==arug=bvaluation=oesearch== 第 QN 卷 = 第 S 期 ==OMNU 年 S 月 = =NMRT= = 曲安奈德原料药微生物总数检查法验证 = 郭俊玲 = 天津生物工程职业技术学院, 天津 ==PMMNSN= 摘 == 要 : 目的 == 建立曲安奈德的微生物限度检查

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1 NMRT 曲安奈德原料药微生物总数检查法验证 郭俊玲 天津生物工程职业技术学院, 天津 PMMNSN 摘 要 : 目的 建立曲安奈德的微生物限度检查法并进行验证 方法 按平皿法对大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 R 种试验菌分别进行 P 次独立的平行试验, 并分别计算各试验菌每次试验的回收率, 以验证细菌 霉菌及酵母菌计数方法的可行性 结果营养琼脂培养基中添加 MKMMNBqqC 菌体显色剂能有效地对细菌着色, 保证细菌计数的准确性 ; 用 NMMmi 加 NMg 聚山梨酯 UM 的方法制备样品液,R 种试验菌均取得了很好的回收率 (>TMB) 结论 所建立的曲安奈德原料药的细菌 霉菌及酵母菌的计数方法是可行的 关键词 : 微生物检查 ; 平皿计数法 ; 方法验证 中图分类号 :ovotkno 文献标志码 :A 文章编号 :NSTQJSPTSEOMNUFMSJNMRTJMR alfwnmktrmnljkássnknstqjsptskomnukmskmon salidationqestsformicrobiologicalexaminationofqriamcinoloneacetonideamf drlgunäáng qá~njánsoc~íáon~äcoääegeof_áoengáneerángiqá~njánpmmnsnichán~ AbstractWlbjective qoesí~bäásh~mácrobáoäogác~ääámáííesíforqrá~mcánoäone~ceíonádeamf ~ndveráfyáíkjethodsqhree ándeéendeníé~r~ääeäíesíswereéerformedonfáveíesísír~ánsofbscherichiak coliiptaphylococcus aureusibacillus subtilisicandida albicansi~ndaspergillus niger~ccordángíoíheéä~íemeíhodkqherecoveryofe~chíesísír~ánw~sc~äcuä~íediíoveráfyíhefe~sábáäáíy ofb~cíerá~imoäds~ndye~síscounímeíhodskoesults qhe~ddáíáonofmkmmnbqqcb~cíerá~ächromogenácre~genííoíhenuíráení~g~r medáumcouädeffecíáveäysí~áníheb~cíerá~~ndensureíhe~ccur~cyofíheb~cíerá~äcouníkqhesíeráäeéetkmsodáumchäorádejéeéíone buffernmmmiéäusnmgoféoäysorb~íeumw~susedíoéreé~reíhes~méäesoäuíáoni~nd~ääíhefáveíesísír~áns~cháevedgoodrecovery E[TMBFKConclusion qhemeíhodsforcouníángíheb~cíerá~imoäds~ndye~sísofqrá~mcánoäone~ceíonádeamfw~sfe~sábäek heywordswmácrobáoäogác~äex~mán~íáonxéä~íejcounímeíhodsxmeíhodv~äád~íáon 曲安奈德是一种具有较强且较持久抗炎 抗过敏作用的糖皮质激素 xnz, 以肌内注射为例, 肌内注射后在数小时内生效, 作用可维持 O~P 周 xoz 曲安奈德可用于各种皮肤病 ( 如神经性皮炎 湿疹 牛皮癣等 ) 支气管哮喘 过敏性鼻炎 关节痛 肩周围炎 腱鞘炎 急性扭伤 慢性腰腿痛及眼科炎症等的治疗 xpz, 在口腔扁平苔藓 口腔黏膜下纤维化 重型阿弗他溃疡 口腔颌面血管瘤 颌骨中央性巨细胞肉芽肿 颞下颌关节紊乱等口腔疾病治疗中亦取得较好疗效 xqz 微生物的生长受许多因素的影响, 在检查药品中污染的微生物时, 微生物的抗性 样品的处理方法 测定样品的浓度 测定方法 培养基 培养条 收稿日期 :OMNTJNMJOQ 第一作者 : 郭俊玲 (NVSV ), 主要从事制剂方向研究 bjm~áäwguojunäángmonr]noskcom 件等, 将直接影响检查结果, 所以美国药典 欧洲 xrz 药典 中国药典中, 微生物限度检查均要求进行方法验证 中国药典 OMNR 年版规定, 当建立产品的微生物限度检查法时, 应进行细菌 霉菌及酵母菌计数方法的验证, 以确认所采用的方法适合于该产品的细菌 霉菌及酵母菌数的测定 若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时, 计数方法应重新验证 验证时, 按供试液的制备和细菌 霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行 对各试验菌的回收率应逐一进行验证 验证试验至少应进行 P 次独立的平行试验, 并分别计算各试验菌每次试验的回收率

2 NMRU 当建立曲安奈德产品的微生物限度检查法时, 因激素产品不溶于水或稀释液, 样品液制备中需用表面活性剂 聚山梨酯 UM 进行乳化 ; 菌落计数时白色药渣会影响菌落的辨识, 所以细菌检查用培养基中需加入细菌菌体显色剂 ; 这两种物质的使用是否会对微生物有毒性, 从而影响微生物的生长, 影响菌数的准确计数, 所以要进行验证 本验证包括细菌 霉菌及酵母菌计数方法 平皿计数法的验证, 以确定所采用的方法适合于该产品的细菌 霉菌及酵母菌数的测定 ; 按平皿法对大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 R 种试验菌分别进行 P 次独立的平行试验, 并分别计算各试验菌每次试验的回收率, 以验证细菌 霉菌及酵母菌计数方法的可行性 N 材料和方法 NKN 材料 大肠埃希菌 CjCCE_FQQNMPJS 金黄色葡萄球菌 CjCC(_)OSMMPJOT 枯草芽孢杆菌 CjCC(_) SPRMNJNP 白色念珠菌 CjCC(c)VUMMNJNR 黑曲霉 CjCC(c)VUMMPJV, 购自中国食品药品检定研究院 ; 营养琼脂培养基 玫瑰红钠培养基, 北京三药科技开发公司出品 ;OKPKRJ 氯化三苯基四氮唑, 天津福晨化学试剂厂出品 ; 聚山梨酯 UM, 天津中和盛泰化工有限公司出品, 购自天津药检所 NKO 菌液制备 NKOKN 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌菌液制备 分别接种大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基内培养 NU~OQh, 用 MKVB 无菌氯化钠溶液连续稀释至 NM S, 制得含菌数为 RM~NMMcfuLmi 的大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌的 P 种细菌菌悬液 NKOKO 白色念珠菌菌液制备 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基内培养 OQ~QUh 用 MKVB 无菌氯化钠溶液连续稀释至 NM S, 制得含菌数为 RM~NMMcfuLmi 的白色念珠菌酵母菌悬液 NKOKP 黑曲霉菌液制备 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基内培养 R~Td, 加入 P~ RmiMKVB 无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱 然后, 用管口带有薄的无菌棉花或纱布 ( 能过滤菌丝 ) 的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内, 用 MKVB 无菌氯化钠溶液连续稀释至 NM S, 制得含孢子数为 RM~NMMcfuLmi 的黑曲霉孢子悬液 NKP 样品液制备 准备 P 份, 每份 NMMmi,QR C 保温 在 P 份上述溶液中, 分别加入 R NM NRg 无菌聚山梨酯 UM, 充分振摇使乳化 取 P 份供试品, 每份 NMg, 于 P 个无菌研钵中, 分别加入上述 VM mi( 分别内含 R NM NRg 聚山梨酯 UM), 充分研磨, 制得 P 份供试品的 N NM 悬浮液, 待用 NKQ 培养基准备 NKQKNNBqqC 溶液的制备 称取 OKPKRJ 氯化三苯基四氮唑 MKNg 溶于 NMmi 纯化水中,NON NRmán 灭菌后即得 NKQKO 培养基制备 将 Q 份营养琼脂培养基加热溶化, 放凉至 SM 左右, 一份 NMMMmi 营养琼脂培养基加入 NmiNBqqC 溶液, 摇匀, 制得 MKMMNB qqc 营养琼脂培养基 ; 一份 NMMMmi 营养琼脂培养基加入 MKRmiNBqqC 溶液, 摇匀, 制得 MKMMMRB qqc 营养琼脂培养基 ; 一份 NMMM mi 营养琼脂培养基加入 NKRmiNBqqC 溶液, 摇匀, 制得 MKMMNRB qqc 营养琼脂培养基 ; 一份 OMMmi 营养琼脂培养基不加显色剂 ;RM 水浴保温, 待倾注平皿 将玫瑰红钠琼脂培养基加热溶化,RM 水浴保温, 待倾注平皿 NKR 平皿的制备 NKRKN 试验组 对于大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 P 种细菌试验菌的验证 : 取样品液 NKM mi 和 RM~NMMcfu 试验菌, 分别注入平皿中, 立即倾注已预先融化并放凉至 QR 左右 ( 不烫手 ) 的 MKMMNBqqC 营养琼脂培养基, 混匀, 每株试验菌平行制备 O 个平皿, 按平皿法计数 ; 对于白色念珠菌酵母菌试验菌 黑曲霉霉菌试验菌的验证 : 取样品液 NKMmi 和 RM~NMMcfu 试验菌, 分别注入平皿中, 立即倾注已预先溶化并放凉至 QR 左右 ( 不烫手 ) 的玫瑰红钠琼脂培养基, 混匀, 每株试验菌平行制备 O 个平皿, 按平皿法计数 NKRKO 菌液组 将 RM~NMMcfu 该试验菌, 按平皿计数法测定该试验菌的菌含量 NKRKP 稀释剂对照组 将 NKMmiNM S ( 含 RM~NMM cfu 该试验菌 ) 菌悬液与 P 份 NKMmiéeTKM 氯化钠 J 蛋白胨缓冲液 ( 分别内含 NMMWR NMMWNM 或 NMMWNR 聚山梨酯 UM) 注入平皿中, 立即倾注相应的琼脂培养基, 按平皿法计数 NKRKQ 供试品对照组 分别取 NKMmi 样品液注入

3 NMRV 每一平皿中, 立即倾注相应的琼脂培养基 按平皿法测定供试品本底菌数 NKRKR 培养与计数 (N) 对于大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 P 种细菌试验菌的验证 : 将其试验组 菌液组 稀释剂对照组 供试品对照组的营养琼脂培养基平板放 PM~PR 培养箱内培养, 逐日点计菌落数, 以 QUh 的菌落数报告 (O) 对于白色念珠菌酵母菌试验菌 黑曲霉霉菌试验菌的验证 : 将其试验组 菌液组 稀释剂对照组 供试品对照组的玫瑰红钠琼脂培养基平板放 OP~ OU 培养箱内培养, 逐日点计菌落数, 以 TOh 的菌落数报告 NKRKS 回收率计算 稀释剂对照组回收率 Z 稀释剂对照组菌落数 L 菌液组菌落数, 试验组回收率 Z ( 试验组菌落数 供试品对照组菌落数 )L 菌液组菌落数 O 结果 OKN 不同浓度的菌体显色剂对 P 种细菌菌落形成的影响情况 从数据 ( 表 N) 可以看出,MKMMMRBqqC 与 MKMMNBqqC 对细菌菌落的正常检出影响不大, 但 MKMMMRBqqC 着色效果较差, 随着 qqc 浓度加大, 会对细菌产生毒性, 细菌检出率下降 所以, 采用 MKMMNBqqC 的营养琼脂培养基进行下面的试验 OKO 验证试验结果 OKOKN 大肠埃希菌平皿计数法验证数据 分别制备 含 R NM NRg 聚山梨酯 UM 的 éetkm 无菌氯化钠 J 蛋白胨缓冲液 NMMmi,PM~PR 培养 QUh 后测各组菌落数, 计算回收率 结果见表 O 含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液试验组和稀释剂对照组回收率均较高, 含 Rg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稀释剂对照组大肠埃希菌的回收率比含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稍有提高, 但试验组的回收率下降且小于 TMB OKOKO 金黄色葡萄球菌平皿计数法验证数据 分别制备含 R NM NRg 聚山梨酯 UM 的 NMMmi,PM~PR 培养 QUh 后测各组菌落数, 计算回收率 结果见表 P 含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液试验组和稀释剂对照组回收率均较高, 含 Rg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稀释剂对照组大肠埃希菌的回收率比含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稍有提高, 但试验组的回收率有下降, 且试验组数据波动大 OKOKP 枯草芽孢杆菌平皿法计数方法验证数据 分别制备含 R NM NRg 聚山梨酯 UM 的 NMMmi,PM~PR 培养 QUh 后测各组菌落数, 计算回收率 结果见表 Q 含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液试验组和稀释剂对照组回收率均较高, 含 Rg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稀释剂对照组大肠埃希菌的回收率比含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稍有提高, 但试验组的回收率有下降且小于 TMB, 且试验组数据差异大 表 N 不同浓度的菌体显色剂对 P 种细菌菌落形成的影响 qablen bffectsofdifferentconcentrationofchromogenicagentsontheformationofthreebacterialcolonies qqc 大肠埃希菌菌落数 金黄色葡萄球菌菌落数 枯草芽孢杆菌菌落数 N O P 平均 N O P 平均 N O P 平均 M QT RS SO RR TT SS UR TS SO ST TU SV MKMMMRB RP RR SM RS TR UN TO TS SS SP TO ST MKMMNB RM RQ SM RR TQ TN UM TR SP SO TM SR MKMMNRB PU QN QT QO SM RR SR SM RS QV SM RR 表 O 大肠埃希菌平皿计数法验证试验 qableo serifyingtestofbscherichia coliwithplatecountingmethod 组别 NMMmiWNMg 聚山梨酯 UM NMMmiWNRg 聚山梨酯 UM NMMmiWRg 聚山梨酯 UM 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 试验 SU VQ RQ SV SM SV 菌液 RQ RQ RQ 稀释剂对照 RN UV PR ST RQ VU 供试品对照 OM NU OO

4 NMSM 表 P 金黄色葡萄球菌平皿计数法验证试验 qablep serificationtestofptaphylococcus aureusbyplatecountingmethod 组别 NMMmiWNMg 聚山梨酯 UM NMMmiWNRg 聚山梨酯 UM NMMmiWRg 聚山梨酯 UM 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 试验 UP VO SS TO TN TS 菌液 TQ TQ TQ 稀释剂对照 TO VT RO TM TM VR 供试品对照 NR NP NU 表 Q 枯草芽孢杆菌平皿法计数方法验证 qableq salidationofplatecountingmethodforbacillus subtilis 组别 NMMmiWNMg 聚山梨酯 UM NMMmiWNRg 聚山梨酯 UM NMMmiWRg 聚山梨酯 UM 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 试验 TQ TU SQ SU TM SV 菌液 SR SR SR 稀释剂对照 SM VO RM TT SO VR 供试品对照 OP OM OR OKOKQ 白色念珠菌平皿法计数方法验证数据 分别制备含 R NM NRg 聚山梨酯 UM 的 NMMmi,OP~OU 培养 TOh 后测各组菌落数, 计算回收率 结果见表 R 含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液试验组和稀释剂对照组回收率均较高, 含 Rg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稀释剂对照组大肠埃希菌的回收率比含 NMg 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稍有提高, 但试验组的回收率有下降, 且试验组数据差异大 OKOKR 黑曲霉平皿计数法验证 分别制备含 R NM NRg 聚山梨酯 UM 的 NMMmi,OP~OU 培养 TOh 后测各组菌落数, 计算回收率 结果见表 S 含 NMg 聚山梨酯 UM 的试验组和稀释剂对照组回收率均较高, 含 Rg 聚山梨 酯 UM 的稀释剂对照组大肠埃希菌的回收率比含 NM g 聚山梨酯 UM 的供试品溶液稍有提高, 但试验组的回收率有下降, 且试验组数据差异大 P 讨论 通过此次验证试验可见, 细菌计数培养基中菌体显色剂使用 样品液制备中表面活性剂的使用, 都会对微生物菌落的正常检出有一定影响 从数据可知,MKMMNBqqC 菌体显色剂能有效地对细菌着色, 并能保证细菌计数的准确性 用 NMMmi 加 NMg 聚山梨酯 UM 的方法制备样品液, 取得了很好的回收率 大肠埃希菌稀释剂对照组 试验组的菌回收率均高于 TMB; 金黄色葡萄球菌稀释剂对照组 试验组的菌回收率均高于 TMB; 枯草芽孢杆菌稀释剂对照组 试验组 表 R 白色念珠菌平皿法计数方法验证 qabler salidationofplatecountingmethodforcandida albicans 组别 NMMmiWNMg 聚山梨酯 UM NMMmiWNRg 聚山梨酯 UM NMMmiWRg 聚山梨酯 UM 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 试验 RQ UP QV TO RM TQ 菌液 RU RU RU 稀释剂对照 RR VR QR TU RU NMM 供试品对照 S T T

5 NMSN 组别 表 S 黑曲霉平皿计数法验证 qablessalidationofplatecountingmethodforaspergillus niger NMMmiWNMg 聚山梨酯 UM éetkm 无菌氯化钠 J 蛋白胨缓冲 液 NMMmiWNRg 聚山梨酯 UM éetkm 无菌氯化钠 J 蛋白胨缓冲 液 NMMmiWRg 聚山梨酯 UM 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 菌落数 回收率 LB 试验 RO UT QS TS QU TU 菌液 RQ RQ RQ 稀释剂对照 QV VN QR UP RO VS 供试品对照 R R S 的菌回收率均高于 TMB; 白色念珠菌稀释剂对照组 试验组的菌回收率均高于 TMB; 黑曲霉稀释剂对照组 试验组的菌回收率均高于 TMB 而加大聚山梨酯 UM 用量制备样品液,R 种菌的回收率均有不同程度的下降甚至不合格 缩小聚山梨酯 UM 用量制备样品液, 对稀释剂对照组回收率没影响, 但试验组回收率下降明显, 且样品分散效果不理想, 数据波动较大 综上所述, 在曲安奈德原料药微生物总数测定方法中, 细菌菌体显色剂采用 MKMMNBqqC 的浓度, 样品液制备中聚山梨酯 UM 用量采用 NMMmiWNMg 的比例是适宜的 参考文献 xnz 殷英霞 I 陈建华 I 吴香丽 I 等 K 球后注射曲安奈德治疗黄斑水肿对老年患者血糖水平的影响 xgzk 中华老年多器官疾病杂志 IOMNUINTEOFWVTJNMMK xoz 范晓梅 I 刘丽丹 K 醋酸曲安奈德玻璃体腔注射在治疗老年黄斑水肿患者中的应用 xgzk 检验医学与临床 I OMNUINREOFWOSSJOSVK xpz 郭 敏 I 刘 宏 I 季可非 I 等 K 曲安奈德局部给药制剂的研究进展 xgzk 中国药师 IOMNSINVEMPFWRRVJRSOK xqz 郑利光 I 华 红 K 曲安奈德外用治疗口腔黏膜病的研究进展 xgzk 实用口腔医学杂志 IOMNRIPNEOFWOTUJOUNK xrz 中国药典 xpzkomnrk

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