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1 10-08 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Code No.QPK-201,QPK-201T) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN

2 目录 [1] 前言... 1 [2] 本产品的组成...2 [3] 其他必需品... 3 [4] 使用方法... 4 [5] 常见问题... 8 [6] 相关产品...10 注意本产品为科研用试剂请勿作为诊断临床试剂使用此外, 对于本产品的有害性调查还不十分全面, 因此, 在使用时, 请严格遵守实验室的一般注意事项, 适当使用保护用品, 安全操作本产品是在与 F. Hoffmann-La Roche Ltd. Roche Molecular Systems Inc. 及 The Perkin-Elmer Corporation 的特许合同约定下销售的 Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain Reaction (PCR) process for The Research Field in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process is covered by the up-front license fee, either by payment to Perkin-Elmer or as purchased, i.e., an authorized thermal cycler. LightCycler TM 是 Idaho Technology Inc. 和 Roche Molecular Systems Inc. 的商标 TaqMan 是 Roche Molecular Systems Inc. 的注册商标 SYBR 是 Molecular Probes Inc. 的注册商标 ABI PRISM 是 The Perkin-Elmer Corporation 的注册商标

3 [1] 前言本产品是在 Taq DNA polymerase 基础上开发的通用性很高的 Realtime PCR 用 2 浓度的预混液, 已包含除引物和样品 DNA 以外的所有组分适用于以 cdna DNA 为样品的 SYBR Green Ⅰ 掺入法检测, 可获得重复性良好的结果本产品特征 1. 高通用性本产品适用于各种常见实时定量 PCR 仪 : 1) 产品中添加了 BSA, 能够应用于 Roche 公司的 LightCycler TM 以及其它使用 Glass Capillary 的分析体系 ; 2) 产品中还添加了 Passive Reference( 内含 1 浓度 ROX reference dye), 可应用于 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 实时定量 PCR 仪经确认, 使用其它仪器的时候, 即使不使用 Passive Reference, 也不会对实验本身造成影响本说明书仅以 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 和 Roche 公司的 LightCycler TM 为例进行说明, 供使用者参考对于其他厂家的实时定量 PCR 仪, 请使用者根据仪器说明书, 并结合实际情况进行适当调整 2. 快速热启动为了抑制非特异性反应, 本产品中添加了抗 Taq DNA 多聚酶的单克隆抗体进行热启动此方法的优点是酶活力的释放极快, 在 1 分钟内即可完成预变性各循环的变性步骤只需考虑核酸变性所需的时间进行设定即可如果使用 LightCycler TM 等高速 PCR 仪, 则更能显示出其缩短时间的优越性 3. 操作简便由于采用了 2 Master Mix 体系, 已经把除引物模板之外的酶 Buffer dntp 等预混在一起, 因而减少了操作步骤, 既缩短了加样时间, 又降低了污染的几率 < 关于 SYBR GreenⅠ 检测体系 > SYBR GreenⅠ 检测体系通过 SYBR GreenⅠ 染料与 DNA 的扩增产物结合, 并且结合后染料的荧光强度的增强作为指标, 进行检测 1

4 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司虽然该方法和普通的 PCR 反应一样简便, 但由于会出现引物二聚体目的条带以外的扩增产物等, 因此有必要在扩增后对融解曲线进行分析确认 [2] 本产品的组成本产品分为两个包装,50μl 反应体系可用 40 次份 (QPK-201T) 和 200 次份 (QPK-201) <QPK-201T> SYBR Green Realtime PCR Master Mix 1 ml <QPK-201> SYBR Green Realtime PCR Master Mix 1 ml x 5 该组分是包含反应缓冲液 SYBR GreenⅠ dntps Mg 2+ Taq DNA 聚合酶及抗 Taq 单克隆抗体的 2 预混液请添加模板 DNA 和引物, 并用灭菌蒸馏水配制成 1 浓度后再使用该溶液中已包含 1 浓度 ROX(Passive reference dye) < 注意 > 本产品原则上在 -20 以下避光冷冻保存但是, 如果在短期内需持续使用时, 可于融解后在 4 避光保存, 此时最长可保存 2 个月保存时请使用避光箱或产品内配有的铝箔袋 5 支装的 QPK-201 包装内另外还添附有一个铝箔袋, 建议逐支融解使用融解后, 于 4 状态保存, 并尽量在 3 周内使用完毕融解后的产品短期内不用时, 请装入原包装袋, 再次于 -20 状态下进行避光冷冻保存 ( 本公司经实验确认, 反复冻融 20 次对产品质量没有明显影响 ) 为保证实验效果, 请在收到产品的一年之内使用完毕垂询电话 :

5 [3] 其他必需品除本产品外, 还需准备以下试剂和仪器 (1)Realtime PCR 仪本产品适用于普通及高速的模块型 (Block Type) 玻璃毛细管型(Glass Capillary Type) 等各种 Realtime PCR 仪请使用者根据各仪器说明书, 结合实际情况进行适当调整本书仅以 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 和 Roche 公司的 LightCycler TM 为例进行说明, 供使用者参考 (2) 引物请根据目的基因的序列设计引物对, 引物设计对实时定量 PCR 实验的精确度和重现性非常重要以下列举了设计引物时需注意的一般事项 - 引物长度请设定为 20~30mer GC 含量为 40~60% - 扩增片段应小于 200bp, 如可能请尽量设定在 50~150bp 过长的片段容易导致扩增效率低下, 而且容易导致非特异性反应, 影响定量准确性 - 引物设计应尽量横跨内含子, 以防止基因组 DNA 的扩增而引起假阳性 (3) 模板 DNA cdna 1st Strand cdna 合成产物请使用苯酚氯仿处理乙醇沉淀等方法提纯 1st strand cdna 合成时的引物, 可采用随机引物或者 Oligo(dT) n 引物, 请注意引物用量对于后续 PCR 反应的影响如果使用本公司的 1st Strand cdna 合成试剂盒 ReverTra Ace -α- ( Code: FSK-100 ), 请稀释 10 倍以上使用原液也可以进行扩增, 但 cdna 合成时的引物或逆转录酶会对 PCR 产生影响, 因此, 建议稀释后使用添加量不应超过总反应体系的 10% 过量的添加会大大改变 PCR 反应缓冲液的组成, 导致定量性低下本公司的 Realtime PCR 用逆转录试剂盒 ReverTra Ace qpcr RT Kit(Code No.FSQ-101), 通过改良组分, 使带入到 Realtime PCR 反应体系的逆转录反应液的影响降到最小, 即便在 PCR 反应体系中添加最多至 20% 的液量, 也能表现出良好的反应曲线 3

6 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司基因组 DNA 请使用普通 PCR 用的 DNA 纯化样品如果是人类基因组 DNA,1~10ng 比较适当如果加入大量基因组 DNA, 会检测出基因组本身的信号, 导致基线上飘 (4) 蒸馏水请使用普通 PCR 用灭菌蒸馏水 [4] 使用方法 4.1 ABI PRISM 7700 的 SYBR Green 掺入法使用说明 (1) 反应液的配制试剂添加量终浓度蒸馏水 16 μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix 25 μl 1x 上游引物 (10 μm ) 2 μl 0.4 μm 下游引物 (10 μm ) 2 μl 0.4 μm 样品溶液 5 μl Total volume 50 μl 将 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 设定为反应体系的 1/2, 其他的组成成份请参照最适条件进行调整如需改变反应体系的总体积, 其他组成成份也应按相同比例改变引物的添加量请在终浓度 0.2~0.6 μm 的范围内进行调整若扩增效果不理想, 增加引物的添加量会有所改善, 但添加量过多, 则可能会由于非特异性扩增的原因, 出现信号检出率低的情况实际配制时, 可先将除样品溶液之外的其他组份预混成 n+α 倍 (n 为样品数, α 为分注损耗 ) 的混合液, 然后分注到各管 ( 即 n 管 ), 最后在每管中分别加入相应的样品溶液 (2)PCR 的循环条件垂询电话 :

7 [PCR 循环 ( 例 1)]( 三步法, 退火温度 60 / 延伸温度 72 ) 95 60s PCR 循环 ( 40 循环 ): 95 15s 60 15s 72 45s(data collection) 融解曲线分析 (Melting Curve Analysis) [PCR 循环 ( 例 2)]( 两步法, 退火 / 延伸温度 60 ) 95 60s PCR 循环 ( 40 循环 ): 95 15s 60 60s(data collection) 融解曲线分析 (Melting Curve Analysis) 首先请尝试三步法 ( 例 1) 退火温度请根据引物的 Tm 值在之间进行调整根据引物的不同, 有时最佳温度可能超出此范围, 此时请根据实际情况调整本产品因可以在极短时间内完成多聚酶的再活性化, 所以最初变性时间 60 秒, 各循环变性时间 15 秒即可达到良好的扩增效果请注意, 绝大多数情况下, 最初变性时间 1 分钟就足够了, 过分加热会影响酶的活性, 特别要注意避免变性时间超过 5 分钟请将 Detector 设为 SYBR,Quencher 设为 None 详细设置请参照仪器说明书实时定量 PCR 中目标片段通常都很小, 一般不需调整延伸时间, 如需变更, 请务必确保 data collection 步骤在 30 秒以上上述实例的循环设置采用的是三步法此外也可采用两步法作为 PCR 的循环条件, 此时请将 data collection 设置在退火 / 延伸步骤 ( 即将退火 / 延伸步骤合并在一起 ) 融解曲线分析请根据各仪器的标准设定详细请见各仪器的使用说明书 5

8 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 4.2 Roche Light Cycler TM 的 SYBR Green 掺入法使用说明 (1) 反应液的配制试剂添加量终浓度蒸馏水 6.4 μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μl 1x 上游引物 (10 μm ) 0.8 μl 0.4 μm 下游引物 (10 μm ) 0.8 μl 0.4 μm 样品溶液 2 μl Total volume 20 μl 将 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 设定为反应体系的 1/2, 其他的组成成份请参照最适条件进行调整如需改变反应体系的总体积, 其他组成成份也应按相同比例改变引物的添加量请在终浓度 0.2~0.6 μm 的范围内进行调整若扩增效果不理想, 增加引物的添加量会有所改善, 但添加量过多, 则可能会由于非特异性扩增的原因, 出现信号检出率低的情况实际配制时, 可先将除样品溶液之外的其他组份预混成 n+α 倍 (n 为样品数, α 为分注损耗 ) 的混合液, 然后分注到各管 ( 即 n 管 ), 最后在每管中分别加入相应的样品溶液 (2) PCR 的循环条件 [PCR 循环 ( 例 )]( 三步法退火温度 55 / 延伸温度 72 ) 95 30s PCR 循环 ( 40 循环 ): 95 5s 55 10s 72 15s(data collection) 融解曲线分析 (Melting Curve Analysis) 垂询电话 :

9 退火温度请根据引物的 Tm 值在之间进行调整根据引物的不同, 有时最佳温度可能超出此范围, 此时请根据实际情况调整首先, 请尝试退火温度 55 退火时间 10 秒若扩增效果不理想, 可将退火时间延长至 20 秒 ; 若出现引物二聚体等非特异性反应, 可将退火时间缩短至 5 秒本产品因可以在极短时间内完成多聚酶的再活性化, 所以最初变性时间 30 秒, 各循环变性时间 5 秒即可达到良好的扩增效果请注意, 绝大多数情况下, 最初变性时间 1 分钟就足够了, 过分加热会影响酶的活性, 特别要注意避免变性时间超过 5 分钟对于 200bp 以内的目标片段, 延伸 15 秒通常已经足够如需调整, 请确保 data collection 步骤在 10 秒以上 ( 仪器数据采集方式限定 ) Detector 设为 F1 另外, 通常可将 Temperature Transition Rate 全部设为 20 /sec( 最大 ) 详细设置请参照仪器使用说明书上述实例的循环设置采用的是三步法如果发生了非特异性反应也可尝试采用两步法, 此时请将 data collection 设置在退火 / 延伸步骤 ( 即将退火 / 延伸步骤合并在一起 ) 融解曲线分析请根据各仪器的标准设定详细请见各仪器的使用说明书 7

10 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 [5] 常见问题扩增曲线混乱或没有仪器设置方面的问题 ( 请参照相关仪器的说明书 ) 原因 Detector 的设置与荧光染料不匹配数据采集的设置不恰当样品位置设置错误仪器方面的其他故障或不匹配对策根据荧光染料的种类不同, 对检测仪器的设置进行相应的更改, 然后再进行实验请调整设置再进行实验设置适当的样品位置后再进行分析或再进行实验请根据各仪器的说明书进行检查试剂方面的问题原因 PCR 反应条件引物的浓度序列等不恰当样品纯度不好对策可通过调整引物浓度 PCR 反应条件等加以改善扩增不理想时, 一般可尝试降低退火温度延长退火时间或提高引物浓度在少数情况下, 提高退火温度或延长延伸时间也会有改善另外, 对于 GC 含量高的目的片段, 延长变性时间也会有改善仍不能改善时, 建议重新设计引物 DNA 样品可通过苯酚抽提乙醇沉淀等方法提纯后再进行实验 ; 如样品为 cdna, 逆转录酶的残留会有一定的影响定量值重现性差仪器设置方面的问题 ( 请参照相关仪器的说明书 ) 原因仪器方面的故障或不匹配对策因为仪器的不适用, 在温度管理或检测时会产生扩增曲线散乱的情况此时请根据相应仪器的说明书进行检查垂询电话 :

11 试剂方面的问题样品纯度不好原因 PCR 反应条件引物的浓度序列等的不恰当计量误差对策不纯的样品会导致扩增曲线散乱, 请使用充分混匀的样品如样品为 cdna, 逆转录酶的残留会有一定的影响通过苯酚抽提或乙醇沉淀等方法提纯后再进行实验扩增效率差的 PCR 容易产生扩增曲线散乱的情况此时, 可通过调整引物的浓度 PCR 其他反应条件等来改善扩增效果一般可尝试降低退火温度延长退火时间或提高引物浓度有时延长延伸时间也会有改善对于 GC 含量高的目的片段, 延长变性时间也会有改善扩增曲线散乱较严重时, 建议重新设计引物反应体积太小会导致检测精度下降请根据定量 PCR 仪推荐的反应体积重新实验空白样品中有信号请在融解曲线分析 (Melting Curve Analysis) 的基础上进行判断融解曲线的顶点所对应的温度与阳性样品的温度相同原因阳性样品或 PCR 产物等的污染对策首先请更换用作空白样本的水如果还发生同样情况, 请分别更换蒸馏水引物或另启用一管新的 Master Mix 后再进行实验融解曲线的顶点所对应的温度比阳性样品低原因发生了引物二聚体等的非特异性反应对策调整引物的浓度或 PCR 其他反应条件出现非特异性反应时, 一般可尝试提高退火温度缩短退火延伸时间, 或降低引物浓度进行三步法 PCR 的操作也可能改善仍得不到改善时, 建议重新设计引物 9

12 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司 [6] 相关产品 SYBR GreenⅠ 检测体系用 Realtime PCR 试剂品名容量 Code No. THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix 1ml x 1 (40 次份 ) QPS-201T 1.67ml x 3 (200 次份 ) QPS-201 SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- 1ml x 5 (200 次份 ) QPK-212 THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix 中,50X ROX reference dye 另外单独添付 SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus- 中,Plus solution 另外单独添付容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数 TaqMan 探针法检测体系用 Realtime PCR 试剂品名容量 Code No. THUNDERBIRD Probe qpcr Mix 1ml x 1 (40 次份 ) QPS-101T 1.67ml x 3 (200 次份 ) QPS-101 Realtime PCR Master Mix 1ml x 5 (200 次份 ) QPK-101 THUNDERBIRD Probe qpcr Mix 中,50X ROX reference dye 另外单独添付容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数 Realtime PCR 用 cdna 合成试剂盒品名容量 Code No. ReverTra Ace qpcr RT Kit 200 次份 FSQ 步法 Realtime PCR 相关试剂品名容量 Code No. 各种荧光 Probe 荧光引物检测体系用 1 步法 Realtime PCR 试剂 RNA-direct Realtime PCR Master Mix SYBR Green I 检测体系用 1 步法 Realtime PCR 试剂 RNA-direct SYBR Green Realtime PCR Master Mix RNA-direct 系列中,50mM Mn(OAc) 2 另外单独添付容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数 0.5ml x 5 (100 次份 ) 0.5ml x 5 (100 次份 ) QRT-101 QRT-201 垂询电话 :

13 [ 制造销售商 ] 东洋纺 ( 上海 ) 生物科技有限公司上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室邮编 : 交货期限订货相关咨询 Tel: Fax: sales@bio-toyobo.cn 产品内容技术相关咨询 Tel: Fax: tech@bio-toyobo.cn 代理商资料 :

实时定量PCR的全套解决方案

实时定量PCR的全套解决方案 12-03 THUNDERBIRD SYBR qpcr Mix (Code No.QPS-201,QPS-201T) 使用说明书科研用 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN 目录 [1] 前言... 1 [2] 本产品的组成... 2 [3] 其他必需品... 3 [4] 使用方法... 5 [5] 相关 Protocol: RNA