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1 2015 版药典微生物检测法规解析 默克密理博 生物监测部门 栗壮

2 背景介绍

3 附录概论 整合优化, 单列成部, 突出中药! 合并一部 二部 三部附录内容, 参考国际先进药典, 不断优化内容 制剂通则 : 按照药物剂型分类, 针对剂型特点的规定, 统一技术要求 通用检测方法 : 各正文品种进行相同检查项目检测时, 应采用统一的设备 程序 方法及限度等 指导原则 : 为执行药典 考察药品质量 起草与复核药品标准所制定的指导性规定 2015 版药典计划于 2015 年初印刷出版,7 月 1 日或 10 月 1 日执行 3

4 制剂通则 整合原则 1 规范剂型, 整合制剂种类 2 同一剂型, 检查项统一 3 片重有效位数统一 4 及时收载新剂型, 并制定相关检查方法 5 积极研究新方法 新剂型相关指导原则 4 请根据报告内容更新

5 剂型种类 共 41 种剂型 通过剂型可掌握药物的检查项目, 同一剂型, 检查项统一! 5 剂型定义主要内容检查项目 片剂 注射剂 请根据报告内容更新 原料药物或与适宜的辅料制成的圆形或异形的片状固体制剂 原料药物或与适宜的辅料制成的供注入体内的无菌制剂 1 增加口崩片亚剂型 2 统一崩解时限项 1 生物制品原料对剂型不做要求, 只看成品剂型 2 中药注射剂检查重金属及有害元素残留 3 静脉注射剂因剂量大不得添加抑菌剂, 慎用增溶剂 重量差异 崩解时限 ( 检查溶出度 释放度的除外 ) 发泡量 分散均匀性 微生物限度 装量 装量差异 渗透压摩尔浓度 可见异物 不溶性微粒 重金属及有害元素残留量 无菌 细菌内毒素或热原

6 微生物检测法规相关内容 实验室管理 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 微生物限度检查 9202 非无菌产品微生物限度检查法应用指导原则 1105 非无菌产品微生物限度检查 : 微生物计数法 1106 非无菌产品微生物限度检查 : 控制菌检查法 1107 非无菌药品微生物限度标准 6 请根据报告内容更新

7 无菌检查 1101 无菌检查法 9206 无菌检查隔离器验证指导原则 其他相关方法 9204 微生物鉴定指导原则 1121 抑菌效力检查法 0261 制药用水 7 请根据报告内容更新

8 1 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则

9 适用范围 用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的监测和控制 包括 : 无菌检查洁净室 隔离系统 微生物限度检查洁净室 阳性室 其它受控环境 9 请根据报告内容更新

10 洁净室维护原则 确保检测结果准确 为维持药品洁净实验室操作环境的稳定性 确保药品质量安全及检测结果的准确性, 应对药品洁净实验室进行微生物监测和控制, 使受控环境维持可接受的微生物污染风险水平 10 请根据报告内容更新

11 微生物监测和控制内容 1 人员要求 2 初次使用的洁净实验室参数确认 3 微生物监测方法 4 监测频次及监测项目 5 监测标准 6 警戒限和纠偏限 7 数据分析及偏差处理 8 微生物鉴定和微生物控制 11 请根据报告内容更新

12 2 洁净室级别确认 确认时间 : 初次使用前 确认参数 : 物理参数 空气悬浮粒子 微生物 特别要求 : 有人员流动 超净工作台等重大设备运转 空气调节系统等重大变化时应重新进行参数测试 12 请根据报告内容更新

13 尘埃粒子与微生物监测 药品洁净实验室应定期进行微生物监测和控制 内容包括 : 非生物活性的空气悬浮粒子数 有生物活性的微生物监测 1 环境浮游菌监测 2 沉降菌监测 3 表面微生物监测 包括关键的检测台面 人员操作服表面及 5 指手套等 当有人员 设备 空气调节系统等重大改变时或微生物监测结果或样品测定结果产生偏离时应重新进行监测 13 请根据报告内容更新

14 监测频率和监测项目无菌隔离系统 内部 相邻外部 监测项目 空气悬浮粒子 浮游菌 沉降菌 表面微生物 ( 手套及操作服 ) 空气悬浮粒子 浮游菌 沉降菌 表面微生物 ( 手套及操作服 ) 检测频率 每月一次 每月一次每次实验每次实验每半年一次每半年一次每半年一次每半年一次 14 请根据报告内容更新

15 无菌检查 无菌检查 监测项目 空气悬浮粒子 浮游菌 沉降菌 表面微生物 ( 手套及操作服 ) 检测频率每月一次每月一次每次实验每次实验 15 请根据报告内容更新

16 微生物限度检查 微生物限度检查 监测项目空气悬浮粒子浮游菌沉降菌表面微生物 ( 手套及操作服 ) 检测频率每季度一次每季度一次每周一次每周一次 16 请根据报告内容更新

17 C 级 D 级 监测项目 空气悬浮粒子 浮游菌 沉降菌 表面微生物 ( 手套及操作服 ) 空气悬浮粒子 浮游菌 沉降菌 表面微生物 ( 手套及操作服 ) 检测频率每半年一次每半年一次每季度一次每季度一次每半年一次每半年一次每半年一次每半年一次 17 请根据报告内容更新

18 警戒限和纠偏限 (1) 数据表示建议的环境质量水平, 也可根据检测或分析方法的类型确定微生物纠偏限度标准 (2) 可根据洁净区域用途 检测药品的特性等需要增加沉降碟数 (3)A 级环境的样品, 正常情况下应无微生物污染 18 Presentation title in footer 00 Month 0000

19 偏差处理 当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时, 应当按照偏差处理规程进行报告 记录 调查 处理以及采取纠正措施, 并对纠正措施的有效性进行评估 关键区域 (A 级 ) 微生物监测数值若大于 15CFU, 应视为控制失败, 为重大偏差 应迅速彻底调查原因 19 Presentation title in footer 00 Month 0000

20 微生物鉴定 建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定 尤其当超过监测限度时, 微生物鉴定信息有助于污染源的调查 关键区域分离到的菌落应先于非关键区域进行鉴定 微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则 ( 通则 9204 ) 进行 分离菌鉴定结果可以被用作分析污染源的有效证据 比如微球菌常常能在皮肤上发现, 假单胞菌则与水有关 20 请根据报告内容更新

21 2015 版中国药典 微生物限度检查法

22 总则

23 微生物检验标准体系特征 一百多年来, 人们努力提高在 有菌的环境 生产 无菌的产品 的能力, 事实证明这一努力至今仍充满挑战 2015 版中国药典微生物检验标准体系体现两大显著特征 : 全面与国际标准接轨 为药品微生物从终产品检验向过程控制转变服务重点 : 1 加强检验过程控制 2 提高方法检出率 3 保证结果可靠性 23

24 微生物限度检查法格式变化 参照 ICH( 人用药物注册技术要求国际协调会 ) 整合修订 新的修订案将微生物限度检查法分为 3 个附录, 即 非无菌产品微生物限度检查: 微生物计数法 非无菌产品微生物限度检查: 控制菌检查法 非无菌药品微生物限度标准 24 Presentation title in footer 00 Month 0000

25 微生物检查体系的调整 2010 版 2015 版 分类依据 按微生物类别分 按营养条件分 质控分类 细菌 真菌 需气 厌气菌 检验体系 选择培养 或者人为区分 直接与培养条件对应 评价 容易造成漏检 简便 严谨 25 Presentation title in footer 00 Month 0000

26 微生物检测环境 检测环境 2010 版 2015 版 应在洁净度 级背景下的局部 100 级单向流空气区域内进行 应在受控洁净环境 ( 不低于 D 级洁净环境 ) 下的局部洁净度不低于 B 级单向流空气区域内进行 其他要求 : 检验过程及环境既要最大可能防止样品受污染, 又要防止检测过程对环境和人员造成的危害 活动区域的合理规划及区分, 将提高微生物实验操作的安全性和可靠性 26 Presentation title in footer 00 Month 0000

27 非无菌产品微生物限度检查 : 微生物计数法

28 总则

29 微生物计数法 1 微生物计数法用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数 2 明确规定本法不适用于活菌制剂的检查 3 明确规定本检查法可采用替代检查方法, 包括自动检测方法, 但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法 4 应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于 B 级的单向流空气区域内进行 单向流空气区域 工作台面及环境应定期进行监测 5 尽可能去除或中和供试品的抗菌活性 若使用了中和剂或灭活剂, 应确认其有效性及对微生物无毒性 6 如果使用了表面活性剂, 应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性 29 Presentation title in footer 00 Month 0000

30 30 Presentation title in footer 00 Month 0000

31 可替代方法的使用 参照中国药典附录 药品微生物检验替代方法验证指导原则 证明替代方法等效于药典规定的检查方法 31 Presentation title in footer 00 Month 0000

32 环境监测 : 参考 :9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 1 监测项目 监测项目 检测频率 微生物限度检查 空气悬浮粒子 每季度一次 浮游菌 每季度一次 沉降菌 每周一次 表面微生物 ( 手套及操作服 ) 每周一次 培养基 : 一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA), 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时, 可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA) 32 Presentation title in footer 00 Month 0000

33 尘埃粒子监测 监测方法 : 参照 GB/T 医药工业洁净室 ( 区 ) 悬浮粒子的测试方法 监测设备 : 空气尘埃粒子计数器, 多为光散射粒子计数器 工作原理 : 当取样气流中的尘埃颗粒通过计数器散射腔的光敏感区时, 光遇到粒子时发生散射, 这些光脉冲信号经光电二极管转换成电脉冲信号, 电脉冲次数反映粒子数, 脉冲幅值反映粒子的粒径 一台仪器可同时测定多个粒径通道的粒子

34 采样点 不得少于 2 个 34 请根据报告内容更新

35 采样量 35 请根据报告内容更新

36 尘埃粒子标准 36 请根据报告内容更新

37 容易被忽略的 UCL 值 : UCL 的计算 : 平均值均值的 95% 置信上限, 微粒每立方米 ( 粒 /m 3 ) 95% UCL X t0. 95 s m 各个平均值的采样点数 (m) ! t

38 悬浮粒子结果评定 1 单个采样点平均值 2 所有采样点 UCL 值

39 微生物监测 浮游菌监测 : 收集悬浮在空气中的生物性微粒, 通过专门的培养基, 在适宜的生长条件下, 让其繁殖到可见的菌落并进行计数, 从而判定洁净环境中单位体积空气中菌落数的多少 沉降菌监测 : 用暴露法收集降落在培养皿中的活生物性粒子, 然后加以培养 繁殖后加以计数得到 表面微生物监测 : 用来监测环境 设备和人员的表面微生物量 1 接触碟法 2 棉签擦拭法

40 监测方法 空气微生物监测 --- 浮游菌和沉降菌孰优孰劣? 沉降菌测试 属于被动式取样法, 对空气环境破坏小 放置时间长, 可以做时间段的环境监控 取样方法并不能给出定量的数据 空气浮游菌测试 主动式采样法, 定量且对微生物无选择性 时间 点 的采样

41 浮游菌监测 监测方法 :GB/T 医药工业洁净室 ( 区 ) 浮游菌的测试方法 监测设备 : 浮游菌检测仪 41 请根据报告内容更新

42 采样要求 采样点同尘埃粒子要求 采样量要求 : 42 请根据报告内容更新

43 取样点选择的考虑因素 : 微生物污染最有可能对实验结果造成负面影响的的位置 ; 微生物最容易增殖的位置 ; 取样点的选择是否应有统计方面的考虑, 或者是否是基于网格状分布的? 在常规监测中, 某些位点是否需要轮换进行取样? 能够代表那些在清洁 灭菌或者消毒的过程中最难以达到的区域 ; 可能有助于污染扩散的活动 ; 在指定位点的取样活动是否会干扰环境, 从而造成实验结果的误差? 43 Presentation title in footer 00 Month 0000

44 沉降菌测试 监测方法 : 医药工业洁净室 ( 区 ) 沉降菌的测试方法 监测工具 : 一般使用直径为 90mm 的沉降碟 沉降碟优势 : 价廉 轻便 对空气环境破坏较小 放置时间 : 为了尽可能地获得可靠性数据, 沉降碟的放置时间不宜过短, 至少为半小时, 但不得超过 4 小时 应对沉降碟的暴露时间进行确认, 以保证暴露后的培养基不会因失水等原因而影响微生物的正常生长 限度检查若选择 A 级, 则检查工作台面沉降菌的日常监测采样点数不少于 3 个, 且每个采样点的平皿数应不少于 1 个

45 表面微生物监测 接触碟法是将接触碟对规则表面或平面进行取样, 然后置合适的温度下培养一定时间并计数 每碟取样面积约为 25 cm 2, 微生物计数结果以 CFU/ 碟报告 取样方法要经过验证 45 请根据报告内容更新

46 使用接触碟的水平采样点方法 : 培养基表面应与采样点接触不少于 10s, 向整个接触表面施加恒定均匀的压力 ( 如施加的质量约为 25g/cm 2 ), 不得有环形或线性运动 装置有接触并拿开后, 要加盖并尽快用适当的培养条件培养 46 请根据报告内容更新

47 棉签擦拭法是接触碟法的补充, 用于不规则表面的微生物监测, 特别是设备的不规则表面 棉签擦拭法是采用合适尺寸的无菌模板确定擦拭的面积, 取样后, 棉签置合适的缓冲液或培养基中, 充分振荡, 再用平皿涂布法或平皿浇注法计数 每个棉签取样面积为约 25 cm 2, 微生物计数结果以 CFU/ 棉签报告 接触碟法和棉签擦拭法采用的培养基 培养温度和时间同浮游菌或沉降菌监测 表面菌测定应在实验结束后进行 47

48 培养基 环境浮游菌 沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA) 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时, 可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA) 48 请根据报告内容更新

49 培养条件 GBT 医药工业洁净室 ( 区 ) 浮游菌的测试方法 USP1116 无菌工艺环境的微生物控制与监测 49 请根据报告内容更新

50 微生物动态标准 注 : (1) 表中各数值均为平均值 ; (2) 单个沉降碟的暴露时间可以少于 4 小时, 同一位置可使用多个沉降碟连续进行监测并累积计数 50 Presentation title in footer 00 Month 0000

51 警戒限和纠偏限 药品洁净实验室应根据历史数据, 结合不同洁净区域的标准, 采用数理统计方法, 制定适当的微生物监测警戒限和纠偏限 限度确定后, 应定期回顾评价, 如历史数据表明环境有所改善, 限度应作出相应调整以反映环境实际质量状况 51 请根据报告内容更新

52 警戒限和纠偏限 (1) 数据表示建议的环境质量水平, 也可根据检测或分析方法的类型确定微生物纠偏限度标准 (2) 可根据洁净区域用途 检测药品的特性等需要增加沉降碟数 (3)A 级环境的样品, 正常情况下应无微生物污染 52 Presentation title in footer 00 Month 0000

53 偏差处理 当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时, 应当按照偏差处理规程进行报告 记录 调查 处理以及采取纠正措施, 并对纠正措施的有效性进行评估 关键区域 (A 级 ) 微生物监测数值若大于 15CFU, 应视为控制失败, 为重大偏差 应迅速彻底调查原因 53 Presentation title in footer 00 Month 0000

54 微生物鉴定 建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定 尤其当超过监测限度时, 微生物鉴定信息有助于污染源的调查 关键区域分离到的菌落应先于非关键区域进行鉴定 微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则 ( 通则 9204) 进行 54 请根据报告内容更新

55 计数方法

56 微生物计数方法 新增涂布法 1 平皿法: 包括倾注法和涂布法 2 薄膜过滤法 3 最可能数法(MPN 法 ) 选择原则 : 根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择 MPN 法用于微生物计数时精确度较差, 但对于某些微生物污染量很小的供试品,MPN 法可能是更适合的方法 所选方法的适用性须经确认 56 Presentation title in footer 00 Month 0000

57 适用性检查 Suitability checks

58 一 适用性检查内容 培养基适用性检查 计数方法适用性试验 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时, 应重新进行计数方法适用性试验 58 Presentation title in footer 00 Month 0000

59 二 试验菌 2010 版 2015 版大肠埃希菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉白色念珠菌 黑曲霉 59 Presentation title in footer 00 Month 0000

60 菌液制备 1 试验菌株传代次数不得超过 5 代 2 用缓冲液将试验菌新鲜培养物制成适宜浓度的菌悬液 3 菌液制备后室温放置应在 2 小时内使用 ; 保存在 2~8 可在 24 小时内使用 4 稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在 2~8, 在验证过的贮存期内使用 60 Presentation title in footer 00 Month 0000

61 三 阴性对照 适用性检查试验中应平行做阴性对照, 确认试验条件是否符合要求 阴性对照试验应无菌生长 如阴性对照有菌生长, 应进行偏差调查 61 Presentation title in footer 00 Month 0000

62 四 培养基体系 最突出的变化 : 微生物质控分类及培养基体系 2010 版 2015 版 分类依据 按微生物类别分 按营养条件分 项目 1 项目 2 细菌数营养琼脂 霉菌及酵母菌数玫瑰红钠琼脂 需氧菌总数胰酪大豆胨琼脂 (TSA) 霉菌及酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 评价 检验条件不能满足控制要求客观 严谨 62 Presentation title in footer 00 Month 0000

63 微生物计数用培养基 2010 版 2015 版 1 营养琼脂用于细菌计数 2 玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数 3 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵母菌计数 4 菌液制备用稀释液 : 0.9% 氯化钠溶液 试验菌株 63 Presentation title in footer 00 Month 胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧菌总数测定 2 沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定 3 菌液制备用培养基 :ph7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液或 0.9% 无菌氯化钠溶液 2010 版 2015 版 1 营养琼脂 : 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 2 玫瑰红钠琼脂 : 白色念珠菌 黑曲霉 1 胰酪大豆胨琼脂 : 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 黑曲霉 2 胰酪大豆胨肉汤 : 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 3 沙氏葡萄糖琼脂 : 白色念珠菌 黑曲霉

64 培养基成分对比 培养基营养琼脂胰酪大豆胨琼脂 TSA 成分 配方 :(g/l) 胨 10.0 牛肉浸粉 3.0 氯化钠 5.0 琼脂 14.0 配方 :(g/l) 胨 20.0(15.0 胰酪胨 ;5.0 大豆胨 ) 氯化钠 5.0 琼脂 15.0 考察对象细菌数 TYMC 需氧菌总数 成分作用 蛋白胨和牛肉浸粉提供氮源 维生素 氨基酸和碳源 ; 氯化钠能维持均衡的渗透压 ; 琼脂是培养基的凝固剂 酪蛋白胨 大豆胨提供氮源 维生素和生长因子 ; 氯化钠维持均衡的渗透压, 琼脂是培养基凝固剂 64

65 大豆胰蛋白胨琼脂 TSA 成分酪蛋白胨 15.0; 大豆蛋白胨 5.0; 氯化钠 5.0; 琼脂 15.0 制备配制成 40g/L 悬液 ; 121 灭菌 15 分钟 ; ph:7.3±0.2,25 ; 培养基呈黄棕色, 澄清 操作和评价根据用途制定步骤 培养 :35 培养 24 小时, 白色念珠菌和黑曲霉 35 培养 5 天 无菌检测 : 室温培养 1 天 65 Presentation title in footer 00 Month 0000

66 培养结果对比 66 Presentation title in footer 00 Month 0000

67 培养基成分对比 培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 SDA 配方 :(g/l) 配方 :(g/l) 蛋白胨 5.0 酪蛋白胨 5.0 磷酸二氢钾 1.0 肉蛋白胨 5.0 配方玫瑰红钠 葡萄糖 40.0 硫酸镁 0.5 琼脂 15.0 葡萄糖 10.0 琼脂 14.0 成分作用 胨提供碳源和氮源 ; 葡萄糖提供能源 ; 磷酸二氢钾为缓冲剂 ; 硫酸镁提供必须的微量元素 ; 玫瑰红钠作为选择性抑菌剂可抑制细菌的生长, 并可减缓某些霉菌因生长过快而导致菌落漫延生长 ; 琼脂是培养基的凝固剂 蛋白胨提供碳源和氮源 ; 葡萄糖提供能源, 琼脂是培养基的凝固剂 67 Presentation title in footer 00 Month 0000

68 68 Presentation title in footer 00 Month 0000

69 五 培养基适用性检查 2010 版 2015 版 检查范围 固体培养基 微生物计数用的成品培养基 由脱水培养 基或按处方配制的固体和液体培养基 加菌量 50~100CFU 不大于 100CFU 培养温度 营养琼脂 :30~35 C 玫瑰红钠 :23~28 C 胰酪大豆胨琼脂 TSA:30~35 C 培养胰酪大豆胨肉汤 TSB:30~35 C 培养沙氏葡萄糖琼脂 SDA:20~25 C 培养 培养时间细菌 :48h 真菌 :72h 可接受标准 细菌不超过 72h, 真菌不超过 5 天 70% 固体培养基 ( 与对照培养基 ): 50%~200%(0.5~2) 液体培养基 ( 与对照培养基管比较 ): 生长良好 69 Presentation title in footer 00 Month 0000

70 六 计数方法适用性试验主要变化 2010 版 2015 版 (1) 术语变化 : 计数方法验证 (2) 细菌用三种菌株进行验证 (3) 菌液加入方式 : 平皿计数验证时菌液和供试液同时加入平皿, 加菌量为 50~100cfu (1) 术语变化 : 计数方法适用性试验 (2) 总需氧菌计数用五种菌株试验 (3) 菌液加入方式 : 菌液加入供试液中, 使每 ml 供试液或每张滤膜所过滤的供试液中含菌量不大于 100cfu, 且所加菌液的体积不超过供试液体积的 1% 备注 : 培养时间 可接受标准同培养基适用性检查 70 1 接种菌悬液的体积不大于供试液的 1% 2 菌悬液含菌量不大于 100cfu 3 抗菌或抑菌活性的标准 : 回收率低于 50%

71 计数方法适用性试验 1 供试品制备 2010 版 2015 版 1 液体供试品 2 固体 半固体或黏稠性供试品 3 需用特殊供试液制备方法的供试品 : (1) 非水溶性供试品 (2) 膜剂供试品 (3) 肠溶及结肠溶制剂供试品 (4) 气雾剂 喷雾剂供试品 (5) 贴剂供试品 (6) 具抑菌活性的供试品 1 水溶性供试品 2 水不溶性非油脂类供试品 3 油脂类供试品 4 需用特殊方法制备供试液的供试品 : ⑴ 膜剂供试品 ⑵ 肠溶及结肠溶制剂供试品 ⑶ 气雾剂 喷雾剂供试品 ⑷ 贴膏剂供试品 备注 :1 体系上供试液制备移至计数方法适用性试验部分, 结构上更合理 2 供试液从制备至加入检验用培养基, 不得超过 1 小时

72 供试品制备方法 ⑴ 水溶性供试品取供试品, 用 ph7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液, 或 ph7.2 磷酸盐缓冲液, 或胰酪大豆胨肉汤培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液 若需要, 调节供试液 ph 值至 6~8 必要时, 用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释 水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液 ⑵ 水不溶性非油脂类供试品取供试品, 用 ph7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液, 或 ph7.2 磷酸盐缓冲液, 或胰酪大豆胨肉汤培养基制备成 1:10 供试液 分散力较差的供试品, 可在稀释剂中加入表面活性剂如 0.1% 的聚山梨酯 80, 使供试品分散均匀 若需要, 调节供试液 ph 值至 6~8 必要时, 用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释 72

73 ⑶ 油脂类供试品取供试品, 加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解, 或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯 80 或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀 表面活性剂的温度一般不超过 40 ( 特殊情况下, 最多不超过 45 ), 小心混合, 若需要可在水浴中进行, 然后加入预热的稀释剂使成 1 10 供试液, 保温, 混合, 并在最短时间内形成乳状液 必要时, 用含适宜浓度的无菌聚山梨酯 80 或其他无抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步 10 倍系列稀释 73

74 ⑷ 需用特殊方法制备供试液的供试品 膜剂供试品取供试品, 剪碎, 加 ph7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液, 或 ph7.2 磷酸盐缓冲液, 或胰酪大豆胨肉汤培养基, 浸泡, 振摇, 制备成 1 10 的供试液 若需要, 调节供试液 ph 值至 6~8 必要时, 用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释 肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品, 加入 ph6.8 无菌磷酸盐缓冲液 ( 用于肠溶制剂 ) 或 ph7.6 无菌磷酸盐缓冲液 ( 用于结肠溶制剂 ), 置 45 水浴中, 振摇, 使溶解, 制备成 1 10 的供试液 必要时, 用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释 74

75 气雾剂 喷雾剂供试品取供试品, 置冰冻室冷冻约 1 小时, 取出, 迅速消毒供试品开启部位, 用无菌钢锥在该部位钻一小孔, 放至室温, 并轻轻转动容器, 使抛射剂缓缓全部释出 用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合, 然后取样检查 贴膏剂供试品取供试品, 去掉防粘层, 将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上, 在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料 ( 如无菌纱布 ), 避免贴膏剂粘贴在一起 将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂 ( 如聚山梨脂 80 或卵磷脂 ) 稀释液的容器中, 振荡至少 30 分钟 必要时, 用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释 75

76 稀释液 2010 版 2015 版 (1)pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液 (2)pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液 (3)pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液 ( 用于肠溶制剂 ) 或 ph7.6 无菌磷酸盐缓冲液 ( 用于结肠溶制剂 ) (1)pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液 (2)pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液 (3)pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液 ( 用于肠溶制剂 ) 或 ph7.6 无菌磷酸盐缓冲液 ( 用于结肠溶制剂 ) (4) 增加胰酪胨大豆肉汤培养基 不局限上述稀释液 76

77 样品稀释液 氯化钠蛋白胨水缓冲液 作用机制 样品稀释液, 用于非灭菌产品微生物污染分析 磷酸缓冲液, 氯化钠和蛋白胨混合液能特别增加敏感菌的活性 成分 磷酸二氢钾 3.6; 二水合磷酸氢二钾 7.2; 氯化钠 4.3; 肉蛋白胨 1.0. 制备 使用去矿物质水, 配制成 16.1g/L 悬液 ; 如需要, 分装与小容器中 ; 如必须, 加 1~ 10mL 吐温 20 或吐温 80/L. 121 灭菌 15 分钟 ; ph:7.0±0.2,25 ; 培养基呈黄色, 澄清 操作 用于微生物计数或控制菌检测的样品, 根据 EP 或 USP 稀释 培养 :35 培养 24 小时 77

78 2 接种和稀释 试验组 2010 版 2015 版 供试液和菌液同时加入平皿中 供试液中加入规定量的菌液 供试品对照组 供试液直接加入平皿中 供试液, 不加菌液按照试 验组进行试验 菌液对照组 直接加入菌液到平皿中 取不含中和剂 灭活剂及 表面活性剂的稀释液加入 规定量的菌液 中和剂对照组 稀释剂对照组 中和剂 灭活剂及表面活 性剂的稀释液中加入规定 量菌液 模拟样品受到污染时的真实情况! 78 Presentation title in footer 00 Month 0000

79 3 抗菌活性的去除或灭活 供试品前处理 原因 1 溶解性较差 2 供试品抗菌活性 ( 选择适宜方法处理或去除供试品抗菌活性 ) 79

80 抗菌活性处理方法 稀释方法 中和方法 薄膜过滤方法 联合使用上述方法 离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌 ( 细菌 ) 检查用的供试液, 规定的 500 转 / 分钟 不超过 3 分钟只用于去除供试液中的沉淀物 采用该方法时, 供试液中的样品颗粒大小 粘稠度及污染的微生物大小, 转速等直接影响着样品中微生物的回收, 易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况 因此, 供试液制备时尽量避免使用该方法, 更不宜采用高速离心沉降集菌 80

81 4 供试品中微生物的回收 微生物的回收可采用平皿法 薄膜过滤法或 MPN 法 平皿法包括倾注法和涂布法 每株试验菌每种培养基至少制备 2 个平皿, 以算术均值作为计数结果 MPN 法仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用, 本法不适用于霉菌计数 制备的供试液至少 3 个连续稀释级, 每一稀释级取 3 份分别接种至 3 管装有 TSB 培养基中, 同法测定菌液对照组菌数 根据微生物生长的管数从表中查总需氧菌的最可能数 81 Presentation title in footer 00 Month 0000

82 供试品中微生物的回收 薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45μm, 直径一般为 50mm, 滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌 使用时, 应保证滤膜在过滤前后的完整性 每张滤膜总冲洗量不得超过 1000ml, 以避免滤膜上的微生物受损伤 每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数 82 Presentation title in footer 00 Month 0000

83 培养条件 细菌数 : 营养琼脂 30 ~35 3 天 2010 版 2015 版 霉菌及酵母菌数 : 玫瑰红钠琼脂 23 ~28 5 天 需氧菌总数 (TAMC): 胰酪大豆胨琼脂 30 ~35 3~5 天 霉菌和酵母菌总数 (TYMC): 沙氏葡萄糖琼脂 20 ~25 5~7 天 83 Presentation title in footer 00 Month 0000

84 5 结果判断 计数方法 薄膜过滤法平皿法 MPN 法 结果判断 ( 试验组菌落数 供试品对照组菌落数 )/ 菌液对照组菌落数比值应在 0.5~2 之间 试验组菌数应在菌液对照组菌数的 95% 置信限内 若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求, 那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查 84 Presentation title in footer 00 Month 0000

85 供试品检查

86 1 供试品检验量 2010 版 2015 版 除另有规定外, 一般供试品检验量为 10g 或 10ml, 膜剂为 100cm 2 ; 贵重或微量包装药品的检验量可以逐减 除另有规定外, 口服固体制剂不低于 3g, 液体制剂采用原液者不得少于 6ml, 采用供试液者不得少于 3ml, 外用药品不得少于 5g (1) 除另有规定外, 一般取 10g 或 10ml 供试品进行检测 ; 对于液体或固体气雾剂, 取 10 个容器单位检测 ; 对于透皮吸收贴剂, 取 10 贴检验 (2) 每一计量单位 ( 如片剂 胶囊剂 注射剂 ) 活性物质含量小于或等于 1mg, 每 g 或 ml 活性物质含量低于 1mg 这种情况下, 检验量应不少于 10 个剂量单位 10g 或 10ml (3) 对用作活性物质的材料, 样品量有限或批量极小 ( 如 : 小于 1000nk 或 1000g) 的, 除更少检验量被证明合理外, 检测量应为批量的 1% (4) 对于批量少于 200 的产品 ( 如临床诊断用品 ), 取样量可减少至 2 个单位 对于批量少于 100 的产品, 取样量减少至 1 个单位 86 Presentation title in footer 00 Month 0000

87 2 阴性对照 2010 版 2015 版附录 109 页和 110 页 : (1) 排版放在所有检验及验证之 (1) 平皿法 : 取试验用的稀释液前, 更为合理 同时说明所有检验 1ml, 置无菌平皿中, 注入培养基, 活动需要进行阴性对照 凝固, 倒置培养 每种计数用的培 (2) 为确认试验条件是否符合要养基各制备 2 个平板, 均不得有菌求, 应设立阴性对照组, 以稀释剂生长 代替供试品, 阴性对照组应无菌生 (2) 薄膜过滤法 : 取试验用的稀长 供试品检查时也需要进行阴性释液 1ml, 照上述薄膜过滤法操作, 对照试验, 如果对照有菌生长, 应不得有菌生长 进行偏差调查 87 Presentation title in footer 00 Month 0000

88 3 计数 2010 版 2015 版 按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液的制备, 用稀释液稀释成 1:10 1:10 2 1:10 3 等稀释级的供试液 按照计数方法适用性试验确认的计 数方法进行供试品中需氧菌总数 霉菌和酵母菌总数的测定 88 Presentation title in footer 00 Month 0000

89 4 培养 2010 版 2015 版 (1) 描述方式 : 计数方法包括平皿法和薄膜过滤法, 检查时, 按已验证计数方法进行供试品细菌 霉菌和酵母菌数测定 (2) 培养条件 : 细菌 30~35 培养 3 天, 霉菌和酵母菌 23~28 培养 5 天, 必要时可适当延长 7 天 (1) 描述方式 : 按计数方法适用性试验确认计数方法进行供试品中需氧菌总数 霉菌及酵母菌总数的测定 (2) 培养条件 : 胰酪大豆胨琼脂平板在 30~35 培养 3~5 天, 沙氏葡萄糖琼脂平板在 20~25 培养 5~7 天 ;MPN 法和供试品接种, 所有试验管在 30~35 培养 3 天 89 Presentation title in footer 00 Month 0000

90 结果判断

91 1 计数要求 2010 版 2015 版 营养琼脂培养基用于细菌计数 ; 玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数 ; 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数 ( 包括真菌菌落数 ); 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数 ( 包括细菌菌落数 ) 91 Presentation title in footer 00 Month 0000

92 2 计数干扰 2010 版 2015 版若营养琼脂培养基上长有霉菌和若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生酵母菌 玫瑰红钠琼脂培养基上长有长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果细菌, 则应分别点计霉菌和酵母菌 不符合微生物限度要求, 可使用含抗细菌菌落数 然后将营养琼脂培养基生素 ( 如氯霉素 庆大霉素 ) 的沙氏上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂葡萄糖琼脂培养基或选择性培养基培养基上的细菌数, 与玫瑰红钠琼脂 ( 如玫瑰红钠琼脂培养基 ) 进行霉菌培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼和酵母菌总数测定 使用选择性培养脂培养基中的细菌数进行比较, 以菌基时, 应进行培养基适用性检查 若落数高的培养基中的菌数为计数结果 采用 MPN 法, 测定结果为需氧菌总 92 Presentation title in footer 00 Month 0000 数

93 3 计数结果 2010 版 2015 版 供试品的细菌数 霉菌数和酵母菌数其中任何一个不符合该品种项下的规定, 应从同一批样品中随机抽样, 独立复试两次, 以三次结果的平均值报告菌数 无相关内容描述 在实际操作过程应依据附录 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 : 结果的判断和检测报告 异常结果出现时, 应进行偏差调查 93 Presentation title in footer 00 Month 0000

94 4 计数标准 2010 版 2015 版 无规定增加 : 各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下 : 10 1 cfu 为可接受的最大限度为 20; 10 2 cfu 为可接受的最大限度为 200; 10 3 cfu 为可接受的最大限度为 2000; 以此类推 若供试品的需氧菌总数 霉菌及酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定, 判供试品符合规定 ; 若其中任何一项不符合该品种项下的规定, 判供试品不符合规定 2010 版 2015 版 无规定 94 例如 : 当标准为 101cfu, 不同于以往 10cfu 规定的以 10 的指数规定标准, 考虑了微生物计数结果的可变性, 即计数结果的精密度, 而非类似化学检验结果 故要求我们需要在结果判断时或制定内控标准时, 对于结果的判断或历史数据的分析需要用风险分析的手段进行评估 制定标准时需要依据历史数据, 工艺过程, 用药人群等进行相应分析, 制定合理的内控标准, 即总原则为在内控标准的控制下产品无任何质量风险

95 新的理念 1 MPN 法适用范围 : 含菌量较低的供试品细菌总数测定 可作为平板计数法和薄膜过滤法不适用时的补充 2 供试液制备中增加 分散均匀 的概念, 并非一定要溶解 3 表面活性剂使时, 在确认对微生物无毒性的同时, 需要确认与使用的中和剂或表面活性剂的相容性 4 偏差调查概念引入 95

96 引入偏差调查 偏差调查 : (1) 当检验结果出现超常或超标时均需要进行偏差调查 (2) 调查范围人 机 料 法 环 (3) 偏差调查的范围至少包括 : 1) 微生物鉴别 初步确定污染源 2) 原始数据以及阴阳性对照回顾 3) 培养基及所用的其他耗材是否满足质量标准要求 4) 取样环境是否满足要求 5) 同期进行检验的其他结果是否正常 6) 消毒剂是否在有效期内, 且消毒是否正确 7) 必要情况下进行相应的复试 96 Presentation title in footer 00 Month 0000

97 不合格 (OOS) 结果 举例 :OOS 调查程序 实验室初步评价 OOS 原因不明确, 重测 OOS 原因不明确, 重检 确定 OOS 原因实验室原因 舍弃 OOS 结果重检 / 重测 OOS 原因不明确, 重新取样 生产操作者误差 非实验室原因, 生产质量回顾 生产工艺误差 最终结论 : 处理 / 预防 / 评价 / 报告 原料 设备故障 环境因素等

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101 非无菌产品微生物限度检查 : 控制菌检查法

102 控制菌结果判断趋向多样化 控制菌检查中将原来大肠菌群的检测改为耐胆盐的革兰氏阴性菌, 另外培养基体系也有较明显的变化, 较少的生化实验或采用其它适宜方法进一步鉴定 ( 镜检 生化 色谱光谱技术 分子生物学等 ) 修订前大肠菌群大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌 修订后耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌 102 Presentation title in footer 00 Month 0000

103 新增内容 : 对替代方法的认可, 本检查法可采用替代的微生物检查法, 包括自动检测方法, 但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法 较大变动 : 结果判断方式, 在各控制菌项下, 生化实验和 应进行分离 纯化及适宜的鉴定试验 改为较少的生化实验或采用其它适宜方法进一步鉴定 103 Presentation title in footer 00 Month 0000

104 使用无选择性增菌培养基培养, 可以使受损伤的细菌得到修复, 提高检出率 增菌培养 TSB 营养肉汤 BL 乳糖胆盐发酵培养基 选择性增菌 麦康凯肉汤 RV 肉汤 选择性琼脂 麦康凯琼 脂 VRBG XLD 104 Presentation title in footer 00 Month 0000

105 1 培养基种类 培养基种类减少 ( 培养基体系有明显变化 ) 2010 版 :22 种修订后 :14 种 2010 版 2015 版 胆盐乳糖培养基 4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基乳糖胆盐发酵培养基乳糖发酵培养基营养肉汤培养基四硫磺酸钠亮绿培养基胆盐硫乳琼脂培养基或沙门 志贺氏属琼脂培养基三糖铁琼脂培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基绿脓菌素测定用培养基亚碲酸盐肉汤培养基卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂培养基梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基沙氏葡萄糖肉汤沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基吐温 80 玉米琼脂培养基 肠道菌增菌肉汤紫红胆盐葡萄糖琼脂麦康凯肉汤麦康凯琼脂 RV 沙门菌增菌肉汤木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂三糖铁琼脂培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂甘露醇氯化钠琼脂梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂沙氏葡萄糖肉汤沙氏葡萄糖琼脂念珠菌显色培养基

106 106 Presentation title in footer 00 Month 0000

107 107 Presentation title in footer 00 Month 0000

108 2 培养基适用性检查测试指标 测试指标促生长能力抑制能力指示能力 菌株见表见表见表 接种量 不大于 100 不少于 100 ( 不超 1000) 不大于 100 培养时间规定的最短时间规定的最长时间规定的最短时间 108 Presentation title in footer 00 Month 0000

109 控制菌检查 培养基 特性 试验菌株 耐胆盐革兰阴性 肠道菌增菌肉汤 菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂 大肠埃希菌 沙门菌 麦康凯肉汤麦康凯琼脂 RV 沙门菌增菌肉汤木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂三糖铁琼脂培养基 促生长能力抑制能力促生长能力 + 指示特性 促生长能力抑制能力促生长能力 + 指示特性 促生长能力抑制能力促生长能力 + 指示特性指示能力 大肠埃希菌铜绿假单胞菌 大肠埃希菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂 促生长能力 抑制能力 金黄色葡萄球菌 甘露醇氯化钠琼脂 促生长能力 + 指示特性 抑制能力 梭菌 白色念珠菌 梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂 沙氏葡萄糖肉汤沙氏葡萄糖琼脂念珠菌显色培养基 109 Presentation title in footer 00 Month 0000 促生长能力促生长能力 促生长能力促生长能力 + 指示特性促生长能力 + 指示能力抑制能力 铜绿假单胞菌大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌大肠埃希菌 生孢梭菌生孢梭菌 白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大肠埃希菌

110 3 试验菌 2010 版 2015 版 控制菌检查方法的验证. 验证大肠菌群检查方法时, 采取 大肠埃希菌为验证菌株 方法适用性试验试验菌.. 确认耐胆盐革兰氏阴性菌检查方法时, 采取大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌 110 Presentation title in footer 00 Month 0000

111 4 方法 2010 版 2015 版 验证方法 取规定量供试液及 适用性试验 按控制菌检查法取 10~100cfu 试验菌接入增菌培养基中, 依相应的控制菌检查方法进行检查 当采用薄膜过滤时, 取规定量供试液, 过滤, 冲洗, 规定量供试液及不大于 100cfu 的试验菌接入规定的培养基中 ; 采用薄膜过滤时, 取规定量供试液, 过滤, 冲洗, 试验菌应在最后一 试验菌应加在最后一次冲洗液中, 次冲洗液中, 过滤后注入规定的 过滤后, 注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中 培养基或取出滤膜接入规定的培养基中 依相应的控制菌检查方 法, 在规定的温度及最短时间下 培养, 应能检出所加试验菌相应 的反应特征 111 Presentation title in footer 00 Month 0000

112 5 方法适用性试验结果判断 : 2010 版 2015 版 结果判断 若上述试验检出试验菌, 结果判断 上述试验若检出试验 按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查 ; 若未 菌, 按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品的该控制菌检查 ; 检出试验菌, 应采用培养基稀释法 若未检出试验菌, 应消除供试品的 离心沉淀法 薄膜过滤法 中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性, 并重新进行方法验证 验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行 抑菌活性 ( 非无菌产品微生物检查 : 微生物计数法 中的 抗菌活性的去除或灭活 ), 并重新进行方法适用性试验 如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除, 可认为 受抑制的微生物不可能存在于该供 试品中, 选择抑菌成份消除相对彻 底的方法进行供试品的检查 112 Presentation title in footer 00 Month 0000

113 供试品检查

114 按方法适用性试验确认的方法进行 阳性对照试验 : 方法同供试品的控制菌检查, 对照菌的加量应不大于 100cfu 阳性对照试验应检出相应的控制菌 阴性对照试验 : 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查, 阴性对照试验应无菌生长 如果阴性对照有菌生长, 应进行偏差调查 114 Presentation title in footer 00 Month 0000

115 1 耐胆盐革兰阴性菌 耐胆盐革兰阴性菌 (Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria) 取代 2010 年版大肠菌群 (Coliform) 检查 大肠菌群的定义是指在 37 生长时能发酵乳糖,24h 内产酸产气的革兰阴性 氧化酶阴性 需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌 它不是分类学上的名称 符合上述定义的菌除埃希菌属外, 还包括肠杆菌科的肠杆菌属 枸橼酸菌属 克雷伯菌属

116 耐胆盐革兰阴性菌 供试液制备胰酪大豆胨肉汤 -- 1:10 供试液 预培养 1:10 供试液 20~25 约 2 小时, 细菌充分恢复但不增殖

117 耐胆盐革兰阴性菌 未检出试验 --- 标准中规定不得检出 定量试验 --- 标准中规定应小于

118 耐胆盐革兰阴性菌 未检出试验 1. 预培养物 --- 划线紫红胆盐葡萄糖琼脂 2. 有菌落生长 --- 检出 无菌落生长 --- 未检出

119 耐胆盐革兰阴性菌 定量试验 1. 取三个稀释剂预培养物分别接种肠道菌增菌肉汤 2. 划线紫红胆盐葡萄糖琼脂 3. 根据阳性或阴性结果查可能数表 4. 判断 1g 或 1ml 供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌最大可能数

120 肠道菌增菌 EE 肉汤 作用机制 用于胆汁耐受型革兰氏阴性细菌选择性增菌 亮绿及牛胆几乎可以完全抑制不需要的伴生菌丛生长 葡萄糖支持所有肠道菌的生长 强缓冲能力可以避免产生的酸对培养的破坏 成分 明胶蛋白胨 10.0;D(+) 葡萄糖 5.0; 牛胆粉 20.0; 亮绿 0.015; 二水合磷酸氢二钠 8.0; 磷酸氢二钾 2.0. 制备 配制成 45g/L 悬液, 取悬液 100ml 于测试试管, 温和环境下灭菌,121 灭菌 5 分钟, 使用水浴或蒸汽 100 灭菌 30 分钟 请勿长时间高压灭菌 ph:7.2±0.2,25 肉汤呈绿色, 澄清 操作及评价 接种样品于肉汤 培养 : 需氧,35 培养 24~48 小时 ( 大肠杆菌 / 绿脓杆菌,24 小时 ; 金黄色葡萄球菌, 小时 ) 若肉汤中出现菌种生长, 取一些用选择性培养基分离鉴定

121 结晶紫中性红胆盐琼脂 VRBD Agar 作用机理 结晶紫和胆盐抑制伴生微生物生长 葡萄糖降解产酸, 指示剂变红, 周围产生胆酸沉淀圈 所有肠道菌群都可将葡萄糖降解成酸, 故都可被检出 但是有一些伴生菌如产气单胞菌也有上述反应 成分 明胶蛋白胨 7.0; 酵母抽提物 3.0; 氯化钠 5.0; D(+) 葡萄糖 10.0; 胆盐混合物 1.5; 中性红 0.03; 结晶紫 0.002; 琼脂 制备 使用去矿物质水, 配制成 39.5g/L 悬液 ; 匀速搅拌加热至完全溶解 ; 加热不能超过 2 分钟 ; 勿高温灭菌, 勿过度加热 ; ph:7.4±0.2,25 培养基呈深红色, 澄清 肠道菌群的鉴别需要进一步实验 操作及评价 接种 : 样品均匀且薄, 涂布于平板上 ; 培养 :35 培养 18 小时 ; 革兰氏阳性菌 35 培养 24 小时 121 菌落的鉴定需要进一步实验

122 2 大肠埃希菌 供试液制备 1:10 供试液 ( 按计数法 ) 预培养 相当 1g 或 ml 供试液 -- 适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 30~35 18~24h 选择增菌取预培养物 -- 麦康凯肉汤 42~44 24~48h 分离培养取麦康凯肉汤培养物 -- 麦康凯琼脂平板 30~35 18~72h 结果判断 麦康凯琼脂平板有菌生长 --- 分离 纯化及适宜的鉴定试验确证是否为大肠埃希菌 是 -- 判检出, 否 -- 判未检出 麦康凯琼脂平板无菌生长 --- 未检出 关注 : 1 增菌培养基未规定最低用量 --- 适宜体积 2 增加预培养 增菌培养温度为 42~44 3 培养基变化胰酪大豆胨肉汤麦康凯肉汤麦康凯琼脂平板 4 取消 MUG-I 试验

123 麦康凯肉汤 作用机制 肉汤内含有乳糖, 乳糖降解产气产酸, 可以作为指示大肠杆菌的有无 乳酸产气收集于 DURHAM 发酵管中, 产酸可使溴甲酚紫变黄 牛胆促进肠道菌群的生长, 并能抑制非寄生于肠道的微生物 成分 明胶蛋白胨 20.0; 乳糖 10.0; 牛胆粉 5.0; 溴甲酚紫 制备 配制成 35g/L 悬液, 加入 100ml 培养瓶, 如需要加入 DURHAM 发酵管 ; 121 灭菌 15 分钟 ; ph:7.3±0.2,25 ; 平板呈紫色, 澄清 操作及评价 接种 : 取 1ml 前增菌液加入 100ml 麦康凯肉汤 培养 :35 培养 48 小时 产气产酸 : 肠菌群或大肠杆菌可能阳性 产酸 : 肠菌群可能阳性, 大肠杆菌阴性 123

124 麦康凯琼脂 作用机制 选择性培养基用于分离沙门氏菌 志贺菌和肠菌群 胆盐和结晶紫能够广泛抑制革兰氏阳性菌的生长 ph 指示剂中性红检测乳糖降解 成分 明胶蛋白胨 17.0; 酪蛋白胨 1.5; 肉蛋白胨 1.5; 氯化钠 5.0; 乳糖 10.0; 胆盐混合物 1.5; 中性红 0.03; 结晶紫 0.001; 琼脂 制备 配制成 50g/L 悬液 ; 121 灭菌 15 分钟 ; 浇平板 ph:7.1±0.2,25 ; 平板呈棕红色或深红色, 澄清 储存 温度 : +15 到 +25 密封, 干燥 避光 操作及评价 接种 : 样品涂布接种于平板 培养 :35, 培养 18~24 小时 乳糖阴性菌落无色 ; 乳糖阳性显红色, 周围浑浊区, ph 值下降导致胆酸沉淀而形成 124

125 3 沙门菌 供试液制备和预培养 预培养样品 10g 或 10ml 适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 选择和分离培养 增菌取预培养物 0.1ml 至 10mlRVS( 氯化镁孔雀绿沙门菌增菌培养基 ) 增菌肉汤 分离取少量增菌培养物 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 典型疑似菌 淡红色或无色 透明或半透明, 中心有或无黑色 疑似菌 三糖铁高层斜面琼脂高层穿刺斜面划线或采用其他适宜方式鉴定 结果判断 1 分离平板无菌落生长 2 有菌落生长但结果阴性 3 斜面不变红 底层不变黄 ; 斜面黄色 底层不变黄不变黑 上述 均判未检出 三糖铁 1 斜面红色底层黄色 ; 2 斜面黄色底层黄或黑色适宜方法鉴定是否沙门菌, 是判检出 关注 : 培养基减少 改变 ; 预培养物取量减少 (1ml 0.1ml)

126 RVS 沙门氏增菌肉汤 作用机制 孔雀绿和氯化镁浓度减低, 促进沙门氏菌在 43 下生长 大豆胨也可以促进生长 ph 降至 5.2 增加培养基选择性 成分 大豆胨 4.5; 六水合氯化镁 29.0; 氯化钠 8.0; 硫酸氢二钾 0.6; 孔雀绿 制备 配制成 42.5g/L 悬液 ; 温和加热, 若有需要, 分装于试管中 ; 温和灭菌,115 灭菌 15 分钟 ph:5.2±0.2,25. 肉汤呈深蓝, 澄清 配制好的培养基可在冰箱中储存至少 7 个月 操作及评价 接种 : 将前增菌液 ( 蛋白胨缓冲水前增菌 ) 接种培养 41.5, 沙门氏菌培养 18 小时, 金黄色葡萄球菌培养 24 小时 将增菌液划线接种于选择性培养基 (XLD 琼脂 ) 126

127 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂 XLD Agar 作用机理 戊醛糖 乳糖和蔗糖降解产酸, 指示剂酚红由红变黄 产生的硫化氢可使硫代硫酸盐和 Fe 3+ 在菌落中形成黑色的硫化铁沉淀 细菌将赖氨酸脱羧至戊二胺, 因为 ph 值升高菌落周围显示紫色 反应可以同时发生或连续发生, 可使 ph 指示剂颜色显示不同深浅, 长时间培养也可能由黄变红 该培养基抑制能力弱 成分 酵母抽提物 3.0; 氯化钠 5.0;D(+) 戊醛糖 3.5; 乳糖 7.5; 蔗糖 7.5;L(+) 赖氨酸 5.0 硫代硫酸钠 6.8; 脱氧胆酸钠 2.5; 柠檬酸铁铵 0.8; 酚红 0.08; 琼脂 Presentation title in footer 00 Month 0000

128 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂 XLD Agar 制备 取 55.2g 培养基加入 50ml 去矿物质水的烧瓶中 ; 搅拌完全混合后, 加入另外 950ml 去矿物质水, 搅拌至完全混合无结块 ; 加热搅拌至完全溶解 ( 多种方式震荡 ); 水浴, 快速冷却至 47~50 ; 摇动烧瓶加速冷却 ; 浇平板 ; 干燥平板, 做无菌测试 备注 : 勿大量制备 ; 勿加热过度 ; 勿长时间放于 47~50 水浴 ph:7.4±0.2,25. 培养基呈红色, 澄清 操作及评价 接种 : 样品均匀且薄涂布与平板上 ; 培养 : 沙门氏菌 35 培养 18 小时 ; 大肠杆菌 35 培养 48 小时 菌落的鉴定需要进一步实验 128

129 4 金黄色葡萄球菌 供试液制备和预培养 预培养相当 1g 或 1ml 供试液 --- 适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 选择和分离培养甘露醇氯化钠琼脂 结果判断 1 有菌落生长黄色菌落 或外周有黄色环的白色菌落应分离纯化及适宜的鉴定试验来确认是否为金黄色葡萄球菌 2 无菌落生长或无上述疑似菌落生长 以及疑似菌鉴定为阴性结果, 判未检出金黄色葡萄球菌 3 疑似是菌鉴定为阳性结果, 判检出金黄色葡萄球菌 关注 : 减少培养基 未收载血浆凝固酶试验方法

130 甘露醇盐酚红琼脂 作用机制 由于盐浓度高, 仅耐盐微生物如葡萄球菌可在该培养基上生长 甘露醇降解产酸与致病性金黄色葡萄球菌相关, 以此作为指示剂 成分 酪蛋白胨 5.0; 动物组织酶解物 5.0; 肉抽提物 1.0; 氯化钠 75.0; D(+)- 甘露醇 10.0 ; 酚红 0.025; 琼脂 12.0 制备 配制成 108g/L 悬液 ; 121 灭菌 15 分钟 ; 浇平板 ; ph:7.4±0.2,25. 平板呈红色, 澄清 操作及评价 接种 : 涂布接种于平板 由于培养基有很强的抑菌作用, 接种量加大 培养 :35 培养 3 天 进一步鉴定实验 130

131 5 铜绿假单胞菌 供试液制备和预培养 预培养相当 1g 或 1ml 供试液 --- 适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 选择和分离培养 氧化酶 有菌落生长作氧化酶试验 结果判断 溴化十六烷基三甲胺琼脂 1% 二盐酸二甲基对本苯二胺试液 阳性 30 秒内红色 - 紫红色阴性不变色 1 分离平板菌落氧化酶阳性进行适宜鉴定试验, 确认是否为铜绿假单胞菌, 是判检出 2 无菌落生长或鉴定结果为阴性时判未检出 修订内容 : 增菌培养基 BL 改为预增菌胰酪大豆胨肉汤 溴化十六烷基三甲胺平板菌落未描述, 均应作氧化酶试验 未收载绿脓菌素生化试验方法, 强调适宜鉴定试验鉴定

132 铜绿假单胞菌选择性培养基, 基础 作用机制 LOWBURY 于 1951 年推荐溴棕三甲胺, 该化合物能够广泛抑制绿脓杆菌伴生菌丛的生长 根据 LOWBURRY 和 COLLINS 研究 (1955),0.3g/L 的浓度可以成功抑制菌丛生长并且将对绿脓杆菌的干扰减至最小, 不会抑制绿脓杆菌产生色素 GOTO 和 ENOMOTO(1970) 推荐另加萘啶酮酸 15ug/mL, 以增加抑制效果 成分 明胶蛋白胨 20.0; 氯化镁 1.4; 硫酸钾 10.0; 溴化十六烷基三甲铵 ( 溴棕三甲胺 )0.3; 琼脂 13.6 选择添加 : 丙三醇 10mL 制备 配制 45.3g/L 悬液, 加入丙三醇 10ml/L; 121 灭菌 15 分钟 ; 浇平板 ; ph:7.2±0.2,25. 平板呈浑浊亮棕色 132 Presentation title in footer 00 Month 0000

133 铜绿假单胞菌选择性培养基, 基础 操作 接种 : 涂布法接种于平板 培养 : 需氧,35 温度下, 绿脓杆菌培养 18 小时, 其他伴生菌丛 72 小时 绿脓杆菌产生铜绿色素 ( 绿脓菌素 ), 紫外灯下发荧光 还可以做更多鉴定实验 133 Presentation title in footer 00 Month 0000

134 6 梭菌 供试液制备和热处理 选择和分离培养梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基 过氧化氢酶试验 结果判断 厌氧培养 (2010 版为庆大霉素哥伦比亚琼脂培养基 ) 1 哥伦比亚琼脂平板生长有带或不带芽孢的厌氧杆菌 过氧化氢酶阴性, 应作适宜的鉴定试验确认是否为梭菌, 是判为检出梭菌 2 a 哥伦比亚琼脂平板未生长厌氧杆菌 注意 b 疑似菌鉴定结果为阴性 c 疑似菌过氧化氢酶阳性 a b c 均判为未检出梭菌 1 培养基不加抗生素 2 厌氧杆菌未提革兰阳性

135 哥伦比亚琼脂, 基础 作用机制 哥伦比亚琼脂基础可以用于培养苛养菌, 也可以作为配制特殊培养基的基础 该培养基可以用于配制血琼脂或熟血琼脂 ( 巧克力琼脂 ), 选择性培养可以加入抑制剂 还可以配制乳糖牛奶蛋黄琼脂用于苛养梭菌, 配制成 AC 琼脂用于食物中李斯特菌选择培养, 或者伤寒杆菌毒性实验等 成分 酪蛋白胨 10.0; 肉蛋白胨 5.0; 心脏提取物 3.0, 酵母提取物 5.0; 淀粉 1.0; 氯化钠 5.0; 琼脂 13.0 方法 配制 42g/L 悬液, 121 灭菌 15 分钟 ; 冷却至 45~50 加入热敏添加剂 ; ph:7.3±0.2,25. 平板棕黄色, 澄清 加入血后, 亮红色, 无溶血性 135 Presentation title in footer 00 Month 0000

136 哥伦比亚琼脂, 基础 血琼脂制备 : 取 5mL 均匀混合于 95mL 已灭菌培养基, 浇平板 说明 : 需氧 35 下培养 24 小时 ; 厌氧梭状芽孢杆菌培养 48 小时 储存温度 :+ 15 至 密封, 干燥, 避光 样品临床样品收集 操作步骤按照通用说明进行 操作根据配置培养基用途而制定 136 Presentation title in footer 00 Month 0000

137 强化梭状芽孢杆菌培养基 作用机制 不含任何抑制剂, 半胱氨酸作为还原剂 可加入多粘菌素 B 来抑制革兰氏阴性菌 成分 肉抽提物 10.0; 蛋白胨 10.0; 酵母抽提物 3.0;D(+) 葡萄糖 5.0; 淀粉 1.0; 氯化钠 5.0; 醋酸钠 3.0;L- 半胱氨酸盐酸盐 0.5; 琼脂 0.5. 制备 配制成 38g/L 溶液 ; 分装于试管中 ; 121 灭菌 15 分钟 ; 冷却, 如需要, 加 0.02g 多粘菌素 B 0.02g/L, 混匀 ; ph:6.8±0.2,25. 试管中培养基呈黄色, 澄清 操作及评价 接种 : 接种后建议在培养基上封一层石蜡或琼脂 培养 :35, 培养 24~48 小时, 厌氧环境 137 菌落计数, 如有需要, 进一步测试

138 7 白色念珠菌 供试液制备和预培养 预培养相当 1g 或 1ml 供试液 ml 沙氏葡萄糖肉汤 30~35 3~5 天 (2010 版 23~28 48~72h) 选择和分离培养沙氏葡萄糖琼脂念珠菌显色培养基 30~35 24~48h(2010 版 23~28 ) 沙氏葡萄糖琼脂疑似菌落呈乳白色, 偶见淡黄色, 表面光滑有浓酵母气味, 培养时间稍长则菌落增大, 颜色变深 质地变硬或有皱褶 疑似菌落转种念珠菌显色培养基 结果判断 1 念珠菌显色培养基生长阳性菌落, 作适宜的鉴定试验来确认是否为白色念珠菌, 是判检出 2 无菌落生长或无上述疑似菌落生长 以及疑似菌鉴定为阴性结果, 判未检出白色念珠菌 关注 : 培养温度 时间改变

139 沙氏 2% 葡萄糖肉汤 成分肉蛋白胨 5.0; 酪蛋白胨 5.0;D(+) 葡萄糖 制备配制成 30g/L 悬液 ; 如需要分装于小容器中 ; 121 灭菌 15 分钟 ; ph:5.6±0.2,25. 肉汤呈黄棕色, 澄清 实验操作根据用途制定步骤 培养 :28 培养 7 天 139 Presentation title in footer 00 Month 0000

140 沙氏 4% 葡萄糖琼脂 成分肉蛋白胨 5.0; 酪蛋白胨 5.0;D(+) 葡萄糖 40.0; 琼脂 制备配制成 65g/L 悬液 ; 121 灭菌 15 分钟 ; 勿加热过度 ; ph:5.6±0.2,25. 平板成黄棕色, 澄清 储存温度 :+15 到 +25 密封, 干燥, 避光 操作根据要求接种样品于平板上 生长的真菌菌落可肉眼观察或显微镜观察 培养 :28 培养 7 天 140 Presentation title in footer 00 Month 0000

141 各控制菌确认疑似菌关注点 各控制菌项下确认疑似菌 体现出采用较少的生化实验, 及均强调 采用适宜的方法进行鉴定 确认 在指导原则中指出 ---- 控制菌检查没有规定进一步确证疑似致病菌的方法, 若供试品检出疑似致病菌时, 确认的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法, 如细菌鉴定一般依据 伯杰氏细菌鉴定手册

142 非无菌药品微生物限度标准

143 参考欧美药典标准限度标准由 数量 向 数量级 转变 1 修订菌数标准表述方式 : 限度标准以指数形式 10 n CFU 表示, 最大可接受限度值遵循 2 倍原则 10 1 cfu 为可接受的最大限度为 20; 10 2 cfu 为可接受的最大限度为 200; 以此类推 虽然扩大了限度的标准, 但是对过程控制的要求有了很大的提高, 培养基的营养能力也有很大提高, 未来将向参数放行方向发展 143 Presentation title in footer 00 Month 0000

144 参考欧美药典标准 2. 检查指标 需氧菌总数 :TAMC( 替代细菌数 ) 耐胆盐革兰氏阴性菌 ( 替代大肠菌群 ) 3. 按照制剂类型进行分类控制齿龈 皮肤制剂原辅料 中药提取物 中药饮片的控制呼吸道制剂耐胆盐革兰氏阴性菌的控制 144

145 限度标准制定原则及特点 1 基于药品的 9 种给药途径及对患者的潜在危害划分风险等级, 增加控制项目 齿龈 皮肤制剂 呼吸道制剂 严格控制潜在致病菌, 从安全性角度考虑是否需无菌控制 增加原辅料 中药提取物 中药饮片的控制 参考制剂的要求及生产工艺特点设置控制菌检查要求 145

146 非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准 给药途径 需氧菌总数 (CFU/g CFU/ml 或 CFU/10cm 2 ) 霉菌及和酵母菌总数 (CFU/g CFU/ml 或 CFU/10cm 2 ) 控制菌 口服给药固体制剂液体制剂 不得检出大肠埃希菌 (1g); 含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌 (10g 或 10ml) 口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂 耳用制剂皮肤给药制剂 呼吸道吸入给药制剂 不得检出大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 (1g 1ml 或 10cm 2 ) 不得检出金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞 菌 (1g 1ml 或 10cm 2 ) 不得检出大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 耐胆盐革兰阴性菌 (1g 或 1ml)

147 非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准 给药途径 阴道 尿道给药制剂 直肠给药固体制剂液体制剂 其他局部给药制剂 需氧菌总数 (CFU/g CFU/ml 或 CFU/10cm 2 ) 霉菌及和酵母菌总数 (CFU/g CFU/ml 或 CFU/10cm 2 ) 控制菌 不得检出金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 (1g 1ml 或 10cm 2 ), 中药制剂还不得检出梭菌 (1g 1ml 或 10cm 2 ) 不得检出金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 (1g 或 1ml) 不得检出金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 (1g 1ml 或 10cm 2 ) 化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成份及矿物质还不得检出沙门菌 (10g 或 10ml) 147

148 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准 给药途径 需氧菌总数 (CFU/g 或 CFU/ml 或 cfu/10cm 2 ) 霉菌和酵母菌总数 (CFU/g 或 CFU/mL 或 cfu/10cm 2 ) 控制菌 固体口服给药制剂不含豆豉 神曲等发酵原粉含豆豉 神曲等发酵原粉 10 4 ( 丸剂 ) 不得检出大肠埃希菌 (1g); 不得检出沙门菌 (10g); 耐胆盐革兰阴性菌应小于 10 2 cfu (1g) 液体口服给药制剂不含豆豉 神曲等发酵原粉含豆豉 神曲等发酵原粉 不得检出大肠埃希菌 (1ml); 不得检出沙门菌 (10ml); 耐胆盐革兰阴性菌应小于 10 1 cfu (1 ml) 固体局部给药制剂用于表皮或黏膜不完整用于表皮或黏膜完整 148 Presentation title in footer 00 Month 不得检出金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 ( 1g 或 10cm 2 ); 阴道 尿道给药制剂还不得白色念珠菌 梭菌 (1g 或 10cm 2 )

149 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准 给药途径 需氧菌总数 (CFU/g 或 CFU/ml 或 cfu/10cm 2 ) 霉菌和酵母菌总数 (CFU/g 或 CFU/mL 或 cfu/10cm 2 ) 控制菌 液体局部给药制剂用于表皮或黏膜不完整用于表皮或黏膜完整 不得检出金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 (1ml); 阴道 尿道给药制剂还不得白色念珠菌 梭菌 (1ml) 149 Presentation title in footer 00 Month 0000

150 非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片的微生物限度标准 需氧菌总数 (CFU/g 或 CFU/ml) 霉菌和酵母菌总数 (CFU/g 或 CFU/mL) 控制菌 药用原料及辅料 未做统一规定因为原辅料可用于生产不同剂型, 控制菌按照实际生产的剂型进行控制 中药提取物 未做统一规定 中药研粉口服用贵细饮片 直接口服及泡服饮片 未做统一规定 未做统一规定 不得检出沙门菌 (10g); 耐胆盐革兰阴性菌应小于 10 4 (1 g) 150 Presentation title in footer 00 Month 0000

151 2 兼顾国产药品的生产特点, 保留中国药典对中药制剂分类特点 是否含药材原粉 是否含豆豉神曲 ( 发酵类产品 ) 是否接触完整皮肤粘膜 3 贴剂 因规格各异, 以 10cm 2 为单位控制限度 151 Presentation title in footer 00 Month 0000

152 2015 版药典 无菌检查法规解析

153 背景 1 与先进国家药典之间存在差距 微生物培养的理念差距 中国药典微生物按照类别进行划分分类培养观念错误容易造成漏检 欧美药典微生物按照营养条件进行划分考虑培养基的广谱性简便 严谨 2 全面与国际标准接轨 153

154 目标 1 加强检验过程控制 2 提高方法检出率 3 保证结果可靠性 154 请根据报告内容更新

155 1 检测环境变化 2010 版 2015 版 应在洁净度 级背景下的局部 100 级单向流空气区域内或隔离系统进行 B+A 或隔离器应在洁净度 B 级背景下的局部 A 级单向流空气区域内或隔离系统中进行, 日常检验还需对试验环境进行监控 CLASS B room LFH (class A) 155 请根据报告内容更新

156 检测环境提高原因 版 GMP 附录一 无菌药品 第十三条和附录三 生物制品 第十四条规定 : 非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为 B 级背景下的 A 级 无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求! 2 无菌检查操作过程易受环境影响, 假阳性的结果大多数是因环境问题造成的 3 无菌检查失败后, 原因调查非常困难, 提高检测环境有利于减少假阳性结果的出现 156 请根据报告内容更新

157 2 环境监测要求的变化 新增 :9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 注 :1 每月一次 157 请根据报告内容更新

158 3 培养基变化 配制后的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌 ; 制备好的培养基应保存在 2 ~ 25 避光的环境, 若保存于非密闭容器中, 一般在三周内使用 ; 若保存于密闭容器中, 一般可在一年内使用

159 培养基的变化 2010 版 2015 版 1 硫乙醇酸盐流体培养基 30~35 C;20~25 C ( 三部 ) 2 改良马丁培养基 23~28 C 3 选择性培养基 4 0.5% 葡萄糖肉汤培养基 5 营养肉汤培养基 6 营养琼脂培养基 7 改良马丁琼脂培养基 1 硫乙醇酸盐流体培养基 30~35 C;20~25 C 培养 2 胰酪大豆胨肉汤培养基 (TSB) 20~25 C 3 选择性培养基 4 0.5% 葡萄糖肉汤培养基 5 胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA) 6 沙氏葡萄糖肉汤培养基 7 沙氏葡萄糖琼脂培养基 培养基体系与国际接轨, 改变以往微生物分类培养的错误, 正确考虑培养基的广谱性 159 请根据报告内容更新

160 培养基定义变化 硫乙醇酸盐流体培养基 (FTG) 是厌氧菌检查的首选培养基, 同时也可用于需气菌检查 胰酪大豆胨肉汤培养基 (TSB) 适用于真菌和需气菌的检查 否定了检查中对微生物分类培养的概念, 即某种污染了需气菌的供试品, 无论被接种在 FTG 还是被接种在 TSB 中, 均可被检出, 不容易漏检 160 请根据报告内容更新

161 酪胨 ( 胰酶水解 ) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L- 胱氨酸 0.5g 硫乙醇酸钠 0.5g ( 或硫乙醇酸 0.3 ml) 琼脂 0.75g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml 培养厌氧菌 需气菌 161 请根据报告内容更新 硫乙醇酸盐流体培养基 胰酪胨和酵母膏粉提供碳氮源 维生素和生长因子 ; 葡萄糖提供可发酵糖类, 更利于生长 ; 氯化钠维持均衡的渗透压 ; 硫乙醇酸钠和 L- 胱氨酸能有效降低氧化还原电位, 防止过氧化物的积累对某些菌产生毒性, 同时其硫氢基团有钝化含砷 汞及其它重金属防腐剂的抑菌作用 ; 少量琼脂的凝固作用可防止二氧化碳 氧气和还原产物的扩散 ; 刃天青是氧化还原指示剂, 氧化状态呈粉红色, 还原状态无色

162 培养基成分对比 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0g 培养真菌 改良马丁培养基 主要提供真菌类生长的营养成分, 蛋白胨提供碳源和氮源 ; 磷酸氢二钾为缓冲剂 ; 酵母粉提供 B 族维生素 ; 硫酸镁提供必须的微量元素 ; 葡萄糖提供能源 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨 17.0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 / 无水葡萄糖 2.5g /2.3g 培养真菌和需气菌 酪蛋白胨 大豆木瓜蛋白酶消化物提供氮源 维生素和生长因子 ; 较高含量的氯化钠提供较高的渗透压 ; 磷酸氢二钾为缓冲剂 ; 葡萄糖提供碳源 162 请根据报告内容更新

163 胰酪大豆胨肉汤 TSB 成分酪蛋白胨 17.0; 大豆蛋白胨 3.0;D(+) 葡萄糖 2.5; 氯化钠 5.0; 磷酸氢二钾 2.5 制备配制 30g/L 悬液 ; 121 灭菌 15 分钟 ; ph:7.3±0.2,25. 培养基呈黄棕色 ; 澄清 操作和评价根据用途制定步骤 培养 :35 培养 24 小时 ; 无菌检测 : 室温培养 7 天 163 Presentation title in footer 00 Month 0000

164 培养基替换原因 TSB 与改良马丁 (MMB) 对目标微生物促生长能力无显著性差异, 为与国际先进国家药典保持一致, 利于国际交流和互认,2015 版药典采用 TSB 替代改良马丁用于需气菌和真菌的培养 164 请根据报告内容更新 引自 胰酪胨大豆培养基和改良马丁培养基的微生物促生长能力考察, 徐伟东, 许华玉, 钱维清等, 中国药品标准 2013 年第 14 卷第 4 期

165 4 培养基适用性检查变化 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行 无菌性检查 每批培养基随机取不少于 5 支 ( 瓶 ), 置各培养基规定的温度培养 14 天, 应无菌生长 灵敏度检查 165 请根据报告内容更新

166 培养基灵敏度检查用菌变化 2010 版 2015 版 1 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 (4 种 ) 2 改良马丁培养基白色念珠菌 黑曲霉 (2 种 ) 1 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌 (3 种 ) 2 胰酪大豆胨肉汤培养基 (TSB) 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 (3 种 ) 将枯草芽孢杆菌移到 TSB 灵敏度检查中, 能够确保在两种培养基中需气菌都能够生长 166 请根据报告内容更新

167 菌液制备用培养基变化 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌新鲜培养物接种至 生孢梭菌新鲜培养物接种至 白色念珠菌新鲜培养物接种至 2010 版 2015 版 营养肉汤培养基或营养肉汤琼脂培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基 胰酪大豆胨肉汤培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基 黑曲霉新鲜培养物接种至 改良马丁琼脂斜面培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 167 请根据报告内容更新

168 灵敏度检查结果判定 空白对照管应无菌生长 加菌的培养基管均生长良好 168 请根据报告内容更新

169 5 方法适用性实验变化 2010 版 2015 版 1 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于 100CFU 的金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 (4 种 ) 2 改良马丁培养基接入小于 100CFU 的白色念珠菌 黑曲霉 (2 种 ) 1 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于 100CFU 的金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌 (3 种 ) 2 胰酪大豆胨肉汤培养基 (TSB) 接入小于 100CFU 的枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 (3 种 ) 将枯草芽孢杆菌移到 TSB 检查项中, 能够确保在两种培养基中需气菌都能够生长 169 请根据报告内容更新

170 方法适用性试验 方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 薄膜过滤法 供试品按薄膜过滤法过滤, 冲洗, 在最后一次的冲洗液中加入小于 100CFU 的试验菌, 过滤 加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内 另取一装有同体积培养基的容器, 加入等量试验菌, 作为阳性对照 置规定温度培养 3~5 天 阳性对照的目的 : 该检验条件下有无抑菌作用? 170

171 方法适用性试验 直接接种法 取硫乙醇酸盐流体培养基 6 管, 分别接入小于 100CFU 的金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌各 2 管, 其中 1 管接供试品 取胰酪大豆胨液体培养基 6 管, 分别接入小于 100CFU 的枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉各 2 管, 其中 1 管接供试品 置规定的温度培养 3~5 天 171 请根据报告内容更新

172 方法适用性试验 结果判断 与对照管比较, 含供试品各容器中的试验菌均生长良好 若含供试品容器中的试验菌生长微弱 缓慢或不生长, 则说明供试品有抑菌作用, 应采用下列方法, 消除供试品的抑菌作用, 并重新进行方法适用性试验 增加冲洗量 增加培养基的用量 ( 直接接种法 ) 使用中和剂或灭活剂 更换滤膜品种 172 请根据报告内容更新 PVDF

173 方法适用性试验影响因素 供试液的制备 供试液浓度过高增加了滤膜的初始吸附量, 从而导致了后期冲洗体积的增大, 因此将供试液浓度控制在一定范围之内有助于提高无菌检查方法的科学性

174 方法适用性试验影响因素 冲洗条件 主要是冲洗体积对于无菌检查方法的影响, 冲洗体积过大滤膜的截留能力会降低, 导致无菌检查假阴性结果的出现 冲洗量控制在 1000ml/ 膜以内

175 方法适用性试验影响因素 有抑菌供试品加入中和剂的选择 选择 : 对应的理化特性作为选择依据, 如 β- 内酰胺酶 MnSO4 ; 应对微生物的生长无影响

176 6 供试品的无菌检查变化 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法 只要供试品性质允许, 应采用薄膜过滤法 供试品检查方法应与方法适用性试验确认的方法相同 若使用表面活性剂 灭活剂 中和剂等试剂, 应证明其有效性, 且对微生物无毒性 176

177 检验数量变化 177 请根据报告内容更新 2010 版 2015 版 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量 除另有规定外, 出厂产品按表 1 规定 ; 上市产品监督检查按表 2 表 3 规定 表 1 表 2 表 3 中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量 删除 : 一般情况下, 供试品无菌检查若采用薄膜过滤法, 应增加 1/2 的最小检验数量作阳性对照用 ; 若采用直接接种法, 应增加供试品 1 支 ( 或瓶 ) 作阳性对照用 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量 除另有规定外, 出厂产品按表 1 规定 ; 上市产品监督检查按表 2 规定 表 1 表 2 中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量 删除原因 ( 二三部不同 ):1 三部规定培养 14 天后加入阳性菌, 不增加阳性对照供试品 2 在阳性对照项中已有原则要求 : 供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品 3 化药依然要做阳性对照

178 检验量变化 178 请根据报告内容更新 2010 版 2015 版 是指一次试验所用的供试品总量 (g 或 ml) 除另有规定外, 每份培养基接种供试品的量按表 2 表 3 规定 采用直接接种法时, 若每支 ( 瓶 ) 供试品的装量按规定足够接种两份培养基, 则应分别接种硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基 采用薄膜过滤法时, 检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量, 只要供试品特性允许, 应将所有容器内的全部内容物过滤 是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量 (g 或 ml) 除另有规定外, 供试品检验量按表 3 规定 若每支 ( 瓶 ) 供试品的装量按规定足够接种两种培养基, 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基 采用薄膜过滤法时, 只要供试品特性允许, 应将所有容器内的全部内容物过滤 要求每一个样品都能够均匀分散到 TSB 和 FTM 中 例如取 10 支样品, 要求每 1 支都能够分散到两个培养基中

179 阳性对照 按照二部规定 : 应根据供试品特性选择阳性对照菌 : 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的, 金黄色葡萄球菌为对照菌 抗革兰阴性菌为主的, 大肠埃希菌为对照菌 ; 抗厌氧菌的, 生孢梭菌为对照菌 ; 抗真菌的, 白色念珠菌为对照菌 阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验, 加菌量小于 100CFU 供试品用量 = 供试品检查时接种的样品量 阳性对照管培养 48~72 小时应生长良好 179

180 阴性对照 按照二部规定 : 供试品无菌检查时, 应取相应溶剂和稀释液 冲洗液同法操作, 作为阴性对照 阴性对照不得有菌生长 180 请根据报告内容更新

181 薄膜过滤法变化 2010 版 2015 版 薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器, 也可使用一般薄膜过滤器 水溶液供试品取规定量, 直接过滤, 或混合至含适量稀释液的无菌容器内, 混匀, 立即过滤 如供试品具有抑菌作用或含防腐剂, 须用适量的冲洗液冲洗滤膜, 冲洗次数不得少于三次, 所用的冲洗量 冲洗方法同方法验证试验 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器 水溶液供试品内容未变化增加 : 除生物制品外, 一般样品冲洗后,1 份滤器加入 100ml 硫乙醇酸盐流体培养基,1 份滤器加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基 生物制品样品冲洗后,2 份滤器加入 100ml 硫乙醇酸盐流体培养基,1 份滤器加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基 必须使用封闭式薄膜过滤器分别给出一般产品和生物制品薄膜过滤的不同操作方法 曾经发现个别品种在 181 请根据报告内容更新 20~25 培养的硫乙醇酸盐流体培养基中有菌生长

182 直接接种法变化 2010 版 2015 版 直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中 给出一般产品和生物制品直接接种的不同操作方法首选薄膜过滤法, 不提倡直接接种法 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品, 即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中 新增 : 除生物制品外, 一般样品无菌检查时两种培养基接种的支 / 瓶数相等 ; 生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支 / 瓶数为 2:1 182 请根据报告内容更新

183 培养及观察变化 2010 版 2015 版 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养 14 天 ; 不能从外观上判断有无微生物生长, 可取该培养基液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上, 细菌培养 2 天 真菌培养 3 天, 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养 14 天 ; 增加 : 接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份, 一份置 30~35 培养, 一份置 20~ 25 培养 不能从外观上判断有无微生物生长, 可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中, 培养 3 天 给出一般产品和生物制品直接接种的不同培养条件进一步消除微生物分类培养的概念 183 请根据报告内容更新

184 结果判断 阳性对照管应生长良好, 阴性对照管不得有菌生长 否则, 试验无效 若供试品管均澄清, 或虽显浑浊但经确证无菌生长, 判供试品符合规定 ; 若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长, 判供试品不符合规定, 除非能充分证明试验结果无效, 即生长的微生物非供试品所含 184 请根据报告内容更新

185 结果判断 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效 : (1) 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求 (2) 回顾无菌试验过程, 发现有可能引起微生物污染的因素 (3) 供试品管中生长的微生物经鉴定后, 确证是因无菌试验中所使用的物品和 ( 或 ) 无菌操作技术不当引起的 试验若经确认无效, 应重试 重试时, 重新取同量供试品, 依法检查, 若无菌生长, 判供试品符合规定 ; 若有菌生长, 判供试品不符合规定 185 请根据报告内容更新

186 无菌检查失败原因调查 1. 文件检查 2. 确认污染 3. 过程回顾 4. 确认无菌保障体系 5. 环境监控 6. 实验用仪器 7. 培养基 8. 冲洗液和添加剂 9. 无菌检验耗材 10. 实验检查 11. 确认污染关联 12. 无菌试验的整体验证

187 4 制药用水

188 原水 制药用水的原水通常为饮用水, 要求符合 GB 生活饮用水卫生标准 检测方法参照 GBT 生活饮用水标准检验方法微生物指标 188

189 制药用水 纯化水 采用循环方式保存 ( 2010 版 GMP ) 注射用水 注射用水可采用 70 以上保温循环 (2010 版 GMP) 灭菌注射用水 2010 版 GMP 第一百条应当对制药用水及原水的水质进行定期监测, 并有相应的记录 第一百零一条应当按照操作规程对纯化水 注射用水管道进行清洗消毒, 并有相关记录 发现制药用水微生物污染达到警戒限度 纠偏限度时应当按照操作规程处理 189 请根据报告内容更新

190 中国药典制药用水国家标准 - 纯化水 检测项目 2010 版 2015 版 细菌数霉菌酵母菌总数 需氧菌总数 检测量未规定不少于 1ml 检测方法薄膜过滤法薄膜过滤法 培养基 国家标准 营养琼脂 30~35 培养 3 天玫瑰红钠琼脂 23~28 培养 5 天 每 1ml 细菌 霉菌酵母菌总数不得过 100 个 R2A 琼脂培养基 30~35 培养不少于 5 天 每 1ml 供试品中需氧菌总数不得过 100cfu 190 请根据报告内容更新

191 中国药典制药用水国家标准 - 注射用水 检测项目 2010 版 2015 版 细菌数霉菌酵母菌总数 需氧菌总数 检测量至少 200ml 不少于 100ml 检测方法薄膜过滤法薄膜过滤法 培养基 营养琼脂 30~35 培养 3 天玫瑰红钠琼脂 23~28 培养 5 天 R2A 琼脂培养基 30~35 培养不少于 5 天 国家标准 每 100ml 细菌 霉菌酵母菌总数不得过 10 个 每 100ml 供试品中需氧菌总数不得过 10cfu 191 请根据报告内容更新

192 培养基适用性检查 参照通则 1105 中 计数培养基适用性检查 的胰酪大豆胨琼脂培养基的适用性检查方法进行, 试验菌株为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌 192 请根据报告内容更新

193 变化原因 检测方法 中外药典对比 USP 35 EP 版中国药典 纯化水 : 平皿法或薄膜过滤法注射用水 : 薄膜过滤法 纯化水和注射用水均为薄膜过滤法 纯化水和注射用水均为薄膜过滤法 培养基 平板计数琼脂 PCA, 胰蛋白葡萄糖酵母培养基 (TGYA), 或其他用于标准方法中的培养基 R2A 营养琼脂玫瑰红钠琼脂 培养温度 30~35 30~35 30~35 23~28 培养时间 48~72h 5 天 3 天 5 天 取样量 纯化水 : 最少 1ml 注射用水 : 最少 100ml 纯化水 : 根据预期含菌量决定取样体积注射用水 : 最少 200ml 纯化水 : 最少 1ml 注射用水 : 最少 200ml 193 请根据报告内容更新

194 成分 营养琼脂玫瑰红钠琼脂 R2A 配方 :(g/l) 胨 10.0 牛肉浸粉 3.0 氯化钠 5.0 琼脂 14.0 配方 :(g/l) 蛋白胨 5.0 磷酸二氢钾 1.0 玫瑰红钠 硫酸镁 0.5 葡萄糖 10.0 琼脂 14.0 配方 :(g/l) 酵母浸出粉 0.5 提供微量元素和维生素 蛋白胨 0.5 酪蛋白水解物 0.5 提供氮源 碳源 维生 素 氨基酸 矿物质 葡萄糖 0.5 提供碳源 可溶性淀粉 0.5 中和细菌代谢的有毒物质 磷酸二氢钾 0.3 ph 值缓冲剂 无水硫酸镁 提供二价阳离子和硫酸根离子 丙酮酸钠 0.3 修复受损细菌 琼脂 15 培养基凝固剂 类型富营养培养基低营养培养基 194

195 R2A Agar R2A 用于检测计数制药用水中异养菌 该培养基营养含量低, 同时培养温度低和培养时间长, 有利于水中耐压耐氯菌的恢复生长 药典推荐使用 195 Presentation title in footer 00 Month 0000

196 采集国内 13 家制药企业纯化水系统 90 个水样 13 家企业涵盖 7 家国内制药企业,1 家中外合资制药企业,1 家外资制药企业,4 家医院制剂室, 地域分布浙江 陕西 天津 对比 USP35 EP7.0 CHP2010 在制药用水中微生物的检出率 引自 制药用水微生物限度检查新方法的研究 李珏洪利娅王知坚杨晓莉阎雅宁 药物分析杂志 2014 年第 2 期 浙江省食品药品检验研究院陕西省食品药品检验所天津市药品检验所 196 请根据报告内容更新

197 结果 : 参照 CHP2010 和 USP35 测定,13 家制药企业中有 1 家超过标准限度范围, 其余均符合规定 参照 EP7.0 测定,13 家制药企业中有 5 家超过标准限度范围, 其余符合规定 污染菌检出率方面 CHP 与 EP 之间存在较大差异, 原因在于培养体系不同 197 请根据报告内容更新

198 参考 EP 培养体系 1 新版 GMP 明确要求企业应当对制药用水进行定期监测, 发现制药用水微生物污染达到警戒限度 纠偏限度时应当按照操作规程处理 2 制药企业应对制药用水微生物污染情况进行长期的跟踪监测, 掌握其趋势变化, 适时采取必要的措施保证制药用水质量持续符合法规要求 3 必须采取适宜的制药用水微生物污染监测手段 4 原培养体系污染菌检出率较低, 且计数结果不准确 5 原培养体系不便于国际交流 198 请根据报告内容更新

199 R2A 培养基起源 199 请根据报告内容更新

200 200

201 201 请根据报告内容更新

202 Thank You!