前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A 为资料性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC369) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准主要起草单位 : 广东省实验动物监

Size: px

Start display at page:

Download "前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A 为资料性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC369) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准主要起草单位 : 广东省实验动物监"

涯水
5 years ago
Views:

1 ICS B 44 中国实验动物学会团体标准 T/CALAS x-201x 实验动物多瘤病毒普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Methods of conventional PCR and real-time PCR for the detection of Polyoma virus ( 征求意见稿 ) 201x-xx-xx 发布 201x-xx-xx 实施中国实验动物学会发布

2 前言本标准按照 GB/T 给出的规则编写本标准附录 A 为资料性附录本标准由中国实验动物学会归口本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC369) 技术审查本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草本标准主要起草单位 : 广东省实验动物监测所本标准主要起草人 :xx,xx I

3 实验动物多瘤病毒普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 1. 范围本标准规定了实验动物多瘤病毒普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法本标准适用于实验动物及其产品细胞培养物实验动物环境和动物源性生物制品中多瘤病毒 (Poly) 的检测 2. 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注明日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 GB 实验室生物安全通用要求 3. 缩略语下列缩略语适用于本标准 Ct 值荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 (cycle threshold) DNA 脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid) PBS 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline) PCR 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction) Poly 多瘤病毒 (Polyoma virus) 实时荧光 PCR 实时荧光聚合酶链式反应 (real-time PCR) 4. 检测方法原理用合适的方法提取样本中的病毒 DNA, 针对病毒核酸序列 T-antigen 基因设计特异的引物和探针序列, 分别通过 PCR 和实时荧光 PCR 对模板 DNA 进行扩增, 根据 PCR 和实时荧光 PCR 检测结果判定该样品中是否含有病毒核酸成分采用实时荧光 PCR, 可以减少检测过程的污染风险, 同时实时荧光 PCR 比普通 PCR 检测灵敏度要高, 可用于普通 PCR 检测结果的验证 PCR 的基本工作原理是以拟扩增的 DNA 分子为模板, 以一对分别与模板 5' 末端和 3' 末端互补的寡核苷酸片段为引物 (primer), 在耐热 DNA 聚合酶的作用下, 按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA 分子合成重复这一过程, 即可使目的 DNA 片段得以大量扩增实时荧光 PCR 则设计合成一对特异性引物和一条特异性探针, 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被 1

4 淬灭基团吸收 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5' 3' 外切酶活性将探针酶切降解, 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 淬灭作用消失, 荧光信号产生并被检测仪器接受, 随着 PCR 反应的循环进行,PCR 产物与荧光信号的增长呈对应关系 5. 主要设备和材料 5.1 实时荧光 PCR 仪 5.2 PCR 仪 5.3 电泳仪 5.4 凝胶成像分析系统 5.5 Nanodrop 紫外分光光度计 5.6 高速冷冻离心机 5.7 台式离心机 5.8 恒温孵育器 5.9 漩涡振荡器 5.10 组织匀浆器或手持式均质器 5.11 生物安全柜 5.12 PCR 工作台冰箱,-20 冰箱,2-8 冰箱 5.14 微量移液器 (10μL,100μL,1000μL,) 5.15 无 RNase 和 DNase 污染的离心管 (1.5mL 2mL 5mL 15mL), 无 RNase 和 DNase 污染的吸头 (10μL,200μL,1mL), 无 RNase 和 DNase 污染的 0.2 ml PCR 扩增反应管 5.16 采样工具 : 剪刀镊子注射器等 6. 试剂除特别说明外, 所有实验用试剂均为分析纯 ; 实验用水为去离子水 6.1 灭菌 PBS 见附录 A 6.2 无 DNAase/RNase 去离子水 6.3 DNeasy Blood & Tissue Kit, DNA 抽提试剂盒或其他等效产品 6.4 普通 PCR 试剂 : Premix Taq Version 2.0 (Loading dye mix) 或使用其他等效试剂 6.5 DNA 相对分子质量标准 6.6 TAE 电泳缓冲液见附录 A 6.7 溴化乙锭 :10mg/mL, 配制方法见附录 A, 或其他等效产品 2

5 % 琼脂糖凝胶, 配制方法见附录 A 6.9 实时荧光 PCR 试剂 :Premix Ex Taq (Probe qpcr) Kit 或其他等效产品 6.10 引物和探针 : 根据表 1 和表 2 的序列合成普通 PCR 引物和实时荧光 PCR 引物及探针, 引物和探针加无 RNase 去离子水配制成 10μmol/L 和 5μmol/L 储备液,-20 保存表 1: 普通 PCR 引物序列引物名称 Forward primer Reverse primer 引物序列 (5 3 ) ATGTGCACAGCGTGTA TGTCATCGGGCTCAGC 产物大小 (bp) 369 引物和探针名称 Forward primer Reverse primer Probe 表 2: 实时荧光 PCR 扩增引物和探针引物和探针序列 (5 3 ) CGGCGTCTCTAAATGCGAG AGCAGTTTGGGAACGGGTG FAM - CAAAATGTACAAAGGCCTGTCCAAGACCC -BHQ1 产物大小 (bp) 检测方法 7.1 生物安全措施实验操作及处理按照 GB 的规定, 由具备相关资质的工作人员进行相应操作 7.2 采样及样本的处理采样过程中样本不得交叉污染, 采样及样品前处理过程中须戴一次性手套脏器组织活体动物采用安乐死方法进行处死, 剖检, 剖检, 无菌采集动物的肾脏脾脏肿瘤组织乳腺组织唾液腺颌下腺胸腺和肠系膜淋巴结, 剪取待检样品 2.0g 于无菌 5mL 离心管, 加入 4mL 灭菌 PBS, 使用电动匀浆器充分匀浆 1~2 分钟, 然后将组织悬液在 4, 3000r/min 离心 10min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用盲肠内容物或粪便 : 无菌采集取约 1g 的盲肠内容物或 1-2 颗粪便置于无菌 5mL 离心管, 加入 4mL 灭菌 PBS, 使用电动匀浆器充分匀浆 1~2 分钟,12,000 rpm 离心 10min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用细胞培养物方法一 : 直接刮取样品接种后出现 CPE 或可疑的细胞培养物于 15mL 离心管中, 3

6 3000r/min 离心 10min, 去上清, 加 1mL 灭菌 PBS 重悬细胞, 然后将细胞悬液转移到无菌 1.5mL 离心管中, 编号备用方法二 : 将样品接种后出现 CPE 或可疑的细胞培养物反复冻融三次, 细胞混悬液转移于 15mL 离心管中,12000r/min 离心 10min, 去细胞碎片, 上清液转移到无菌 15mL 离心管中, 编号备用实验动物环境实验动物饲料垫料和饮水取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中, 加入适量灭菌 PBS( 饲料和垫料需全部浸泡于液体中 ) 密封后浸泡 5~10min, 充分混匀, 将混悬液转移至 15mL 离心管中, 4, 12,000 rpm 离心 10min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用取适量实验动物饮水直接转移到无菌 5mL 离心管中, 编号备用实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物, 将拭子置入灭菌 15mL 离心管, 加入适量灭菌 PBS, 浸泡 5~10min, 充分混匀, 取出棉拭子, 将离心管于 4, 12,000 rpm 离心 10min, 取上清液转入另一无菌 5mL 离心管中, 编号备用样本的存放采集或处理的样本在 2~8 条件下保存应不超过 24h, 若需长期保存, 须放置 -80 冰箱, 但应避免反复冻融 ( 冻融不超过 3 次 ) 7.3 样本 DNA 提取 : 取 200ul 已处理好的组织匀浆液至 1.5 或 2ml 离心管中, 加 20ul 蛋白酶 K 加入 200ul 缓冲液 AL, 涡旋震荡充分混匀,56 孵育 10min 加入 200ul 的无水酒精, 涡旋震荡充分混匀移取步骤 3 的混合液至离心柱上, 离心柱放在 2ml 收集管上, 6000g(8000rpm) 离心 1 分钟弃收集管 / 液离心柱放至新的 2ml 收集管上, 加 500ul 的缓冲液 AW1, 6000g(8000rpm) 离心 1 分钟弃收集管 / 液离心柱放至新的 2ml 收集管上, 加 500ul 的缓冲液 AW2,20000g(14000rpm) 离心 3 分钟弃收集管 / 液将离心柱放在一个新的 1.5 或 2ml 收集管上, 吸 200ul 的缓冲液 AE 在吸附膜上, 室温 1 分钟, 6000g(8000rpm) 离心 1 分钟 4

7 7.3.7 使用 Nanodrop 紫外分光光度计测定 DNA 浓度和质量 (A260/A280 比值 ) 制备好的 DNA 应尽快进行下一步 PCR 反应, 若暂时不能进行 PCR 反应, 应于 -80 冰箱保存备用 7.4 普通 PCR 检测普通 PCR 反应体系普通反应体系见表 3 反应液的配制在冰上操作, 每次反应同时设计阳性对照阴性对照和空白对照, 其中阳性对照以含有多瘤病毒的组织或细胞培养物提取的 DNA 作为阳性对照模板, 其中阴性对照以不含有多瘤病毒 DNA 样本 ( 可以是正常动物组织或正常细胞培养物 ) 作为阴性对照模板, 空白对照即为非模版对照 (No Template Control,NTC) 表 3 PCR 反应体系试剂用量终浓度 2 Premix Taq Mix (Loading dye mix) 10μL 1 ddh2o 6μL PCR Forward Primer(10μM) 0.8μL 0.4μM PCR Reverse Primer(10μM) 0.8μL 0.4μM DNA 模版 2μL 总体积 20.6μL 普通 PCR 反应参数普通 PCR 反应参数见表 4 表 4 普通 PCR 反应参数步骤温度时间循环数预变性 94 5min 1 变性 95 30sec 退火 55 30sec 40 延伸 72 30sec 后延伸 72 5min 1 注 : 可使用其他等效的 PCR 检测试剂盒进行, 反应体系和反应参数可做相应调整 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测和拍照 PCR 反应结束后, 取 10μL PCR 产物在 1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳检测, 以 DL2000Marker 作 DNA 分子量参照电泳条件 : 电压 120V, 电泳时间 25min, 当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源电泳完成后在凝胶成像系统拍照记录电泳结果 7.5 实时荧光 PCR 检测 5

8 7.5.1 实时荧光 PCR: 实时荧光 PCR 反应体系见表 5 反应液的配制在冰上操作, 每次反应同时设计阳性对照阴性对照和空白对照, 其中阳性对照以含有多瘤病毒的组织或细胞培养物提取的 DNA 作为阳性对照模板, 其中阴性对照以不含有多瘤病毒 DNA 样本 ( 可以是正常动物组织或正常细胞培养物 ) 作为阴性对照模板, 空白对照即为非模版对照 (No Template Control,NTC) 表 5 实时荧光 PCR 反应体系反应组分用量终浓度 2 Premix Ex Taq Mix Forward Primer(10μM) Reverse Primer(10μM) Probe(5μM) Rox(50 ) cdna 模版 ddh2o 总体积 10μL 0.8μL 0.8μL 1μL 0.4μL 2μL 5μL 20μL 1 400nM 400nM 250nM 注 : 试剂 Rox 只在具有 Rox 荧光校正通道的实时荧光 PCR 仪上进行扩增时添加, 否则用水补齐实时荧光 PCR 反应参数实时荧光 PCR 反应参数见表 6, 试验检测结束后, 根据收集的荧光曲线和 Ct 值判定结果表 6 实时荧光 PCR 反应参数步骤温度时间循环数采集荧光信号预变性 95 30sec 1 否变性 95 5sec 否 40 退火, 延伸 60 34sec 是注 : 可使用其他等效的实时荧光 PCR 检测试剂盒进行, 反应体系和反应参数可做相应调整 8. 结果判定 8.1 普通 PCR 结果判定质控标准 : 阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现预期大小 (369bp) 的目的扩增条带则表明反应体系运行正常, 否则此次试验无效, 需重新进行普通 PCR 扩增对样本进行普通 PCR 检测, 如果阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现预期 6

9 大小 (369bp) 的扩增条带, 而样本未出现预期大小 (369bp) 的扩增条带, 则可判定样本未检出多瘤病毒如果阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照和样本出现预期大小 (369bp) 的扩增条带, 则可判定样本检出多瘤病毒 8.2 实时荧光 PCR 结果判定结果分析和条件设定 (Ma et al., 2013) 直接读取检测结果, 基线和阈值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整, 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准质控标准空白对照无 Ct 值, 并且无荧光扩增曲线, 一直为水平线阴性对照无 Ct 值, 并且无荧光扩增曲线, 一直为水平线阳性对照 Ct 值应 35, 并且有明显的荧光扩增曲线, 则表明反应体系运行正常, 否则此次试验无效, 需重新进行实时荧光 PCR 扩增结果判定若待检测样品无荧光扩增曲线, 则判定样品未检出多瘤病毒若待检测样品有荧光扩增曲线, 且 Ct 值应 35 时, 则判断样品中检出多瘤病毒若待检测样品 Ct 值介于 35 和 40 之间时, 应重新进行实时荧光 PCR 检测重新检测后, 若 Ct 值 40 时, 则判定样品未检出多瘤病毒重新检测后的 Ct 值仍介于 35 和 40 之间, 则判定样品检出多瘤病毒 8.3 序列测定必要时, 可取待检样本扩增出的阳性 PCR 产物进行核酸序列测定, 序列结果与已公开发表的多瘤病毒特异性片段序列进行比对, 序列同源性在 90% 以上, 可确诊待检样本多瘤病毒核酸阳性, 否则判定多瘤病毒核酸阴性 7

10 附录 A ( 资料性附录 ) 溶液的配制 A mol/l ph7.2 磷酸盐缓冲液 (PBS) 的配制 A.1.1 A 液 0.2 mol/l 磷酸二氢钠溶液 : 称取磷酸二氢钠 (NaH2PO4 H20) 27.6g, 先加适量去离子水溶解, 最后定容至 1000 ml, 混匀 A.1.2 B 液 0.2 mol/l 磷酸氢二钠溶液 : 称取磷酸氢二钠 NaH2PO4 7H2O53.6g( 或 Na2HPO4 12H2O 71.6g 或 Na2HPO4 2H2O 35.6g), 先加适量去离子水溶解, 最后定容至 1000mL, 混匀 A mol/l ph7.2 磷酸盐缓冲液 (PBS) 的配制取 A 液 14mL,B 液 36mL, 加氯化钠 (NaCl)8.5g, 加 800 ml 无离子水溶解稀释, 用 HCl 调 ph 至 7.2, 最后定容至 1000 ml, 经 121 高压灭菌 15min, 冷却备用 A.2 50 TAE 电泳缓冲液 A mol/L 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA) 溶液 (ph8.0) 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA -Na2 H g 灭菌去离子水 80mL 5mol/L 氢氧化钠溶液调 ph 至 8.0 灭菌去离子加至 100mL,121,15min 灭菌备用 A TAE 电泳缓冲液配制羟基甲基氨基甲烷 (Tris) 242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L EDTA 溶液,pH8.0 l00ml 灭菌去离子加至 1000mL,121,15min 灭菌备用用时用灭菌去离子水稀释至 l 使用 A.3 溴化乙锭 (EB) 溶液 (10μg/μL) 溴化乙锭 20mg 8

11 灭菌去离子水 20mL A.4 含 0.5μg/mL 溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶的配制琼脂糖 1.5g 1 TAE 电泳缓冲液加至 l00ml 混合后加热至完仝融化, 待冷至 50 ~55 时, 加溴化乙锭 (EB) 溶液 5μL, 轻轻晃动摇匀, 避免产生气泡, 将梳子置人电泳槽中, 然后将琼脂糖溶液倒人电泳板上, 待凝固后取下梳子备用 9

ICS B 44 T/CALAS x-201x 实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Method of conventional PCR and real-time fluorescent PCR for the d

ICS B 44 T/CALAS x-201x 实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Method of conventional PCR and real-time fluorescent PCR for the d ICS 65.020.30 B 44 T/CALAS x-201x 实验动物螺杆菌普通 PCR 和实时荧光 PCR 检测方法 Laboratory animals - Method of conventional PCR and real-time fluorescent PCR for the detection of Helicobacter sp. ( 征求意见稿 ) 201x-xx-xx 发布