GB 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了培养基和试剂 ; 将第二法大肠杆菌 VRBMUG 平板计数法改为大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法

Size: px

Start display at page:

Download "GB 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了培养基和试剂 ; 将第二法大肠杆菌 VRBMUG 平板计数法改为大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法"

值曰翁
7 years ago
Views:

1 中华人民共和国国家标准 GB 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 57 发布 77 实施中华人民共和国卫生部发布

2 GB 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了培养基和试剂 ; 将第二法大肠杆菌 VRBMUG 平板计数法改为大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法 ) ; 删除了第三法大肠杆菌 Petrifilm TM 测试片计数法 ; 修改了附录 A I

3 GB 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数范围品本标准规定了食品中大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) 计数的方法本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数, 其中大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法 ) 不适用于贝类产术语和定义. 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中, 能够在 44.5 发酵乳糖产酸产气,IMViC( 靛基质甲基红 VP 试验柠檬酸盐 ) 生化试验为或的革兰氏阴性杆菌以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况, 推断食品中肠道致病菌污染的可能性. 最可能数基于泊松分布的一种间接计数方法, 简称为 MPN 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : a) 恒温培养箱 :6 ± ; b) 冰箱 : ~5 ; c) 恒温水浴箱 :44.5 ±. ; d) 天平 : 感量为. g; c) 均质器 ; d) 振荡器 ; e) 无菌吸管 : ml( 具. ml 刻度 ) ml( 具. ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 ; f) 无菌锥形瓶 : 容量 5 ml; g) 无菌培养皿 : 直径 9 mm; h) ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 ; i) 菌落计数器 ; j) 紫外灯 : 波长 6 nm~66 nm, 功率 6 W 4 培养基和试剂 4. 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST) 肉汤 : 见附录 A 中 A. 4. EC 肉汤 (E.coli broth): 见附录 A 中 A. 4. 蛋白胨水 : 见附录 A 中 A.

4 GB 缓冲葡萄糖蛋白胨水 [ 甲基红 (MR) 和 VP 试验用 ]: 见附录 A 中 A 西蒙氏柠檬酸盐培养基 : 见附录 A 中 A 磷酸盐缓冲液 : 见附录 A 中 A 伊红美蓝 (EMB) 琼脂 : 见附录 A 中 A 营养琼脂斜面 : 见附录 A 中 A 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA): 见附录 A 中 A.9 4. 结晶紫中性红胆盐 4 甲基伞形酮 βd 葡萄糖苷琼脂 (VRBAMUG): 见附录 A 中 A. 4. 革兰氏染色液 : 见附录 A 中 A. 4. Kovacs 靛基质试剂 : 见附录 A 中 A. 4. 无菌 mol/l NaOH: 见附录 A 中 A. 4.4 无菌 mol/l HCl: 见附录 A 中 A.4

5 GB 大肠埃希氏菌 MPN 计数 ( 第一法 ) 5. 检验程序大肠埃希氏菌 MPN 计数的检验程序见图检样 5g(mL) 样品 5ml 稀释液, 均质倍系列稀释选择适宜个连续稀释度的样品匀液, 接种 LST 肉汤管 6 ± 48h±h 不产气产气 EC 肉汤 44.5 ±. 48 h± h 不产气产气 EMB 平板划线 6 ± 8h~4h 可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板 6 ± 8h~4h IMViC 生化试验, 革兰氏染色阴性管阳性管查 MPN 表报告图大肠埃希氏菌 MPN 计数法检验程序

6 GB 操作步骤 5.. 样品的稀释 5... 固体和半固体样品 : 称取 5 g 样品, 放入盛有 5 ml 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内,8 r/min~ r/min 均质 min~ min, 制成 : 样品匀液, 或放入盛有 5 ml 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 min~ min 制成 : 的样品匀液 5... 液体样品 : 以无菌吸管吸取 5 ml 样品置盛有 5 ml 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中, 充分混匀, 制成 : 的样品匀液 5... 样品匀液的 ph 值应在 6.5~7.5 之间, 必要时分别用 mol/l NaOH 或 mol/l HCl 调节用 ml 无菌吸管或微量移液器吸取 : 样品匀液 ml, 沿管壁缓缓注入 9 ml 磷酸盐缓冲液的无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 ), 振摇试管或换用支 ml 无菌吸管或吸头反复吹打, 使其混合均匀, 制成 : 的样品匀液根据对样品污染状况的估计, 按上述操作, 依次制成倍递增系列稀释样品匀液每递增稀释次, 换用支 ml 无菌吸管或吸头从制备样品匀液至样品接种完毕, 全过程不得超过 5 min 5.. 初发酵试验每个样品, 选择个适宜的连续稀释度的样品匀液 ( 液体样品可以选择原液 ), 每个稀释度接种管月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST) 肉汤, 每管接种 ml( 如接种量超过 ml, 则用双料 LST 肉汤 ),6 ± 培养 4 h± h, 观察小倒管内是否有气泡产生,4 h± h 产气者进行复发酵试验, 如未产气则继续培养 48 h± h 产气者进行复发酵试验如所有 LST 肉汤管均未产气, 即可报告大肠埃希氏菌 MPN 结果 5.. 复发酵试验用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物环, 移种于已提前预温至 45 的 EC 肉汤管中, 放入带盖的 44.5 ±. 水浴箱内水浴的水面应高于肉汤培养基液面, 培养 4 h± h, 检查小倒管内是否有气泡产生, 如未有产气则继续培养至 48 h± h 记录在 4 h 和 48 h 内产气的 EC 肉汤管数如所有 EC 肉汤管均未产气, 即可报告大肠埃希氏菌 MPN 结果 ; 如有产气者, 则进行 EMB 平板分离培养 5..4 伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管, 用接种环取培养物分别划线接种于 EMB 平板,6 ± 培养 8 h~4 h 观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落 5..5 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑 5 个典型菌落, 如无典型菌落则挑取可疑菌落用接种针接触菌落中心部位, 移种到营养琼脂斜面或平板上,6 ±, 培养 8 h~4 h 取培养物进行革兰氏染色和生化试验 5..6 鉴定取培养物进行靛基质试验 MRVP 试验和柠檬酸盐利用试验大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表 4

7 GB 表大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别靛基质 (I) 甲基红 (MR) VP 试验 (VP) 柠檬酸盐 (C) 鉴定 ( 型别 ) 典型大肠埃希氏菌非典型大肠埃希氏菌典型中间型非典型中间型典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌注 : 如出现表以外的生化反应类型, 表明培养物可能不纯, 应重新划线分离, 必要时做重复试验注 : 生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法, 按照产品说明书进行操作 5. 大肠埃希氏菌 MPN 计数的报告大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌, 发酵乳糖产酸产气,IMViC 生化试验为或只要有个菌落鉴定为大肠埃希氏菌, 其所代表的 LST 肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性依据 LST 肉汤阳性管数查 MPN 表 ( 见附录 B), 报告每 g(ml) 样品中大肠埃希氏菌 MPN 值 6 大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法 ) 6. 检验程序大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图检样 5g(ml) 样品 5ml 稀释液, 均质倍系列稀释选择个 ~ 个适宜连续稀释度的样品匀液, 接种 VRBAMUG 平板 6 ± 8 h~4 h 紫外灯照射, 计数发荧光菌落 6. 操作步骤报告结果图大肠埃希氏菌平板计数法检验程序 6.. 样品的稀释按 5.. 进行 6.. 平板计数 5

8 GB 选取个 ~ 个适宜的连续稀释度的样品匀液, 每个稀释度接种个无菌平皿, 每皿 ml 同时取 ml 稀释液加入无菌平皿做空白对照 6... 将 ml~5 ml 冷至 45 ±.5 的结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) 倾注于每个平皿中小心旋转平皿, 将培养基与样品匀液充分混匀待琼脂凝固后, 再加 ml~4 ml VRBAMUG 覆盖平板表层凝固后翻转平板,6 ± 培养 8 h~4 h 6. 平板菌落数的选择选择菌落数在 CFU~ CFU 之间的平板, 暗室中 6 nm~66 nm 波长紫外灯照射下, 计数平板上发浅蓝色荧光的菌落检验时用已知 MUG 阳性菌株 ( 如大肠埃希氏菌 ATCC 59) 和产气肠杆菌 ( 如 ATCC 48) 做阳性和阴性对照 6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数, 报告每 g(ml) 样品中大肠埃希氏菌数, 以 CFU/g (ml) 表示若所有稀释度 ( 包括液体样品原液 ) 平板均无菌落生长, 则以小于乘以最低稀释倍数报告 6

9 GB 附录 A 培养基和试剂 A. 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST) 肉汤 A.. 成分胰蛋白胨或胰酪胨氯化钠乳糖磷酸氢二钾 (K HPO 4 ) 磷酸二氢钾 (KH PO 4 ) 月桂基硫酸钠 ph6.8±.. g 5. g 5. g.75 g.75 g. g.ml A.. 制法将上述成分溶解于中, 调节 ph 分装到有玻璃小倒管的试管中, 每管 ml 高压灭菌 5 min 制备双料 LST 肉汤时, 除外其他成分加倍 A. EC 肉汤 (E.coli broth) A.. 成分胰蛋白胨或胰酪胨. g 号胆盐或混合胆盐.5g 乳糖磷酸氢二钾 (K HPO 4 ) 磷酸二氢钾 (KH PO 4 ) 氯化钠 ph6.9±. 5. g 4. g.5 g 5. g. ml A.. 制法将上述成分溶解于中, 调节 ph, 分装到有玻璃小倒管的试管中, 每管 8 ml 高压灭菌 5 min A. 蛋白胨水 A.. 成分胰胨或胰酪胨 ph6.9±.. g. ml A.. 制法加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于中分装试管, 每管 5 ml 高压灭菌 5 min A.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水 [ 甲基红 (MR) 和 VP 试验用 ] A.4. 成分多胨 7. g 7

10 葡萄糖磷酸氢二钾 (K HPO 4 ) ph7. 5. g 5. g. ml GB A.4. 制法将上述成分溶解于中, 调节 ph, 分装试管, 每管 ml, 高压灭菌 5 min, 备用 A.4. 甲基红 (MR) 试验 A.4.. 甲基红试剂 A.4... 成分甲基红 mg 95% 乙醇. ml A.4... 制法 mg 甲基红溶于 ml95% 乙醇中, 然后加入 ml. ml A.4... 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水,6 ± 培养 d~5 d 滴加甲基红试剂一滴, 立即观察结果鲜红色为阳性, 黄色为阴性 A.4.4 VP 试验 A %α 萘酚乙醇溶液成分及制法 : 取 α 萘酚 6. g, 加无水乙醇溶解, 定容至 ml A % 氢氧化钾溶液成分及制法 : 取氢氧化钾 4 g, 加溶解, 定容至 ml A.4.4. 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水,6 ± 培养 d~4 d 加入 6% α 萘酚乙醇溶液.5 ml 和 4 % 氢氧化钾溶液. ml, 充分振摇试管, 观察结果阳性反应立刻或于数分钟内出现红色, 如为阴性, 应放在 6 ± 继续培养 4 h 再进行观察 A.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基 A.5. 成分柠檬酸钠氯化钠磷酸氢二钾磷酸二氢铵硫酸镁溴百里香酚蓝琼脂 ph 6.8±.. g 5. g. g. g. g.8 g 8. g~8.g. ml A.5. 制法将各成分加热溶解, 必要时调节 ph 每管分装 ml, 高压 5 min, 制成斜面 A.5. 实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面,6 ± 培养 4 h± h, 观察结果阳性者培养基变为蓝色 A.6 磷酸盐缓冲液 A.6. 成分 8

11 磷酸二氢钾 (KH PO 4 ) 4.g ph7. 5. ml GB A.6. 制法贮存液 : 称取 4. g 的磷酸二氢钾溶于 5 ml 中, 用大约 75 ml 的 mol/l 氢氧化钠调节 ph, 用稀释至 ml 后贮存于冰箱稀释液 : 取贮存液.5 ml, 用稀释至 ml, 分装于适宜容器中, 高压灭菌 5 min A.7 伊红美蓝 (EMB) 琼脂 A.7. 成分蛋白胨乳糖磷酸氢二钾 (K HPO 4 ) 琼脂伊红 γ( 水溶液 ) 美蓝 ph7.±.. g. g. g 5. g.4 g 或 % 水溶液. ml.65 g 或.5% 水溶液. ml. ml A.7. 制法在 ml 中煮沸溶解蛋白胨磷酸盐和琼脂, 加水补足分装于三角烧瓶中每瓶 ml 或 ml, 调节 ph, 高压灭菌 5 min 使用前将琼脂融化, 于每 ml 琼脂中加 5 ml 灭菌的 % 乳糖溶液, ml 的 % 的伊红 γ 水溶液和. ml.5% 的美蓝水溶液, 摇匀, 冷至 45 ~5 倾注平皿 A.8 营养琼脂斜面 A.8. 成分牛肉膏蛋白胨琼脂 ph7.±.. g 5. g 5. g. ml A.8. 制法将上述成分加于中, 煮沸溶解, 调节 ph 分装合适的试管, 高压灭菌 5 min 灭菌后摆成斜面备用 A.9 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) A.9. 成分蛋白胨酵母膏乳糖氯化钠胆盐或号胆盐中性红结晶紫琼脂 7. g. g. g 5. g.5 g. g. g 5 g~8 g. ml 9

12 ph7.4±. GB A.9. 制法将上述成分溶于中, 静置几分钟, 充分搅拌, 调节 ph 煮沸 min, 将培养基冷至 45 ~5 倾注平板使用前临时制备, 不得超过 h A. 结晶紫中性红胆盐 4 甲基伞形酮 βd 葡萄糖苷琼脂 (VRBAMUG) A.. 成分蛋白胨酵母膏乳糖氯化钠胆盐或号胆盐中性红结晶紫琼脂 7. g. g. g 5. g.5 g. g. g 5 g~8 g. ml 4 甲基伞形酮 βd 葡萄糖苷 (MUG). g ph7.4±. A.. 制法将上述成分溶于中, 静置几分钟, 充分搅拌, 调节 ph 煮沸 min, 将培养基冷至 45 ~5 使用 A. 革兰氏染色液 A.. 结晶紫染色液 A... 成分结晶紫. g 95% 乙醇. ml % 草酸铵水溶液 8. ml A... 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中, 然后与草酸铵溶液混合 A.. 革兰氏碘液 A... 成分碘碘化钾. g. g. ml A... 制法将碘与碘化钾先行混合, 加入少许充分振摇, 待完全溶解后, 再加至 ml A.. 沙黄复染液 A... 成分沙黄.5 g 95% 乙醇. ml A... 制法将沙黄溶解于乙醇中, 然后用稀释 A..4 染色法 9. ml

13 GB A..4. 涂片在火焰上固定, 滴加结晶紫染液, 染 min, 水洗 A..4. 滴加革兰氏碘液, 作用 min, 水洗 A..4. 滴加 95% 乙醇脱色约 5 s~ s, 直至染色液被洗掉, 不要过分脱色, 水洗 A..4.4 滴加复染液, 复染 min, 水洗待干镜检 A. Kovacs 靛基质试剂 A.. 成分对二甲氨基苯甲醛戊醇盐酸 ( 浓 ) A.. 制法将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中, 然后慢慢加入浓盐酸即可 5. g 75. ml 5. ml A.. 试验方法将培养物接种蛋白胨水,6 ± 培养 4 h± h 后, 加 Kovacs 靛基质试剂. ml~. ml, 上层出现红色为靛基质阳性反应 A. 无菌 mol/l NaOH: A.. 成分 NaOH A.. 制法 : 称取 4 g 氢氧化钠溶于 ml 中, 高压灭菌 5 min A.4 无菌 mol/l HCl: A.4. 成分 HCl 4. g. ml 9. ml. ml A.4. 制法移取浓盐酸 9 ml, 用稀释至 ml, 高压灭菌 5 min

14 GB 附录 B 大肠埃希氏菌最可能数 (MPN) 检索表每 g(ml) 检样中大肠埃希氏菌最可能数 (MPN) 的检索见表 B. 表 B. 大肠埃希氏菌最可能数 (MPN) 检索表阳性管数 95% 置信区间阳性管数 95% 置信区间 MPN MPN... 下限上限... 下限上限 < > 注 : 本表采用个稀释度 [.g (ml).g (ml) 和.g (ml)], 每个稀释接种管注 : 表内所列检样量如改用 g (ml).g (ml) 和.g(mL) 时, 表内数字应相应降低倍 ; 如改用.g(mL).g (ml).g (ml) 时, 则表内数字应相应增高倍, 其余类推

<4D F736F F D203538CAB3C6B7CEA2C9FACEEFD1A7BCECD1E92020BEFAC2E4D7DCCAFDB2E2B6A8B8C42E646F63>

<4D F736F F D203538CAB3C6B7CEA2C9FACEEFD1A7BCECD1E92020BEFAC2E4D7DCCAFDB2E2B6A8B8C42E646F63> 中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 National food safety standard Food microbiological examination:aerobic plate count 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施中华人民共和国卫生部发布前言本标准代替 GB/T 4789.2-2008 食品卫生微生物学检验菌落总数测定

GB 前 言 本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数 本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了培养基和试剂 ; 将 第二法大肠杆菌 VRBMUG 平板计数法 改为 大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法

GB 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数本标准与 GB/T 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了培养基和试剂 ; 将第二法大肠杆菌 VRBMUG 平板计数法改为大肠埃希氏菌平板计数法 ( 第二法