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魂姚
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1 2015 版药典微生物限度检查生物性能室梁泽鑫

2 主要内容微生物限度检查法概述非无菌产品微生物限度检查 ( 微生物计数法 ) 非无菌产品微生物限度检查 ( 控制菌检查法 ) 15 版药典水标准

3 微生物限度检查法概述适用范围非规定灭菌制剂及其原料辅料受微生物污染程度的方法用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数不适用于活菌制剂的检查环境要求不低于 D 级背景下的 B 级单向空气流培养条件需氧菌 :30 ~35 霉菌和酵母菌 ;20 ~25

4 微生物限度检查法概述 ( 计数法 ) 15 版药典 10 版药典分类依据营养条件微生物类别检验项目 1 需氧菌总数,3d~5d 胰酪大豆胨琼脂 / 肉汤 (TSA/B) 细菌数,3d 营养琼脂 (NA) 检验项目 2 霉菌及酵母菌总数,5d~7d 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 霉菌及酵母菌总数,5d 玫瑰红钠琼脂 (RA) 特点客观严谨检验条件不满足控制要求

5 微生物限度检查法概述 10 版药典 15 版药典细菌数营养琼脂需氧菌总数 (TAMC) 胰酪大豆胨琼脂 (TSA) 生长在 TSA 上的所有菌落 ( 包括霉菌和酵母菌 ) 霉菌及酵母菌玫瑰红钠琼脂培养基霉菌及酵母菌总数 (TYMC) 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 生长在 SDA 上的所有菌落 ( 包括细菌 ) 如果由于细菌的生长而使 TYMC 结果不符合微生物限度要求, 可使用含抗生素 ( 氯霉素庆大霉素 ) 的沙氏葡萄糖琼脂货其他选择性培养基 ( 如玫瑰红钠琼脂培养基 ) 重新进行计数

6 微生物限度检查 : 微生物计数法培养基适用性检查方法适用性检查常用计数方法 ( 平皿法 / 薄膜过滤法 /MPN 法 )

7 微生物限度检查 : 培养基适用性检查试验菌株试验菌液的制备需氧菌总数计数培养基适用性检查霉菌和酵母菌计数金黄色葡萄球菌 TSA 或 TSB,30~ 35 培养 18~24h TSA 或 TSB,30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu / 铜绿假单胞菌 TSA 或 TSB,30~ 35 培养 18~24h TSA 或 TSB,30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu / 枯草芽孢杆菌 TSA 或 TSB,30~ 35 培养 18~24h TSA 或 TSB,30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu / 白色念珠菌 SDA 或 PDA,20~ 25 培养 2~3d TSA,30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu SDA,20~25 培养不超过 5 天, 接种量不大于 100cfu 黑曲霉 SDA 或 PDA,20~ 25 培养 5~7d TSA,30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu SDA,20~25 培养不超过 5 天, 接种量不大于 100cfu

8 微生物限度检查 : 培养基适用性检查培养基适用性检查评判标准 : 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在 0.5 ~2 范围内与对照培养基上的菌落形态大小一致

9 微生物限度检查 : 方法适用性检查试验菌株试验菌液的制备需氧菌总数计数培养基适用性检查霉菌和酵母菌计数金黄色葡萄球菌 TSA 或 TSB,30~ 35 培养 18~24h TSA 或 TSB(MPN 法 ), 30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu / 铜绿假单胞菌 TSA 或 TSB,30~ 35 培养 18~24h TSA 或 TSB(MPN 法 ), 30~35 培养不超过 3d, 接种量不大于 100cfu / 枯草芽孢杆菌 TSA 或 TSB,30~ 35 培养 18~24h TSA 或 TSB(MPN 法 ), 30~35 培养不超过 5d, 接种量不大于 100cfu / 白色念珠菌 SDA 或 PDA,20~ 25 培养 2~3d TSA(MPN 法不适用 ), 30~35 培养不超过 5d, 接种量不大于 100cfu SDA,20~25 培养不超过 5 天, 接种量不大于 100cfu 黑曲霉 SDA 或 PDA,20~ 25 培养 5~7d TSA(MPN 法不适用 ), 30~35 培养不超过 5d, 接种量不大于 100cfu SDA,20~25 培养不超过 5 天, 接种量不大于 100cfu

10 微生物限度检查 : 方法适用性检查培养基适用性检查评判标准 : 平皿法 & 膜法 : 回收率在 50% ~200% 试验组的加菌回收率 = MPN 法 : 试验组的菌数应在稀释剂对照组菌数的 95% 置信限内

11 微生物限度检查 : 方法适用性检查变化试验菌株的加入方式 : 10 版药典 :1mL 供试液和 100cfu 试验菌分别注入平皿 15 版药典 : 菌液加入供试液, 所加菌液体积不超过供试液体积的 1%, 使每 ml 供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于 100cfu 不规定试验重复次数 (10 版 :3 次 ) 方法适当调整若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时, 应采用适宜的方法对供试液进行进一步处理如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除, 供试液可经过中和稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验

12 非无菌产品微生物限度检查 : 微生物计数法常用的计数方法 : 平皿法 : 倾注法和涂布法薄膜过滤法最可能数法 (Most-Probable-Number Method, 简称 MPN) 注 : 为 15 版药典新增内容, 仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法时使用不适用霉菌计数用于微生物计数时精确度较差

13 微生物计数 : 平皿法操作倾注法先加入一定量的菌液, 然后加入培养基, 混匀冷却后倒置培养涂布法将培养基冷却后, 加一定量的菌液, 用涂布器均匀涂布后, 待菌液被渗透吸收, 倒置培养特点操作方便快捷接种量为 1mL 或更多样品不可使用预制培养基培养基表面适宜好氧菌, 内部适宜兼性厌氧菌培养操作较繁琐, 增加污染几率接种量为 0.1~0.3mL 可以使用预制培养基但计数不准确表面生长, 适合好氧菌培养

14 微生物计数 : 薄膜过滤法供试品特点水溶性或油性抑菌性标准较严薄膜孔径不大于 0.45um 直径一般为 50mm 每张滤膜每次冲洗量一般为 100mL 总冲洗量不得超过 1000mL

15 微生物计数 :MPN 法 MPN 称为最大或然数 (most probable number): 应用概率理论来估算细菌浓度的方法首先将待测样品作系列稀释, 然后每个稀释度取 3 ~5 次重复接种于适宜的液体培养基中培养后, 将有菌液生长的最后 3 个稀释度 ( 临界级数 ) 中出现细菌生长的管数作为数量指标查最大或然数表, 得近似值, 再乘以稀释倍数, 得出样品单位体积中细菌数近似值

16 微生物限度检查 : 控制菌检查法序号 15 版药典 10 版药典 1 耐胆盐革兰氏阴性菌大肠菌群 2 大肠埃希菌大肠埃希菌 3 沙门菌沙门菌 4 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 5 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 6 梭菌梭菌 7 白色念珠菌白色念珠菌注 : 培养基体系有明显变化

17 微生物限度检查 : 控制菌检查法稀释液 ph7.0 氯化钠 - 蛋白胨缓冲液 PBS:pH7.2,pH6.8( 肠溶制剂 )ph7.6( 结肠溶制剂 ) 胰酪胨大豆肉汤培养基 :TSB 注 :TSB: 用于耐胆盐革兰氏阴性菌沙门菌供试液制备, 其他控制菌检查, 供试液制备不限稀释剂

18 微生物限度检查 : 控制菌检查法控制菌培养基特性试验菌株耐胆盐革兰氏阴性菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌 EE 肉汤 VRBG 琼脂麦康凯肉汤麦康凯琼脂 RVS 增菌肉汤 XLD 琼脂溴化十六烷基三甲胺琼脂 +/- +& 指示 +/- +& 指示 +/- +& 指示金黄色葡萄球菌甘露醇高盐琼脂 +& 指示 - 梭菌梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂 + - 大肠铜绿 / 金葡大肠铜绿大肠 / 金葡大肠沙门 / 金葡沙门大肠铜绿大肠金葡大肠 + 生孢梭菌白色念珠菌 SDB/SDA +/+& 指示白色念珠菌

19 耐胆盐革兰氏阴性菌分类学地位耐胆盐革兰氏阴性菌需氧及兼性厌氧, 可以耐受胆盐的革兰氏阴性无芽孢杆菌大肠菌群需氧及兼性厌氧, 在 37 能分解乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌大肠菌群不是细菌学上分类命名, 而是一组与粪便污染有关的细菌这群细菌包括 : 埃希氏菌属柠檬酸杆菌属克雷伯菌属和肠杆菌属等该菌群主要来源于人畜粪便, 作为粪便污染评价的指示菌

20 耐胆盐革兰氏阴性菌检查方法检查方法 15 版药典定性 or 定量 1:10TSB 供试液 (20~25 2h, 恢复不增殖 ) 肠道增菌肉汤 (EE) 紫红胆盐葡糖糖琼脂 (VRBG) (24h~48h) (18h~24h) 10 版药典大肠菌群取 1:10 供试液至乳糖胆盐发酵培养基管 18h~24h 曙红亚甲基蓝琼脂或麦康凯琼脂 18h~24h

21 大肠埃希菌分类学地位界 : 细菌界门 : 变形菌门纲 :γ - 变形菌纲目 : 肠杆菌目科 : 肠杆菌科属 : 埃希氏菌属种 : 大肠埃希菌 Escherichia coli

22 大肠埃希菌概述大肠埃希菌通常称为大肠杆菌, 是德国儿科医生 Theodore Escherich 在 1885 年发现的广泛存在于人和温血动物的肠道中, 能在 44.5 发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性杆菌特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性, 尤其对婴儿喝幼畜 ( 禽 ), 常引起严重腹泻和败血症

23 大肠埃希菌检查方法检查方法 15 版药典 1:10 供试液至 TSB( 适宜体积 )18h~24h 麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基 (42 ~44 24h~48h) (30 ~35 18h~72h) 10 版药典大肠菌群取 1:10 供试液至胆盐乳糖培养基 (BL) 培养 18h~24h MUG 培养基 5h 24h 在 366nm 紫外光下观察, 靛基质试验曙红亚甲基蓝琼脂或麦康凯琼脂培养 18h~24h

24 沙门菌分类学地位界 : 细菌界门 : 变形菌门纲 :γ - 变形菌纲目 : 肠杆菌目科 : 肠杆菌科属 : 沙门氏菌属

25 沙门菌概述及生物学特征 1885 年 Salmon 氏等在猪霍乱流行时, 分离出的猪霍乱沙门菌沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌, 是一群抗原结构生化特性相似的革兰氏阴性杆菌血清学繁多, 目前已发现的沙门菌有 2500 多个血清型和变种革兰氏阴性杆菌, 无芽孢, 一般无荚膜, 除鸡瘟沙门菌和鸡沙门菌外均有动力, 为周身鞭毛, 并多数由菌毛

26 沙门菌生物学特征沙门菌为兼性厌氧菌, 对营养需求不高, 在普通营养培养基上均能生长, 能够利用柠檬酸盐作为碳源在肠道选择性平板上大多数可形成无色或产 H 2 S 的菌落不分解乳糖, 大部分菌株产 H 2 S, 发酵葡糖糖产酸产气耐受胆盐, 在粪便土壤食品水中可生存 5 个月至二年之久

27 沙门菌检查方法检查方法 15 版药典 10g 供试液接种至 TSB( 适宜体积 )18h~24h RV 沙门增菌液体培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 (18h~24h) (18h~48h) 10 版药典大肠菌群 10g 供试液接种至营养肉汤培养基中 18h~24h 四硫磺酸钠亮绿培养基胆盐硫乳琼脂 / 麦康凯琼脂 (18h~24h) (18h~48h)

28 沙门菌生物学特征

29 铜绿假单胞菌分类学地位界 : 细菌界门 : 变形菌门纲 :γ - 变形菌纲目 : 假单胞菌目科 : 假单胞菌科属 : 假单胞菌属种 : 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

30 铜绿假单胞菌概述俗称绿脓杆菌, 是假单胞菌属的代表菌种, 是一种常见的条件致病菌, 在琼脂平板上能产生蓝绿色绿脓素专性需氧菌, 生长温度范围 25 ~42, 最适生长温度 25 ~30, 特别是该菌在 4 不生长而在 42 可以生长的特点可以用以鉴别营养要求低, 潮湿处易生长研究表明, 水与铜绿假单胞菌存在联系紧密医院内长期潮湿的地方及湿的物品时铜绿假单胞菌贮存的场所

31 铜绿假单胞菌检查方法检查方法 15 版药典 1:10g 供试液至 TSB( 适宜体积 )18h~24h 划线接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂 (18h~72h) 10 版药典大肠菌群 1:10 供试液接种至胆盐乳糖培养基中 18h~24h 划线接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂 (18h~72h) 10 版与 15 版选择性培养基相同, 增菌液有差异!

32 金黄色葡萄球菌分类学地位界 : 细菌界门 : 厚壁菌门纲 : 芽孢杆菌纲目 : 芽孢杆菌目科 : 微球菌科属 : 葡萄球菌属种 : 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus

33 金黄色葡萄球菌概述葡萄球菌属微球菌科, 本菌有 19 个菌种, 从人体上可检出 12 个种葡萄球菌属主要与人皮肤腺体和温血动物的粘膜相关, 有些种是人及动物的条件致病菌可引起人的化脓性炎症, 又称为化脓性球菌

34 金黄色葡萄球菌生物学特性金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形, 直径 0.4~ 1.2µm, 大小不一, 平均直径为 0.8µm 革兰氏染色阳性, 呈葡萄串状排列, 无鞭毛, 无芽孢需氧或兼性厌氧, 最适生长温度 37, 耐盐性强, 在含 10%~15% 的氯化钠培养基中仍能生长, 可用于筛选菌种血平板上可形成明显透明溶血环, 为 β 型溶血

35 金黄色葡萄球菌检查方法检查方法 15 版药典 1:10g 供试液至 TSB( 适宜体积 )18h~24h 划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基 (18h~72h) 10 版药典大肠菌群 1:10 供试液接种至营养肉汤或亚碲酸盐肉汤培养基中 18h~24h 划线接种于甘露醇氯化钠琼脂 (14h~72h) 10 版与 15 版选择性培养基相同, 增菌液有差异! 抑制能力 : 大肠埃希菌接种量不大于 103, 接种量过大, 大肠埃希菌可生长!

36 梭菌分类学地位界 : 细菌界门 : 厚壁菌门纲 : 梭菌纲目 : 梭菌目科 : 梭菌科属 : 梭菌属

37 梭菌概述能形成芽孢厌氧生长的革兰氏阳性杆菌因芽孢比菌体大, 致使菌体呈梭状而得名代表菌种 : 生孢梭菌破伤风梭菌产气荚膜梭菌和肉毒梭菌等

38 白色念珠菌分类学地位界 : 真菌界门 : 子囊菌门纲 : 酵母纲目 : 酵母目科 : 酵母科属 : 假丝酵母属种 : 白假丝酵母菌 Candida albicans

39 白色念珠菌概述细胞呈圆形或卵圆形, 直径 3~6µm, 革兰氏染色阳性以出芽方式繁殖, 呈链状生长

40 梭菌 & 白色念珠菌检查方法梭菌检查方法取相当于 1g 样品至梭菌增菌培养基厌氧培养 48h 涂抹接种于哥伦比亚琼脂平板上厌氧培养 48h~72h 白色念珠菌取相当于 1g 样品至 SDB 培养 3d~5d 划线接种于 SDA 培养 24~48h 10 版与 15 版梭菌和白色念珠菌检查所用培养基无大变化

试液进行计数方法适用性试验若供试品污染的微生物数较多, 低稀释级供试液可能影响微生物回收结果, 因此, 应选择低微生物污染的样品或选择适宜稀释级的供试液进行方法适用性试验 (1) 试验组取上述制备好的供试液, 加入试验菌液, 混匀, 使每 1ml 供试液加菌量不大于 100cfu (2) 供试品对

试液进行计数方法适用性试验若供试品污染的微生物数较多, 低稀释级供试液可能影响微生物回收结果, 因此, 应选择低微生物污染的样品或选择适宜稀释级的供试液进行方法适用性试验 (1) 试验组取上述制备好的供试液, 加入试验菌液, 混匀, 使每 1ml 供试液加菌量不大于 100cfu (2) 供试品对中药饮片微生物限度检查法中药饮片微生物限度检查法用于检查中药材及中药饮片的微生物污染程度包括微生物计数和控制菌检查微生物计数包括需氧菌总数霉菌和酵母菌总数和耐热菌数检查控制菌检查包括耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌沙门菌的检查中药饮片微生物限度检查的试验环境应符合微生物限度检查的要求检验全过程必须严格遵守无菌操作, 防止再污染, 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出单向流空气区域