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摄城史
5 years ago
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1 中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 National food safety standard Food microbiological examination:aerobic plate count 发布实施中华人民共和国卫生部发布

2 前言本标准代替 GB/T 食品卫生微生物学检验菌落总数测定本标准与 GB/T 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了菌落总数计算公式中的解释 ; 修改了培养基和试剂 ; 删除了第二法菌落总数 Petrifilm TM 测试片法本标准的附录 A 是规范性附录本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB GB GB/T GB/T I

3 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 1 范围本标准规定了食品中菌落总数 (Aerobic plate count) 的测定方法本标准适用于食品中菌落总数的测定 2 术语和定义 2.1 菌落总数 aerobic plate count 食品检样经过处理, 在一定条件下 ( 如培养基培养温度和培养时间等 ) 培养后, 所得每 g(ml) 检样中形成的微生物菌落总数 3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 3.1 恒温培养箱 :36 ±1,30 ±1 3.2 冰箱 :2 ~5 3.3 恒温水浴箱 :46 ±1 3.4 天平 : 感量为 0.1 g 3.5 均质器 3.6 振荡器 3.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 3.8 无菌锥形瓶 : 容量 250 ml 500 ml 3.9 无菌培养皿 : 直径 90 mm 3.10 ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 3.11 放大镜或 / 和菌落计数器 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 : 见附录 A 中 A 磷酸盐缓冲液 : 见附录 A 中 A.2 1

4 4.3 无菌生理盐水 : 见附录 A 中 A.3 5 检验程序菌落总数的检验程序见图 1 检样 25 g(ml) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液, 各取 1 ml 分别加入无菌培养皿内每皿中加入 15 ml~20 ml 平板计数琼脂培养基, 混匀 36 ±1 48 h±2 h 培养计数各平板菌落数计算菌落总数报告图 1 菌落总数的检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释固体和半固体样品 : 称取 25 g 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min, 或放入盛有 225 ml 稀释液的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min, 制成 1:10 的样品匀液液体样品 : 以无菌吸管吸取 25 ml 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中, 充分混匀, 制成 1:10 的样品匀液 2

5 6.1.3 用 1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 ml, 沿管壁缓慢注于盛有 9 ml 稀释液的无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 ), 振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀, 制成 1:100 的样品匀液按操作程序, 制备 10 倍系列稀释样品匀液每递增稀释一次, 换用 1 次 1 ml 无菌吸管或吸头根据对样品污染状况的估计, 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液 ( 液体样品可包括原液 ), 在进行 10 倍递增稀释时, 吸取 1 ml 样品匀液于无菌平皿内, 每个稀释度做两个平皿同时, 分别吸取 1 ml 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照及时将 15 ml~20 ml 冷却至 46 的平板计数琼脂培养基 ( 可放置于 46 ±1 恒温水浴箱中保温 ) 倾注平皿, 并转动平皿使其混合均匀 6.2 培养待琼脂凝固后, 将平板翻转,36 ±1 培养 48 h±2 h 水产品 30 ±1 培养 72 h±3 h 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时, 可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基 ( 约 4 ml), 凝固后翻转平板, 按条件进行培养 6.3 菌落计数可用肉眼观察, 必要时用放大镜或菌落计数器, 记录稀释倍数和相应的菌落数量菌落计数以菌落形成单位 (colony-forming units,cfu) 表示选取菌落数在 30 CFU~300 CFU 之间无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数, 大于 300 CFU 的可记录为多不可计每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数其中一个平板有较大片状菌落生长时, 则不宜采用, 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数 ; 若片状菌落不到平板的一半, 而其余一半中菌落分布又很均匀, 即可计算半个平板后乘以 2, 代表一个平板菌落数当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时, 则将每条单链作为一个菌落计数 7 结果与报告 7.1 菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内, 计算两个平板菌落数的平均值, 再将平均值乘以相应稀释倍数, 作为每 g(ml) 样品中菌落总数结果若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时, 按公式 (1) 计算 : C (1) N = n 0.1n ) d 式中 : N 样品中菌落数 ; ( C 平板 ( 含适宜范围菌落数的平板 ) 菌落数之和 ; n 1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 平板个数 ; n 2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 平板个数 ; d 稀释因子 ( 第一稀释度 ) 3

6 示例 : 稀释度 1:100( 第一稀释度 ) 1:1000( 第二稀释度 ) 菌落数 (CFU) 232,244 33,35 C N = ( n n 2 ) d = [2 + (0.1 2)] = = 2 上述数据按数字修约后, 表示为或若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU, 则对稀释度最高的平板进行计数, 其他平板可记录为多不可计, 结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU, 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算若所有稀释度 ( 包括液体样品原液 ) 平板均无菌落生长, 则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间, 其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时, 则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算 7.2 菌落总数的报告菌落数小于 100 CFU 时, 按四舍五入原则修约, 以整数报告菌落数大于或等于 100 CFU 时, 第 3 位数字采用四舍五入原则修约后, 取前 2 位数字, 后面用 0 代替位数 ; 也可用 10 的指数形式来表示, 按四舍五入原则修约后, 采用两位有效数字若所有平板上为蔓延菌落而无法计数, 则报告菌落蔓延若空白对照上有菌落生长, 则此次检测结果无效称重取样以 CFU/g 为单位报告, 体积取样以 CFU/mL 为单位报告 4

7 附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 平板计数琼脂 (plate count agar,pca) 培养基 A.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 ml ph 7.0±0.2 A.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph 分装试管或锥形瓶,121 高压灭菌 15 min A.2 磷酸盐缓冲液 A.2.1 成分磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 34.0 g 蒸馏水 500 ml ph 7.2 A.2.2 制法贮存液 : 称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 ml 蒸馏水中, 用大约 175 ml 的 1 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph, 用蒸馏水稀释至 ml 后贮存于冰箱稀释液 : 取贮存液 1.25 ml, 用蒸馏水稀释至 ml, 分装于适宜容器中,121 高压灭菌 15 min A.3 无菌生理盐水 A.3.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 ml A.3.2 制法称取 8.5g 氯化钠溶于 ml 蒸馏水中,121 高压灭菌 15 min 5

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(