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泳隙管
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1 一般实验室使用, 仅用于体外通用植物总 RNA 大量提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 用于快速提取各种动植物细胞 / 组织基因组和 RNA 目录号 :RP3311(5 次 ) RP3312(10 次 ) 使用手册 2008 年 11 月, 第 1 版北京百泰克生物技术有限公司 BioTeke Corporation 地址 : 北京海淀区留学人员创业园电话 : 传真 : 网址 : info@bioteke.com 北京百泰克生物技术有限公司 Bioteke Corporation

2 目录一试剂盒组成储存稳定性一试剂盒组成储存稳定性 1 二原理简介 2 三试剂盒特点 2 四注意事项 2 五操作步骤 4 六疑难解答 6 试剂盒组成保存 5 次 (RP3311) 10 次 (RP3312) 裂解液 PL 室温 (-20 长期 ) 55 ml 110 ml 去蛋白液 RE 室温 50ml 100ml 漂洗液 RW 4 一个月 (-20 25ml 25ml*2 长期 ) 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H 2 O 室温 10ml 20ml 22.5ml RNase-free H 2O 45mlRNase-free H 2O 70% 乙醇室温第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free 过滤柱室温 5 个 10 个 RNase-free 吸附柱 RA 室温 5 个 10 个收集管 (50ml) 室温 10 个 20 个本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果注意事项 1. 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量乙醇, 加入后请及时打钩标记已加入乙醇, 以免多次加入! 2. 所有的溶液应该是澄清的, 如果环境温度低时溶液可能形成沉淀, 此时不应该直接使用, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清 3. 不合适的储存于低温 (4 或者 -20 ) 会造成溶液沉淀, 影响使用效果, 因此运输和储存均在室温下 (15-25 ) 进行 4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 PH 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子

3 二原理简介本产品是 BioTeke 自主开发的独特产品, 其原理完全不同于异硫氰酸胍 / 酚 / 氯仿提取方法, 克服了后者不能区分 RNA ( 本质上是多糖 ) 和其他植物多糖的缺点, 能高效将 RNA 和其他植物多糖分开, 同时还能有效去除多酚和其他植物次级代谢成份, 适合于绝大部分用 TRIZOL 和 QIAGEN Rneasy mini kit 无法提取的植物, 并在近一百多种各类植物 ( 包括十分棘手的松柏类植物 ) 中得到验证本产品还可以用于富含粘性糖蛋白的动物组织三试剂盒特点 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜, 柱与柱之间吸附量差异极小, 可重复性好克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端 2. 稳定性好纯度高方便快捷的优点, 不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程,RNA 可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题 3. 多次漂洗去蛋白过程, 提取 RNA 纯度更高四注意事项 ( 实验前必须首先阅读这部分!) 1. 为防止 RNA 降解, 所有离心步骤如未加说明, 均在 4 低温进行使用转速可以达到 10,000 rpm 的传统台式离心机. 2. 裂解液 PL 和去蛋白液 RE 中含有刺激性有害化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤眼睛和衣服若沾染皮肤眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗 3. 预防 RNase 污染, 在实际的操作中应遵循以下指南 ( 参见分子克隆 ) * 全程佩戴一次性手套皮肤经常带有细菌和霉菌, 可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶的来源培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染 * 使用灭菌的一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA, 避免使用公共仪器所导致的 RNA 酶交叉污染 * 使用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿玻璃器皿可以在 150 C 的烘箱中烘烤 4 小时, 塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟, 用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用 4. 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析 RNA 的质量好的 RNA 产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体 RNA 带, 分别为 ~5Kb(28S),~2Kb(18S), 条带亮度比值约为 2:1 有时候也可以看到 ~0.1kb 和 0.3Kb(5S,tRNA) 带但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到 4,5 条带也属于正常现象, 如果 RNA 未成熟的前体或者不均一核 RNA 小核 RNA 提取出来也可能看到介于 7Kb 和 15Kb 之间的不连续的高分子量条带 5. 检测 OD 260 /OD 280 吸光度比值时,RNA 样品应该溶于 TE 后检测, 如果用水稀释后检测, 由于一般水离子强度和 PH 值低, 会使 OD 280 升高, 从而使比值降低五操作步骤 * 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量乙醇! 事先将裂解液 PL 65 C 预热, 使用前加入 β- 巯基乙醇到终浓度 0.2% 1. 匀浆处理取 1~2g 植物组织于液氮中研磨, 时间要短, 要保持研钵中有液氮组织样品容积不能超过 PL 容积的 10%) 2. 转移样品至已事先加入 10ml 裂解液 PL 的 50ml RNase free 离心管中, 涡旋振荡混匀, 避免有团块存在, 在 65 C 条件下孵育 10 分钟以使核

4 蛋白体完全分解, 期间颠倒混匀几次 3. 室温 (15-20 C ) 条件下 10,000rpm 离心 10 分钟, 小心取上清转入一个新的 RNase free 过滤柱中 ( 若上清表面有漂浮物, 用枪头挑开吸取下面液体即可 ) 4. 室温 8,000rpm 离心 60 秒收集下滤液 ( 含有总 RNA) 于收集管中, 进行下一步操作 5. 在收集管中加入 1 倍体积 70% 乙醇 ( 请先检查是否已加入无水乙醇!), 上下颠倒混匀 ( 在富含淀粉或者多糖的样品中会出现混匀后溶液浑浊现象, 此时过柱会出现堵柱情况, 请在混匀后先 8,000rpm 离心 60 秒, 取上清液转入吸附柱 RA 中 ) 将得到的溶液转入吸附柱 RA 中 ( 吸附柱套在收集管内, 柱容 10ml), 溶液太多可以分次过柱 6.4 C 10,000rpm 离心 60 秒, 弃掉废液, 将吸附柱重新套回收集管 7. 加 10ml 去蛋白液 RE,4 C 10,000rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 8. 加入 10ml 漂洗液 RW( 请先检查是否已加入无水乙醇!),4 C 10,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 9. 加入 10ml 漂洗液 RW,4 C 10,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 10. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,4 C 10,000 rpm 离心 3 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 11. 取出吸附柱 RA, 放入一个新的 50ml RNase free 离心管中, 根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 μl RNase free water( 事先在水浴中加热效果更好 ), 室温放置 3 分钟,10,000 rpm 洗脱体积越大, 洗脱效率越高, 如果需要 RNA 浓度较高, 可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积最好不少于 500μl, 体积过小降低 RNA 洗脱效率, 减少 RNA 产量 12. DNA 去除, 请参考相关说明书以 Promega RQ1 RNase-Free Dnase 为例在 2ml RNase free 离心管加入下列溶液 RQ1 RNase-Free DNase 50μl RQ1 DNase 10 Reaction Buffer 50μl RNA 400μl a. 37 反应 30 分钟 b. 加入等体积的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1) 涡旋混匀室温,10,000 rpm 5 min 离心, 取上清 c. 加入 50 μl 3 M 醋酸钠,1250 μl 冷乙醇, 冰上放置 10 min d. 4,10,000 rpm 15 min 离心, 弃上清 e. 加入 70% 冷乙醇洗净,4,10,000 rpm 5 min 离心, 弃上清 f. 沉淀干燥 g. 用适量的 RNase Free dh2o 溶解后, 进行 Agarose 电泳检测六疑难解答 (Trouble shooting) 见后页表格离心 3 分钟如果需要更多的 RNA, 可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 离心 3 分钟, 或者另外再加 500μl RNase free water, 离心 1 分钟, 合并两次洗脱液

5 出现的问题可能的原因建议解决方法产量低样品裂解或者匀浆不彻底液氮研磨的时候尽量研磨完全, 加入裂解液 PL 后剧烈震荡或者接前表出现的问题可能的原因建议解决方法用枪头吹打帮助裂解匀浆步骤污染了蛋白或者苯酚可以提高产量新鲜组织或者植 RNA 降解, 完整性不 RNA 提取所用各种物品按照注意事项准备 RNA 提取的各种物组织可以不需液氮, 直接在干佳和试剂没有灭活 RNA 酶用品净研钵内加入适量裂解液 PL 直组织取出后没有马上处理组织应该尽量立刻处理, 不能及时处接研磨或冷冻, 提取前已经降解理的应该尽快保存于 RNAfixer 液使用的样品或者裂解物在存放时间过长可能降低 RNA 产氮或者或者 -70 存放太量, 应尽快的处理样品或者裂解提取的 RNA 样品没有保尽可能的将 RNA 保存在 -70 的低久物存在 -20 或 -70 低温温组织本身含 RNA 少不同类型的组织和细胞含有不同样品提取过程中降解提取动作应该尽可能的快, 离心应该量的 RNA, 对于含量少的组织应低温进行, 取用 RNA 时尽量冰上进该适当提高起始处理量行超过了吸附柱的最大吸附同一个样品使用多个吸附柱, 然下游的 RT-PCR 实验忘记做步骤 10, 或者将吸确保做了步骤 10, 然后小心取出吸能力后合并得到 RNA 不成功附柱取出时下端碰到了收附柱, 可以在空气中晾几分钟, 让残漂洗液 RW 内忘记加乙醇第一次实验时, 漂洗液 RW 瓶和集管里面的漂洗液, 造成留乙醇挥发 70% 乙醇瓶中加入指定量无水乙洗脱下来的 RNA 含有乙醇醇, 乙醇抑制了逆转录反 OD 260/OD 280 吸光度比分光光度计检测吸光度检测时用 TE 稀释样品应值 <1.6 时,RNA 样品不是溶于 TE, 而是溶于水低离子浓度和低 ph 条件下, OD 280 值会较高, 造成比值低

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远泰生物技术有限公司目录一般实验室使用, 仅用于体外通用植物总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 目录号 :RP3301(50 次 ) RP3302(100 次 ) 一试剂盒组成储存稳定性 1 二原理简介 2 三试剂盒特点 2 四注意事项 2 使用手册 2008 年 11 月, 第 1 版五操作步骤 4 六疑难解答 6 北京百泰克生物技术有限公司 Bioteke Corporation 一