目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容运输及储存条件试剂盒组分信息 Foregene Revers

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岑泳卫
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2 目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容运输及储存条件试剂盒组分信息 Foregene Reverse Transcriptase Foregene HotStar Taq DNA Polymerase 注意事项操作前准备事项 RNA 模板浓度实验材料和设备自备试剂安全性操作指南操作示意图问题分析指南 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 2 / 14

3 产品介绍 RT-PCR Easy TM II(Two Step) 包含两步法 RT-PCR 的全部试剂, 将 RT 反应和 PCR 反应结合在同一个试剂盒中, 提供了优化的 RT Mix 和 PCR Mix 独特的 RT Mix, 能简便高效的合成高质量的第一链 cdna, 2 PCR Easy TM Mix Plus 具有高效的特异性扩增, 两者的有机结合使得目的基因的检测更加灵敏产品特点可以快速准确的对 RNA 进行实时定量分析试剂盒使用独特的 Foregene 反转录试剂和 Foregene HotStar Taq DNA Polymerase 相结合, 并配合独特的反应体系, 有效提高反应的扩增效率和特异性优化的反应体系使得反应具有更高的检测灵敏性, 更强的热稳定性, 更好的耐受性试剂盒应用方便快捷, 可广泛用于 cdna 的克隆, 基因检测等分子实验特别适合对高 GC 含量或具有复杂二级结构的 RNA 模板进行分析产品质量控制按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 (FOREGENE s Total Quality Management System), 每一批次的 RT-PCR Easy TM II(Two Step) 试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 3 / 14

4 试剂盒内容 RT-PCR Easy TM II(Two Step) 两步法 RT-PCR 试剂盒试剂盒组成 RT RT 次 (20μl 体系 ) 500 次 (20μl 体系 ) 2 RT Easy TM Mix 1ml 1.7ml 3 2 PCR Easy TM Mix Plus 1ml 1.7ml 3 Random Primer (50μM) 200μl 1ml Oligo(dT)18 Primer (50μM) 200μl 1ml RNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 说明书 1 份 1 份运输及储存条件 1. 输运条件全程低温冰盒运输, 保证试剂盒处于 <4 状态 2. 保存条件试剂盒保存于 -20 产品收到后立即存放于 -20 恒温冰箱中如果存储条件适当, 产品在 1 年有效期内不会降低任何性能试剂盒组分信息 2 RT Easy TM Mix:Foregene Reverse Transcriptase RNase Inhibitor dntps 反应缓冲液优化剂和稳定剂 2 PCR Easy TM Mix Plus :Foregene Taq DNA Polymerase dntps Mg 2+ 反应缓冲液优化剂稳定剂 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 4 / 14

5 Foregene Reverse Transcriptase Foregene 逆转录酶能够提供高效特异性强的逆转录反应逆转录酶表现出很高的亲和力, 并在 50 C 反应温度条件下仍然保持良好的逆转录活性, 能够很好的逆转录其他逆转录酶不能处理的二级结构复杂的 RNA Foregene Reverse Transcriptase 灵敏度高, 使用的 RNA 量范围广泛 (0.1pg RNA 1μg) Foregene HotStar Taq DNA Polymerase 提供了 PCR 的高度特异性扩增反转录进行时,DNA 聚合酶是完全无效的, 不妨碍反转录反应后通过 PCR 反应程序, 加热到 94 C, 激活 DNA 聚合酶同时, 失活逆转录酶热启动过程消除了第一个循环时非特异性退火的引物和引物二聚体的形成, 保证 PCR 扩增的高度特异性和可靠性注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 试剂应避免反复冻融, 否则会导致试剂性能下降或失效建议使用新鲜样品提取或 -80 条件下保存的模板 RNA(RNA 应避免反复冻融 ) 为避免 RNase 污染, 实验操作请在 RNase-Free 空间进行 ; 所用的枪头 PCR tube 都必须保证是 RNase-Free 的 ; 并佩戴一次性手套和口罩本试剂盒必须配合特异引物进行实验, 请根据实验需要选择需要扩增的基因的特异引物使用前, 将 2 RT Easy TM Mix 2 PCR Easy TM Mix Plus 置于冰上使其完全融化, 轻弹混匀后使用 ; 体系的配制请在冰浴上操作, 以提高试剂盒性能, 提高 PCR 扩增的特异性 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 5 / 14

6 操作前准备事项强烈建议用户在本试剂盒使用前仔细阅读说明书 RT-PCR Easy TM II(Two Step) 操作简单方便快捷, 说明书提供了整个试剂盒的正确使用方法请在使用前准备好必要的实验材料和设备模板 RNA 浓度 RT-PCR Easy TM II(Two Step):(0.1pg-5μg total RNA)/20μl 体系实验材料和设备常规 PCR 仪或荧光定量 PCR 扩增仪微量移液器和 RNase-Free 枪头冰浴自备试剂 RNA 模板基因特异 PCR 引物安全性本产品仅供科研使用, 请勿用于医药临床医疗食品及化妆品等用途使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 6 / 14

7 操作指南 A-1: 材料及试剂准备 1. 准备制备好的 RNA 模板 ( 建议使用 Foregene Total RNA Isolation Kit 系列试剂盒提取纯化 RNA) 特异引物(10μM) 及相关的耗材仪器注意 : 请确保 RNA 的完整性, 尽量使用新鲜样品提取的 RNA 2. 将 2 RT Easy TM Mix RNase-Free ddh 2 O 置于冰浴上, 使其自然融化, 并轻弹管壁混匀待用 A-2:RT 体系配制 2 RT Easy TM Mix 使用方便快捷, 最大程度上避免操作过程中的污染以及多次配制反应体系带来的实验误差使用时只需取反应体系一半体积 ( 如 : 反应体系为 20μl, 则取 10μl 2 RT Easy TM Mix 溶液 ), 加入 RNA 模板和逆转录引物, 并加 RNase-Free ddh 2 O 补足体积 20μl 具体的 RT 反应体系配制可参考下表 1 表 1:RT 体系配制 RT-PCR 体系添加内容用量 2 RT Easy TM Mix 10μl Random Primer(50μM) or Oligo(dT)18 Primer(50μM) or Specific Primer(2μM) Template(RNA) RNase-FreeddH 2 O Total Volume 1μl 1μl 1μl Xμl (Total RNA:<5μg / mrna:<0.5μg) (9-X)μl 20μl A-3:RT 反应程序设置 1. 参照上表配制好 RT 体系后, 轻轻混匀 ( 可使用枪头轻轻吹打 ; 也可在涡旋仪上瞬时混匀并瞬时离心收集散落在管壁或管盖的液体, 放置于冰盒上待用 ) 2. 参照 RT 反应程序设置 ( 表 2) 设置反应的温度时间等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 7 / 14

8 注意 : 为了保证 Mix 的活性和提高其扩增效率, 最好在待金属浴达到设置的反应温度 ( 逆转录温度 42 或 50 ) 之后再进行 RT 反应体系的配制, 以便体系配制完成后立即进入反应程序也可以在 PCR 仪上进行 RT 反应表 2:RT 反应程序设置步骤温度时间内容 1 42 或 min 复性 & 逆转录 min 失活注意 : 使用 Random primer 时, 在第一步反应前, 应先进行 25,10min 预热反应以上程序仅作参考, 实际反应条件视模板引物等的结构条件不同而各异对具有复杂二级结果的 RNA 模板, 第一步反应温度建议使用反应产物可直接用于后续试验, 或储存 -20 长达一周长期储存建议 -80 条件下, 避免反复冻融 B: PCR 鉴定反应 B-1:PCR 反应体系配制使用 A 步骤合成的 cdna 作为模板, 配合试剂盒中提供的 2 PCR Easy TM Mix Plus 进行 PCR 反应将 2 PCR Easy TM Mix Plus cdna RNase-Free ddh 2 O 置于冰浴上, 使其自然融化, 并轻弹管壁混匀待用具体的 PCR 体系配制参照下表 3 表 3:PCR 反应体系配制 RT-PCR 体系添加内容用量终浓度 2 PCR Easy TM Mix Plus 10μl 1 Forward Primer (10μM) 0.5μl μM 1* Reverse Primer (10μM) 0.5μl μM 1* Template(cDNA) Xμl 1-2μl RNase-FreeddH 2 O Total Volume (9-X)μl 20μl 1*: 通常引物终浓度为 μM 可以得到较好结果反应性能较差时, 可以在 μM 范围内调整引物浓度 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 8 / 14

9 B-2:PCR 反应条件设置 1. 参照上表配制好 PCR 体系后, 轻轻混匀 ( 可使用枪头轻轻吹打 ; 也可在涡旋仪上瞬时混匀并瞬时离心收集散落在管壁或管盖的液体, 放置于冰盒上待用 ) 2. 参照 PCR 反应程序设置 ( 表 4) 设置反应的温度时间等注意 : 为了保证 PCR Mix 的活性和提高其扩增效率, 最好先在 PCR 仪上设置好 PCR 条件, 在进行 PCR 体系的配制表 4:PCR 反应条件设置步骤温度时间循环数内容 min 1 预变性 sec 变性 sec 退火 4 72 Xmin (2kb/min) 1* 延伸 min 1 终延伸 1*: 根据扩增的目的片段长度设定具体的时间,Foregene Taq DNA Polymerase 的扩增速度为 2kb/min 注意 :PCR 反应条件视模板引物等的结构条件不同而各异对具有复杂二级结构的 RNA 模板, 建议第一步逆转录的反应温度使用 50 在具体操作中, 需要根据目的片段大小扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 延伸时间等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 9 / 14

11 问题分析指南以下针对 RT-PCR Easy 系列试剂盒实用中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您如有任何需要可联系我们 : 或 RT-PCR 未出现目的片段 1. 模板 RNA 被降解建议 : 使用新鲜样品提取, 应用高质量高纯的 RNA( 建议使用 Foregene Total RNA Isolation Kit 系列提取纯化 RNA);-80 储存的 RNA 应避免反复冻融 2. RNA 含有抑制剂建议 : 逆转录抑制剂一般包括 SDS 胍盐 EDTA 等, 建议通过 70% 的乙醇对 RNA 沉淀进行清洗, 除去抑制剂 ; 或使用 Foregene Total RNA Isolation Kit 系列提取纯化 RNA 3. 引物设计问题建议 : 按照引物设计原则, 重新设计引物进行检查出现引物二聚体或非特异性扩增 1. RNA 中有基因组 DNA 污染建议 : 使用扩增级的 DNase I 进行处理, 设置没有逆转录的对照检测 DNA 污染 2. Mg 2+ 浓度不适合建议 : 我们提供的 Mix 中 Mg 2+ 浓度为 3.5 mm 但针对有些特殊引物和模板可能需要较高浓度的 Mg 2+, 因此可直接添加 MgCl 2 进行 Mg 2+ 浓度的优化, 建议每次增加 0.5mM 的 Mg 2+ 进行优化 3. PCR 退火温度过低建议 : 对引物做梯度 PCR, 选择合适的退火温度 4. PCR 产物太长建议 : 荧光定量 PCR 产物长度最好在 bp 之间 5. 引物出现降解, 引物降解会导致非特异性扩增出现建议 : 可使用 SDS-PAGE 电泳检测引物是否降解, 更换新的引物进行实验 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 11 / 14

12 6. PCR 体系不当, 或体系太小建议 :PCR 反应体系太小会导致检测精度降低最好使用定量 PCR 仪推荐的反应体系重新进行实验 7. PCR 循环数过多建议 : 适当降低 PCR 循环次数无扩增信号 1. RNA 模板中存在大量酶抑制因子建议 : 重新纯化模板或降低模板的使用量 2. PCR 扩增条件不适合引物序列或者浓度不当建议 : 确认引物序列的正确性以及引物没有降解 ; 扩增信号不好时, 可尝试降低退火温度, 适当调整引物浓度等 3. 模板用量问题, 太少或过多建议 : 可进行模板线性化梯度稀释, 选择 PCR 效果最好的模板浓度进行荧光定量实验负对照出现过高的荧光值 1. 在操作过程中导致的试剂污染建议 : 更换新的试剂进行 RT-PCR 实验 2. PCR 反应体系配制时发生污染建议 : 操作时进行必要的防护措施, 比如 : 戴乳胶手套, 使用带滤芯的枪头等 3. 引物出现降解, 引物降解会导致非特异性扩增出现建议 : 可使用 SDS-PAGE 电泳检测引物是否降解, 更换新的引物进行 RT-PCR 实验 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 12 / 14

13 定量值重复性差 1. 仪器故障建议 :PCR 仪的每一个 PCR 孔之间可能存在误差, 在温度管理或检测时产生重现性较差现象请根据相应仪器的说明书进行检测 2. 样品纯度不好建议 : 样品不纯会导致实验的重复性较差, 这包括模板引物的纯度最好进行模板的再纯化, 引物最好使用 SDS-PAGE 纯化 3. PCR 体系配制放置时间过长建议 :RT-PCR 体系配制好后立即用于 PCR 实验, 不要搁置太长时间 ; 建议先设置到 PCR 程序后再进行 RT-PCR 体系配制 4. PCR 扩增条件不适合引物序列或者浓度不当建议 : 确认引物序列的正确性以及引物没有降解 ; 扩增信号不好时, 可尝试调整退火温度, 适当调整引物浓度等 Copyright Foregene 2014/02. All rights reserved. 13 / 14

FOREGENE RT-PCR Easy Instruction Manual RT-PCR Easy TM I(One Step) Cat.No.RT-02011/02012 One-step RT-PCR Master Mix RT-PCR Easy TM II(Two Step) Cat.No

FOREGENE RT-PCR Easy Instruction Manual RT-PCR Easy TM I(One Step) Cat.No.RT-02011/02012 One-step RT-PCR Master Mix RT-PCR Easy TM II(Two Step) Cat.No RT-PCR Easy TM I(One Step) Cat.No.RT-02011/02012 One-step RT-PCR Master Mix RT-PCR Easy TM II(Two Step) Cat.No.RT-02021/02022 Two-step RT-PCR Master Mix RT-qPCR Easy TM I (One Step)-SYBR Green I Cat.No.RT-02111/02112

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