中国药典微生物限度检查法 马仕洪中国食品药品检定研究院 2018 年 10 月 30 日, 北京 中国药典微生物限度检查法 1 修订历史沿革 2 与 ICH 方案异同 3 挑战与发展

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1 马仕洪 马仕洪, 副研究员, 中国食品药品检定研究院化学药所微生物室副主任, 兼烟台大学药学院硕士研究生指导教师 从事药品微生物实验室工作 20 余年, 紧密围绕药品微生物检验及控制, 积极推进 中国药典 05 版 10 版 15 年版的编写及推广应用, 组织多项中国药典微生物课题研究, 参与 欣弗事件 刺五加事件 等多次涉及微生物污染药品不良事件的查处 发表论文近 20 篇, 取得适用新型及发明专利 5 项

2 中国药典微生物限度检查法 马仕洪中国食品药品检定研究院 2018 年 10 月 30 日, 北京 中国药典微生物限度检查法 1 修订历史沿革 2 与 ICH 方案异同 3 挑战与发展

3 1 修订历史沿革 1 ChP 修订历史沿革 1978 年卫生部颁发第一个 药品卫生试行标准 1986 年卫生部颁布 药品卫生标准 中国药典 重大事项 1995 年版 首次收载微生物限度检查法 2000 年版 首次收载微生物限度标准 2005 年版 首次收载方法验证要求 2010 年版 首次收载培养基适用性检查要求 2015 年版 基本与 ICH 微生物检查法接轨

4 1 ChP 修订历史沿革 药典 USP/EP/JP/ChP2015 中国药典 2010 及之前版本 分类依据 按营养条件分 按微生物类别分 质控分类 需气 厌气菌 细菌 真菌 检验体系 直接与培养条件对应 选择培养, 或者人为区分 评价 简便 严谨 容易造成漏检 中外药典微生物检查的系统性差异 1 ChP 修订历史沿革 检测项目和培养基 药典 2015 版 Chp 2010 版 Chp 分类营养条件微生物类别 项目 1 项目 2 需氧菌总数,3-5d 胰酪大豆胨琼脂 / 肉汤 (TSA/B) 霉菌及酵母菌总数,5-7d 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 细菌数,3d 营养琼脂 (NA) 霉菌及酵母菌数,5d 玫瑰红钠琼脂 (RA)

5 1 ChP 修订历史沿革 检测项目和培养基 编号 2015 版 Chp 2010 版 Chp 1* 耐胆盐的革兰氏阴性菌 大肠菌群 2* 大肠埃希菌 大肠埃希菌 3* 沙门菌 沙门菌 4* 铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌 5* 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 6 梭菌 梭菌 7 白色念珠菌 白色念珠菌 *: 培养基体系有明显变化 1 ChP 修订历史沿革 2015 年版药典基本特点 微生物计数法标准 : 不再规定复试要求, 通过实验室调查回顾分析结果的准确性 限度标准以指数方式表示, 最大可接受限度值遵守 2 倍规则 : 10 1 cfu: 可接受的最大限度为 20; 10 2 cfu: 可接受的最大限度为 200; 依此类推

6 1 ChP 修订历史沿革 2015 年版药典基本特点 控制菌检查法结果判断 : 不再规定复试要求, 通过实验室调查回顾分析结果的准确性 较少的生化实验或采用其它适宜方法进一步鉴定 ( 镜检 生化 色谱 & 光谱技术 分子生物学等 ) 1 ChP 修订历史沿革 2015 年版药典基本特点 实验环境要求 : (1105) (1106) (9203) 不低于 D 级背景条件下的 B 级单向流 全面与国际标准接轨 ; 为药品微生物从终产品检验向过程控制转变服务

7 2 与 ICH 方案异同 USP35 <61>Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests <62>Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms <1111>Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product 2015 版 中国药典 (1105) 非无菌产品微生物限度检查 : 微生物计数法 (1106) 非无菌产品微生物限度检查 : 控制菌检查法 (1107) 非无菌药品微生物限度标准 Harmonization(USP/EP/JP) The USP and the EP Microbial Limits Tests are in the final stages of harmonization.they were signed off to Stage6A at the November,2005 meeting of the PDG held in Chicago,IL USA (USP 2006a). Stage6A:REGIONAL ADOPTION USP31 General Information/<1196> Phmarmacopeial Harmonization: The following policy statement was approved by the PDG at its September 2002 meeting. Table2. Status of Harmonization-General Chapters Tests for specified microorganisms EP Stage4 Microbial Enumeration EP Stage4 Microbial Attributes EP Stage4 Stage4:Official Inquiry Harmonization Timing/Issues EP:2007/01 USP:2009/05 JP:2007/10

8 2 与 ICH 方案异同 标准菌株的差异 大肠埃希菌 (Escherichia coli) CMCC(B) 枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis CMCC(B) 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 乙型副伤寒沙门菌 Salmonella paratyphi B) CMCC(B) 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) CMCC(B) 白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 黑曲霉 ( Aspergillus niger ) CMCC(F) Staphylococcus aureus Such as ATCC6538,NCIMB9518,CIP4.83, or NBRC13276 Pseudomonas aeruginosa Such as ATCC9027, NCIMB8626, CIP82.118, or NBRC13275 Escherichia coli Such as ATCC8739,NCIMB8545,CIP53.126, or NBRC3972 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium or, as an alternative, Such as ATCC Salmonella enteria Such as NBRC100797,NCTC6017, or CIP80.39 Clostridium sporogenes such as ATCC (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP ) or ATCC (NCTC 532 or CIP 79.3). Candida albicans Such as ATCC10231,NCPF3179,IP48.72, or NBRC1594 薄膜过滤法 1. 滤膜孔径 : 不大于 0.45μm 2. 直径 :50/75mm 滤膜材质 供试品特点 : 1 水溶性或油性 2 有抑菌性 3 标准较严 总冲洗量不超过 1000ml

9 薄膜过滤法 二级过滤的 75mm 薄膜过滤器专利 SDA 与玫瑰红钠琼脂培养基 当染菌较多时, 玫瑰红钠琼脂培养 基可抑制部分革兰阳性菌 表 玫瑰红钠琼脂培养基专属性实验结果 大肠 铜绿 金葡 枯草 营养琼脂培养基 35 培养 48hrs 玫瑰红钠琼脂培养基 35 培养 48hrs 玫瑰红钠琼脂培养基 25 培养 72hrs

10 2 与 ICH 方案异同 控制菌检查结果判断 检出微生物的分离分析 : 生化实验或采用其它适宜方法进 一步鉴定 制剂类型 TAMC TYMC 控制菌 口服给药固 / 液体 口腔黏膜 / 齿龈 / 鼻用 大肠埃希菌, 含药材原粉化学制剂及脏器提取物不得检出沙门菌 大肠埃希菌, 金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌 耳用 / 皮肤 金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌 呼吸道吸入 阴道 / 尿道 直肠给药固 / 液体 大肠埃希菌, 金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌 耐胆盐革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌, 白色念珠菌, 梭菌 ( 中药 ) 金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌 其他局部给药 金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌

11 USP<1111> 非无菌产品微生物检查法 : 制剂及药用材料微生物标准 制剂类型 TAMC TYMC 控制菌 药用原料及辅料 *( 未做统一规定 ) 中药提取物 *( 未做统一规定 ) 中药饮片 *( 未做统一规定 ) *( 未做统一规定 ) 10g 不得检出沙门菌, 耐胆盐革兰阴性菌应小于 10 4 cfu/g Htt p:// ww

12 系统化的实验结果保障理念 9203(13 条 ) WHO GPML(12 条 ) 1 人员 Personnel 2 培养基 Reagents and culture media 3 试剂 Reagents and culture media 4 菌种 Reference materials and reference cultures 5 环境 Environment 6 设备 Equipment 7 样品 Sampling,Sample handling and identification 8 检验方法 Validation of test methods 9 污染废弃物处理 Disposal of contaminated waste 10 质量 ( 结果和检验 ) Quality assurance of results and performance, 11 实验记录 Testing procedures 12 结果判断和报告 Test reports 13 文件 / 培养基 ( Culture Media) 如何控制检验系统质量? USP/EP/ 中国药典 2010/2015 年版 培养基适用性检查

13 培养基适用性检查 USP38:<61>Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests:Growth Pormotion of the Media <62> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms: Growth Pormotion and Inhibitory Properties of the Media. Test each batch of ready-prepared medium and each batch of medium prepared either from dehydrated medium or from ingredients. For a freshly prepared inoculum, growth of the microorganisms comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs. 培养基适用性检查 我国药品微生物实验室小而分散, 数以千计的企业和基层药 检所难以有效地进行参比培养基的验证 评价工作 ; 在监督检查中, 难以有效评估企业微生物实验室对参比培养 基的验证情况 USP:compare to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs. 对照培养基 24

14 对照培养基 培养基质量控制 : USP 之前验证过的培养基 中国药典 对照培养基 中国食品药品检定研究院按 国家标准物质程序研制供应 单剂量免称量独立包装专 利号 :ZL 马仕洪, 杨美琴, 刘鹏, 曹丽梅, 胡昌勤 ( 中国食品药品检定研究院, 北京 ) 中国药典 2010 年版对照培养基的研制与应用, 中国药事,2012(8) 对照培养基 标准物质查询 标准物质供应

15 2 挑战与发展 由于中药在中国药品构成中占有相当大的比例, 其微生物特点对 ICH 方案带来巨大挑战 53 批菊花分离鉴定的微生物群 门 /2 纲 /3 目 /6 科 /8 属 /17 种 /47(122 株 ) 根瘤菌目 根瘤菌科 根瘤菌属 Rhizobium radiobacter α- 变形菌纲 鞘脂单胞菌目 鞘脂单胞菌科 鞘脂单胞菌属 Sphingomonas paucimobilis 变形菌门 厚壁菌门 γ- 变形菌纲 芽孢杆菌纲 Kosakonia Kosakonia cowanii hermannii 埃希菌属 vulneris 大肠埃希菌 * 赫氏埃希菌 asburiae/cloacae cowanii Enterobacter asburiae Enterobacter soli(98.86) 肠杆菌属 Enterobacter xiangfangensis 肠杆菌目 肠杆菌科 hormaechei 霍氏肠杆菌生癌肠杆菌阴沟肠杆菌 * agglomerans ananatis/agglomerans 泛菌属 dispersa eucrina Pantoea theicola 变栖克雷伯氏菌 克雷伯菌属 肺炎克雷伯菌肺炎亚种 肺炎克雷伯氏菌 Cronobacter sakazakii group malonaticus 克罗诺杆菌属 sakazakii sakazakii/malonaticus sakazakii/turicensis 勒克氏菌属 adecarboxylata 非脱羧勒克菌 柠檬酸杆菌属 Citrobacter freundii 欧文氏菌属 Erwinia tasmaniensis 志贺氏菌属 sonnei 变形假单胞菌 假单胞菌科假单胞菌属假单胞菌目 恶臭假单胞菌 莫拉菌科 不动杆菌属 Acinetobacter baumannii baumannii complex 乳杆菌目 链球菌科 链球菌属 托尔豪特链球菌 芽孢杆菌目 类芽孢杆菌科类芽孢杆菌属 Paenibacillus odorifer 芽孢杆菌科 芽孢杆菌属 cereus group circulans licheniformis Paenibacillus alvei subtilis/vallismortis/amyloliq uefaciens 枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属

16 案例 案例 : 某板蓝根冲剂, 标准为细菌数不得过 1000cfu/g, 某药检所细菌数结论 1200cfu/g, 送中检院仲裁 关注 : 方法适用性 平皿法 (1:10 供试液 ) 1ml/ 皿 0.5ml/ 皿 0.2ml/ 皿 计数结果 (cfu/g) 合格 不合格 2 挑战与发展 SDA 大量长菌对结果判断的挑战 如果由于细菌的生长而使 TYMC 结果不符合微生物限度 要求, 可使用 SDA+ 抗生素 重新进行计数 TYMC>TAMC

17 2 挑战与发展 数据俢约 全数字比较与微生物结果的不确定性 2 挑战与发展 控制菌检查结果导致大量的不可接受微生物的评估和 判断

18 是否为致病菌? 各种国内外标准 权威的教科书和手册 权威的文献报道 FDA:Bad Bug Book 天坛旧址 (Old Address) 大兴新址 (New Address) 中检院化药所微生物检测室 ( 天坛旧址 ) Institute for Chemical Drug Control National Institutes for Food and Drug Control Microbiology Lab Add: No.2 Tiantan Xili, Beijing, P.R.China

19 Thank you! 马仕洪 Tel: Fax:

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