制备的无 DNA 酶和 RNA 酶水 ( 附录 A.1) 推荐使用商品化无核酶水 Trizol 裂解液 : 商品化试剂,4 保存三氯甲烷 : 分析纯, 常温保存异丙醇 : 分析纯, 常温保存使用前预冷至 % 乙醇 : 无水乙醇 ( 分析纯 ) 与无核酶水按 3:1 配制而成使用前预冷至 -20 2

4 3.1.6 核酸提取等效方法和试剂 : 可采用等效 RNA 提取方法, 如采用离心柱磁珠法自动化核酸提取仪等提取核酸, 分别使用配套试剂 3.2 Real-time RT-PCR 试剂 2 Real-time RT-PCR 缓冲液热启动 Taq DNA 聚合酶 (5 U/µL) PrimeScript 反转录酶混合液 RNA 酶抑制剂 (40 U/µL) 3.3 引物和探针序列 O 型上游引物序列为 :5 -GCTCTTTCCCCACCAGTTCA-3 ; 下游引物序列为 : 5 -TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA-3 ; 探针序列为 :5 -CGGACGAACATGACGGCGCACA-3, 其 5 端和 3 端分别标记 FAM 和 BHQ A 型分型上游引物序列为 :5 -TTGCACTTCATGTTTACTGGCT-3 ; 下游引物序列为 : 5 -CGTGTCCCATTCTGCGTGG-3; 探针序列为 :5 -ACGCCACCGGACACACCTGAGAA-3, 其 5 端和 3 端分别标记 CY5 和 BHQ Asia1 型分型上游引物序列为 :5 -CCGACGGCTTCACACTGA-3 ; 下游引物序列为 : 5 -AGAAGTAGTACGTCGCAGACC-3 ; 探针序列为 :5 -CTCACCCAGCCCAAGAGCACCC-3, 其 5 端和 3 端分别标记 HEX 和 BHQ 配制反应体系时,3 条上游引物 3 条下游引物和 3 条探针分别等量混合, 成为混合上游引物混合下游引物和混合探针 3.4 阳性对照和阴性对照阳性对照 : 口蹄疫病毒培养物灭活抗原阴性对照 : 无核酶水 4 主要仪器设备荧光 PCR 仪组织匀浆器高速台式冷冻离心机生物安全柜等 5 操作步骤 3

5 5.1 样品采集样品采集按照 GB/T 进行 5.2 样品处理生物安全措施 : 样品处理过程中的生物安全要求和措施, 按照 GB19489 进行组织样品处理 : 将采集的发病动物病料或组织, 置组织匀浆器中充分研磨,0.04 mol/l PBS(pH 7.4)( 附录 A.2) 制成 1:5~1:10 组织悬液,4 浸毒,3000 r/min 离心 10 min, 取上清液备用水泡液 O-P 液样品处理 : 直接用于检测病毒培养物 : 病毒接种本动物实验动物后的发病病料等组织样品, 按照处理病毒接种细胞培养物直接检测 5.3 病毒 RNA 提取若使用传统的 Trizol 裂解方法提取病毒 RNA, 参照以下步骤进行操作取已处理的待检样品阳性对照和阴性对照各 200 µl, 分别置于 1.5 ml 离心管中, 每管加入 1000 µl Trizol 裂解液, 充分混匀, 室温静置 3~5 min 在每管中加入 200µL 氯仿, 涡旋震荡 15 秒, 室温下放置 2~3min 后,4,12000 r/min, 离心 10 min 吸取约 500µL 上层水相, 置于新的离心管中, 加入等量异丙醇, 充分混匀, 室温静置 15 min 4,12000 r/min, 离心 10 min, 小心倒干液体, 留下 RNA 沉淀加 1000 μl 75% 乙醇, 颠倒洗涤沉淀,4,10000 r/min, 离心 5 min, 小心倒干液体, 室温干燥 5 min~10 min 在每管中加 20 μl 无核酶水溶解 RNA 提取的 RNA 可立即用于荧光 RT-PCR 反应, 也可 -70 冰箱保存备用若使用病毒 RNA 提取试剂盒, 按试剂盒说明书操作 5.4 荧光 RT-PCR 检测 4

6 5.4.1 反应液配制, 采用 25μL 反应体系, 扩增体系配制如下 : 2 一步 RT-PCR 缓冲液 12.5 µl Ex Taq HS (5 U/µL) 0.5 µl PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 µl 混合上游引物 (10 µmol/l) 0.5 µl 混合下游引物 (10 µmol/l) 0.5 µl 混合探针 (5 µmol/l) 1 µl 样品及对照总 RNA 2 µl 无核酶水 7.5 µl 扩增程序 :42 反转录 15 min;95 预变性 3min;95 变性 10 s,60 退火 30 s,40 次循环探针检测设置 FAM CY5 和 HEX 三种荧光信号在退火结束时收集荧光 5.5 结果判定分析条件设置 : 基线以仪器给出的默认值作为参考, 阈值设定原则以阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整试验成立条件 : 阴性对照在 FAM CY5 和 HEX 通道检测无 Ct 值且无扩增曲线 ; 阳性对照在 FAM CY5 和 HEX 通道检测 Ct 值 25, 并且有明显对数扩增曲线, 试验结果成立 5.6 判定标准若 FAM 检测通道有对数扩增曲线, 且 Ct 值 30, 可判样品为口蹄疫病毒 O 型阳性 ; 若 30<Ct 值 35, 可判样品为口蹄疫病毒 O 型可疑若 CY5 检测通道有对数扩增曲线, 且 Ct 值 30, 可判样品为口蹄疫病毒 A 型阳性 ; 若 30<Ct 值 35, 可判样品为口蹄疫病毒 A 型可疑若 HEX 检测通道有对数扩增曲线, 且 Ct 值 30, 可判样品为口蹄疫病毒 Asia1 型阳性 ; 若 30<Ct 值 35, 可判样品为口蹄疫病毒 Asia1 型可疑若 CY5 FAM HEX 检测通道均无扩增曲线或 Ct 值 >35, 可判样品为口蹄疫病毒 A 型 O 型和 Asia1 型阴性 5

7 附录 A ( 规范性附录 ) 溶液的配制 A.1 无核酶水 1 升三蒸水中加入 1mL DEPC, 充分摇匀,37 放置 12h 以上, 再经 121 高压灭菌 15min 分装备用 A mol/L PBS(pH 7.4) 预先配制 0.1 mol/l 磷酸盐缓冲液 (PBS,pH 7.4): 氯化钠 (NaCl) 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) 磷酸二氢钠 (NaH 2 PO 4 ) 加蒸馏水至 0.04mol/L PBS(pH 7.4) 配制 : g g 2.03 g 1000 ml 0.1 mol/l PBS 400 ml 蒸馏水 600 ml 121 高压灭菌 30 min, 室温或 4 冰箱保存 6

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,