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域承郝
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1 中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验 National food safety standard Food microbiological examination:enterobacter sakazakii 发布实施中华人民共和国卫生部发布

2 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 删除了附录 A 中 A.3 本标准的附录 A 附录 B 为规范性附录本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB/T I

3 食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验 1 范围本标准规定了食品中阪崎肠杆菌 (Enterobacter sakazakii) 的检验方法本标准适用于婴幼儿配方食品乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验 2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 2.1 恒温培养箱 :25 ±1,36 ±1,44 ± 冰箱 :2 ~5 2.3 恒温水浴箱 :44 ± 天平 : 感量 0.1 g 2.5 均质器 2.6 振荡器 2.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 2.8 无菌锥形瓶 : 容量 100 ml 200 ml 2000 ml 2.9 无菌培养皿 : 直径 90 mm 2.10 ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 2.11 全自动微生物生化鉴定系统 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水 (buffer peptone water,bpw): 见附录 A 中 A 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 - 万古霉素 (modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium,mlst-vm): 见附录 A 中 A 阪崎肠杆菌显色培养基 3.4 胰蛋白胨大豆琼脂 (trypticase soy agar,tsa): 见附录 A 中 A 生化鉴定试剂盒 3.6 氧化酶试剂 : 见附录 A 中 A L- 赖氨酸脱羧酶培养基 : 见附录 A 中 A.5 1

4 3.8 L- 鸟氨酸脱羧酶培养基 : 见附录 A 中 A L- 精氨酸双水解酶培养基 : 见附录 A 中 A 糖类发酵培养基 : 见附录 A 中 A 西蒙氏柠檬酸盐培养基 : 见附录 A 中 A.9 2

5 第一法阪崎肠杆菌的检验 4 检验程序阪崎肠杆菌检验程序见图 1 检样 100 g(ml) +BPW 稀释液 900 ml 36 ±1,18 h±2 h 1 ml + mlst-vm 10 ml 44 ±0.5,24 h±2 h 阪崎肠杆菌显色培养基 36 ±1,24 h±2 h 挑取疑似菌落 TSA 25 ±1,48 h±4 h 挑取黄色菌落生化鉴定报告图 1 阪崎肠杆菌检验程序 5 操作步骤 5.1 前增菌和增菌取检样 100 g(ml) 加入已预热至 44 装有 900 ml 缓冲蛋白胨水的锥形瓶中, 用手缓缓地摇动至充分溶解,36 ±1 培养 18 h±2 h 移取 1 ml 转种于 10 ml mlst-vm 肉汤,44 ±0.5 培养 24 h±2 h 5.2 分离轻轻混匀 mlst-vm 肉汤培养物, 各取增菌培养物 1 环, 分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色 3

6 培养基平板,36 ±1 培养 24 h±2 h 挑取 1 个 ~5 个可疑菌落, 划线接种于 TSA 平板 25 ±1 培养 48 h±4 h 5.3 鉴定自 TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落, 进行生化鉴定阪崎肠杆菌的主要生化特征见表 1 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统表 1 阪崎肠杆菌的主要生化特征生化试验特征黄色素产生氧化酶 + - L- 赖氨酸脱羧酶 - L- 鸟氨酸脱羧酶 (+) L- 精氨酸双水解酶 + 柠檬酸水解 (+) D- 山梨醇 (-) L- 鼠李糖 + 发酵 D- 蔗糖 + D- 蜜二糖 + 苦杏仁甙 + 注 :+>99% 阳性 ;->99% 阴性 ;(+)90%-99% 阳性 ;(-)90%-99% 阴性 6 结果与报告综合菌落形态和生化特征, 报告每 100 g(ml) 样品中检出或未检出阪崎肠杆菌第二法阪崎肠杆菌的计数 7 操作步骤 7.1 样品的稀释固体和半固体样品 : 无菌称取样品 100 g 10 g 1 g 各三份, 加入已预热至 44 分别盛有 900 ml 90 ml 9 ml BPW 中, 轻轻振摇使充分溶解, 制成 1:10 样品匀液, 置 36 ±1 培养 18 h±2 h 分别移取 1 ml 转种于 10 ml mlst-vm 肉汤,44 ±0.5 培养 24 h±2 h 液体样品 : 以无菌吸管分别取样品 100 ml 10 ml 1 ml 各三份, 加入已预热至 44 分别盛有 900 ml 90 ml 9 ml BPW 中, 轻轻振摇使充分混匀, 制成 1:10 样品匀液, 置 36 ±1 培养 18h±2h 分别移取 1 ml 转种于 10 ml mlst-vm 肉汤,44 ±0.5 培养 24 h±2 h 7.2 分离鉴定同 5.2,5.3 8 结果与报告 4

7 综合菌落形态生化特征, 根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数, 查 MPN 检索表, 报告每 100 g(ml) 样品中阪崎肠杆菌的 MPN 值 ( 见附录 B 中表 B.1) 5

8 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水 (BPW) A.1.1 成分蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 12H 2 O) 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g ph 7.2 A.1.2 制法加热搅拌至溶解, 调节 ph,121 高压灭菌 15 min A.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 - 万古霉素 (Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium,mlst-vm) A.2.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (mlst) 肉汤 A 成分氯化钠 34.0 g 胰蛋白胨 20.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸二氢钾 2.75 g 磷酸氢二钾 2.75 g 十二烷基硫酸钠 0.1 g ph 6.8±0.2 A 制法加热搅拌至溶解, 调节 ph 分装每管 10 ml,121 高压灭菌 15 min A.2.2 万古霉素溶液 A 成分万古霉素 10.0 mg 10.0 ml A 制法 10.0 mg 万古霉素溶解于 10.0 ml, 过滤除菌万古霉素溶液可以在 0 ~5 保存 15 天 A.2.3 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 - 万古霉素 (Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium,mlst-vm) 每 10 ml mlst 加入万古霉素溶液 0.1 ml, 混合液中万古霉素的终浓度为 10 µg/ ml 注 :mlst-vm 必须在 24 h 之内使用 A.3 胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) A.3.1 成分 6

9 胰蛋白胨 15.0 g 植物蛋白胨 5.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g ph 7.3±0.2 A.3.2 制法加热搅拌至溶解, 煮沸 1 min, 调节 ph,121 高压 15 min A.4 氧化酶试剂 A.4.1 成分 N,N,N',N'- 四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0 g 100 ml A.4.2 制法少量新鲜配制, 于冰箱内避光保存, 在 7 d 之内使用 A.4.3 试验方法用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落, 涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上如果滤纸在 10 s 之内未变为紫红色紫色或深蓝色, 则为氧化酶试验阴性, 否则即为氧化酶实验阳性注 : 实验中切勿使用镍 / 铬材料 A.5 L- 赖氨酸脱羧酶培养基 A.5.1 成分 L- 赖氨酸盐酸盐 (L-lysine monohydrochloride) 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 溴甲酚紫 g ph 6.8±0.2 A.5.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节 ph 每管分装 5 ml,121 高压 15 min A.5.3 实验方法挑取培养物接种于 L- 赖氨酸脱羧酶培养基, 刚好在液体培养基的液面下 30 ±1 培养 24 h±2 h, 观察结果 L- 赖氨酸脱羧酶试验阳性者, 培养基呈紫色, 阴性者为黄色 A.6 L- 鸟氨酸脱羧酶培养基 A.6.1 成分 L- 鸟氨酸盐酸盐 (L-ornithine monohydrochloride) 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 溴甲酚紫 g ph 6.8±0.2 A.6.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节 ph 每管分装 5 ml 121 高压 15 min 7

10 A.6.3 实验方法挑取培养物接种于 L- 鸟氨酸脱羧酶培养基, 刚好在液体培养基的液面下 30 ±1 培养 24 h±2 h, 观察结果 L- 鸟氨酸脱羧酶试验阳性者, 培养基呈紫色, 阴性者为黄色 A.7 L- 精氨酸双水解酶培养基 A.7.1 成分 L- 精氨酸盐酸盐 (L-arginine monohydrochloride) 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 溴甲酚紫 g ph 6.8±0.2 A.7.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节 ph 每管分装 5 ml 121 高压 15 min A.7.3 实验方法挑取培养物接种于 L- 精氨酸脱羧酶培养基, 刚好在液体培养基的液面下 30 ±1 培养 24 h±2 h, 观察结果 L- 精氨酸脱羧酶试验阳性者, 培养基呈紫色, 阴性者为黄色 A.8 糖类发酵培养基 A.8.1 基础培养基 A 成分酪蛋白 ( 酶消化 ) 10.0 g 氯化钠 5.0 g 酚红 0.02 g ph 6.8±0.2 A 制法将各成分加热溶解, 必要时调节 ph 每管分装 5 ml 121 高压 15 min A.8.2 糖类溶液 (D- 山梨醇 L- 鼠李糖 D- 蔗糖 D- 蜜二糖苦杏仁甙 ) A 成分糖 8.0 g 100 ml A 制法分别称取 D- 山梨醇 L- 鼠李糖 D- 蔗糖 D- 蜜二糖苦杏仁甙等糖类成分各 8 g, 溶于 100 ml 中, 过滤除菌, 制成 80 mg/ml 的糖类溶液 A.8.3 完全培养基 A 成分基础培养基 875 ml 糖类溶液 125 ml A 制法无菌操作, 将每种糖类溶液加入基础培养基, 混匀 ; 分装到无菌试管中, 每管 10 ml A.8.4 实验方法挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基, 刚好在液体培养基的液面下 30 ±1 培养 24 h±2 h, 观察结果糖类发酵试验阳性者, 培养基呈黄色, 阴性者为红色 8

11 A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基 A.9.1 成分柠檬酸钠 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 磷酸二氢铵 1.0 g 硫酸镁 0.2 g 溴百里香酚蓝 0.08 g 琼脂 8.0 g~18.0 g ph 6.8±0.2 A.9.2 制法将各成分加热溶解, 必要时调节 ph 每管分装 10 ml,121 高压 15 min, 制成斜面 A.9.3 实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面,36 ±1 培养 24 h±2 h, 观察结果阳性者培养基变为蓝色 9

12 附录 B ( 规范性附录 ) 阪崎肠杆菌最可能数 (MPN) 检索表 B.1 阪崎肠杆菌最可能数 (MPN) 检索表每 100 g(ml) 检样中阪崎肠杆菌最可能数 (MPN) 的检索见表 B.1 表 B.1 阪崎肠杆菌最可能数 (MPN) 检索表阳性管数 95% 可信限阳性管数 95% 可信限 MPN MPN 下限上限下限上限 < > 注 1: 本表采用 3 个检样量 [100 g(ml) 10 g(ml) 和 1 g(ml)], 每个检样量接种 3 管注 2: 表内所列检样量如改用 g(ml) 10 g(ml) 和 1 g(ml) 时, 表内数字应相应降低 10 倍 ; 如改用 10 g(ml) 1 g(ml) 和 0.1 g(ml) 时, 则表内数字应相应增高 10 倍, 其余类推 10

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(