肿瘤基因突变检测

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巧家
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1 肿瘤基因突变检测癌症是一类难以预防的疾病, 中晚期癌症治愈的可能性又很小, 而早期癌症的治愈率可达 65% 以上, 有些肿瘤可达 90% 以上, 因此, 战胜癌症的关键是早期发现癌症由于癌症早期常无特殊症状, 甚至毫无症状, 故癌症的早期发现早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及 B 超 CT MRI PET-CT 等检查, 但这些方法的敏感性和特异性均不高, 发现有异常时往往已是中晚期研究表明, 癌症是环境因素与细胞遗传物质相互作用的结果, 是多因素多阶段与多基因作用的结果, 是基因突变累积的结果, 因此癌症是基因病在人类众多的基因中, 原癌基因和抑癌基因与癌症的发生发展密切相关原癌基因和或抑癌基因的突变可引起细胞癌变癌症在形成实性肿块以前, 与癌症相关的基因突变的过程已经发生, 而且这个过程可能已长达十余年甚至更长时间在这期间, 癌细胞还没有形成明显的肿块, 但已有微量肿瘤 DNA 释放到循环血液中通过高通量基因测序技术检测循环血液中这些基因的突变, 可以筛查早期或超早期癌症, 评估放化疗的疗效, 预测靶向药物的疗效, 监测术后早期复发等 ; 对肿瘤组织进行基因突变检测, 有助于了解肿瘤的产生发展过程, 判断肿瘤的类型和预后 ; 有助于预测原癌基因相关抗肿瘤药物的疗效基因突变常表现为杂合突变缺失或插入突变等, 突变检测对测序的质量要求很高通过应用基因分析仪进行突变分析, 可准确判断出杂合缺失插入突变等各种突变类型, 结果准确客观 17 种常见高发肿瘤, 包括乳腺癌 (breast cancer) 结肠癌(colorectalcancer) 子宫癌 (endometrial cancer) 脑胶质瘤(glioma) 白血病(leukemia) 肺癌(lungcancer) 淋巴癌 (lymphoma) 成神经管细胞瘤(medulloblastoma) 黑色素癌(melanoma) 间皮瘤 (mesothelioma) 多性骨髓瘤(multiple myeloma) 卵巢癌(ovarian cancer) 胰腺癌(pancreatic cancer) 真性红细胞增多(polycythemia vera) 前列腺癌(prostatecancer) 肾细胞癌(renal cell cancer) 和恶性内瘤 (sarcoma), 其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变, 参与了肿瘤发生的早期分子事件系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异, 对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义利用高通量分子测序技术平台, 可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目, 如 EGFR K-RAS N-RAS B-RAF PI3K p53 p16 BRCA1

2 BRCA2 等基因的突变检测应用 :⑴ 了解肿瘤的发病机制 ;⑵ 预测原癌基因相关药物疗效 ;⑶ 了解肿瘤的恶性化程度, 预测肿瘤发展 ;⑷ 细胞株稳定性筛选

3 K-RAS 基因 (K-ras,p21) 突变检测 KRAS 基因 (K-ras,p21) 检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接最有效的方法, 通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况, 更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的大肠癌患者, 帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法 RAS 基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种 HRAS KRAS 和 NRAS, 分别定位在和 1 号染色体上在 RAS 基因中,KRAS 对人类癌症影响最大, 正常时, 它能控制调控细胞生长的路径 ; 发生异常时, 则导致细胞持续生长, 并阻止细胞自我毁灭, 不能产生正常 RAS 蛋白, 使细胞内信号传导紊乱, 细胞增殖失控而癌变原癌基因 (K-ras) 突变发生于多种癌症, 例如结肠癌肺癌甲状腺癌胰腺癌胆管癌 K-RAS 基因是所有肿瘤中突变频率最高的致癌基因, 约有 10%-20% 的肿瘤与 K-RAS 的异常激活有关, 参与 EGFR 信号传导通路结直肠癌患者中 K-RAS 基因的突变率约为 35-40%, 而且 90% 的突变发生在位密码子, 可导致 p21-ras 蛋白的生长信号的异常变化该基因是 TKI 治疗的靶分子, 携带有 K-RAS 基因突变的患者对 TKI 治疗不敏感过度的生长信号可刺激细胞生长和增殖从而导致了癌症的发生目前 KRAS 基因检测已被欧美地区列为大肠癌患者内科治疗前必做的常规检查大量临床研究表明, 靶向药物 ( 如爱必妥和帕尼单抗 ) 对于未发生 KRAS 基因突变的患者有效率可达到 60%, 而对已发生 KRAS 基因突变的患者则完全无效 KRAS 基因检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接最有效的方法通过检测 KRAS 基因有没有突变, 可以筛选出抗 EGFR( 表皮生长因子受体 ) 靶向药物治疗有效的大肠癌患者, 实现肿瘤病人的个体化治疗, 从而延长患者生存期对于没有突变的患者, 则能减少不必要的治疗费用和毒副作用最新的靶向治疗方法是通过利用肿瘤细胞受体分子进行的药物开发, 这种药物能够作用于肿瘤特异靶标, 达到特异杀伤抑制肿瘤细胞的目的目前这种靶向治疗的药物主要有爱必妥 ( 默克公司 ) 和帕尼单抗 ( 安进公司 ), 然而靶向药物在不同患者中有不同的疗效, 有效率约为 20-50% 通过对结肠癌患者进行靶标检测, 能够科学的判断该病人能否适应靶向药物治疗, 指导病人用药, 实现病人的个体化医疗 K-ras 基因检测 (K-ras,p21) 临床意义 : 检测 K-ras 基因突变是深入了解癌基因的情况, 了解各种癌症的发展预后, 放化疗疗效的重要指标 ⑴ K-ras 基因突变发生在肿瘤恶变的早

4 期, 并且原发灶和转移灶的 K-ras 基因高度保持一致, 一般认为,K-ras 基因状态不会因治疗而发生变化 ⑵ K-ras 基因突变见于 20% 的非小细胞肺癌 (NSCLC), 其中肺腺癌占 30%~ 50% 大肠癌患者 K-ras 突变率为 30%~35% 检测位点突变外显子碱基变化 Cosmic ID Gly12Asp 12 GGT>GAT 521 Gly12Val 12 GGT>GTT 520 Gly12Ser 12 GGT>AGT 517 Gly12Cys 12 GGT>TGT 516 Gly12Ala 12 GGT>GCT 522 Gly12Arg 12 GGT>CGT 518 Gly13Asp 13 GGC>GAC 532

5 BRAF V600E 基因突变检测 BRAF 是一种癌基因, 它编码一种丝 / 苏氨酸特异性激酶, 是 RAS/RAF/MEK/ ERK/MAPK 通路重要的转导因子, 参与调控细胞内多种生物学事件, 如细胞生长分化和凋亡等研究表明, 在多种人类恶性肿瘤中, 如恶性黑色素瘤结直肠癌肺癌甲状腺癌肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的 BRAF 基因突变, 约 66% 恶性黑色素瘤和 15% 的结肠癌中 BRAF 基因存在体细胞错义突变大约 80-90% 的 BRAF 基因突变发生在 exon15 的 1799 核苷酸上,T 突变为 A, 导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代 (V600E) 目前认为,V600E 突变可模拟 T599 和 S602 两个位点的磷酸化过程, 从而使 BRAF 蛋白异常激活 BRAF 突变状态与多种肿瘤的发生发展及临床结局有关随着 BRAF 突变研究的深入, 可望为阐明肿瘤发生的分子机制, 寻找新的治疗途径与靶点提供思路 BRAF 基因突变作为乳头状甲状腺癌 (PTC) 发生的驱动性突变, 已经成为 PTC 细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标 BRAF 基因突变率在 PTC 中高达 44%, 具有很好的诊断意义 BRAF 基因突变阳性的甲状腺癌病人较突变阴性病人预后不良在黑色素瘤的治疗方面, 针对 BRAF 基因突变所研发的新型靶向药物威罗菲尼 (Vemurafenib) 对 BRAF 基因 V600E 突变的患者疗效显著在结直肠癌中,BRAF 基因突变的患者对 EGFR 靶向药物可能存在原发耐药, 因此, 美国国家癌症综合治疗联盟 (NCCN) 结直肠癌临床实践指南 (2013) 建议, 在使用爱必妥 (Cetuximab) 或帕尼单抗 (Panitumumab) 等靶向药物时, 对 KRAS 基因野生型患者进一步检测 BRAF 基因状态威罗菲尼 (Zelboraf, vemuragenib, PLX 4032) 获准用于治疗不可手术且经 FDA 批准的 BRAF V600E 突变检测呈阳性的转移性黑色素瘤患者在批准该药的同时,FDA 还同时批准了用于黑色素瘤患者相应突变检测的 BRAF V600E 突变检测临床研究发现,EGFR 信号通路中的 BRAF 基因 V600E 突变的病人对 EGFR 单抗原发耐药因此, 推荐肿瘤患者接受 EGFR 靶向药物治疗前, 进行 BRAF 基因 V600E 突变的检测而且,2011 年版 NCCN 结直肠癌临床实践指南中明确指出结直肠癌患者应进行 BRAF 基因 V600E 突变的检测, 如果患者存在 V600E 突变时, 一线治疗进展后使用抗 EGFR 单抗治疗是无效的 BRAF 基因突变检测能提高临床治疗的针对性, 指导靶向药物的合理使用, 避免无效或治疗不当造成的病人病情延误, 降低治疗风险有研究证明, 在野生型 KRAS 肿瘤当中, 发生 BRAF V600E 突变的个体, 对 Panitumumab/ 帕尼单抗和 Cetuximab/ 西妥昔单抗完全不反应, 而没发生 BRAF 突变的野生型个体,32% 有反应, 68% 没反应这提示今后重点检测 BRAF 的突变可为今后结肠癌临床用药给予指导,BRAF 基因突

B-RAF 基因突变情况可用于指导 EGFR-TKI 的靶向用药检测位点 :V600E B-raf

6 变的患者接受 EGFR-TKI 药物治疗的有效率低而且,BRAF V600E 突变可导致部分 KRAS 基因野生型患者对 EGFR-TKI 及 EGFR 单抗药物治疗不敏感因此检测肿瘤患者 B-RAF 基因突变情况可用于指导 EGFR-TKI 的靶向用药检测位点 :V600E B-raf 基因突变检测实例 A. BRAF 第 600 密码子野生型测序图谱 B. BRAF 第 600 密码子突变型测序图谱

7 EGFR 基因突变检测肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤, 并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因其中以非小细胞肺癌 (NSCLC) 最常见目前靶向治疗已经成为 NSCLC 临床治疗的重要手段易瑞沙 (Iressa/ 吉非替尼 /Gefitinib, 阿斯利康 ) 和特罗凯 (Tarceva/ 厄罗替尼 /Erlotinib, 罗氏制药 ) 作为表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI), 是美国 FDA 批准用于 NSCLC 靶向治疗的主要药物易瑞莎和特罗凯是近年来开发的两种特异性较高的治疗 NSCLC 的肿瘤靶向治疗药物, 该类药物通过抑制肿瘤发生发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性, 从而达到抑制肿瘤细胞的增生侵袭转移血管生成并促进肿瘤细胞的调亡但是, 临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对 10-30% 的 NSCLC 病人有显著疗效进一步的研究发现 EGFR 基因突变与 NSCLC 靶向治疗的疗效具有相关性, 绝大多数携带 EGFR 基因突变的病人疗效显著大量研究资料表明 EGFR 基因突变主要集中在酪氨酸激酶区 (tyrosine kinase coding domain, 18-2l 外显子 ) 外显子上, 其中 19 外显子多为框内缺失 ( ) 性突变, 约占所有突变的 45%;21 外显子多为替代突变 ( 主要是 L858R), 约占所有突变的 40% 目前普遍认为, 这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对 TKI 的敏感性, 并且可作为 TKI 治疗的有效预测指标因此, 检测 EGFR 基因突变对于指导 NSCLC 病人临床用药具有重要的参考价值临床实践显示易瑞莎和特罗凯这两种药物疗效存在很大的个体差异, 仅有 10%-20% 的个体会有很好效果研究发现,EGFR 基因酪氨酸激酶区域存在多种突变, 这些突变能够很好预测易瑞莎和特罗凯的治疗效果, 为肿瘤用药提供指导依据 EGFR 基因 29 种突变 : EGFR 第 18 外显子片段长度为 437bp, 核苷酸 2155G>A 突变 (G719S); EGFR 第 19 外显子片断长度为 411bp, 主要突变有 : 核苷酸 Del(E746-A750del) 核苷酸 Del(E746-A750del) 核苷酸 Del(S752-I759del) 其它核苷酸片段缺失插入重复现象, 如 L747-T75linsA,L747-P753insS(747 位亮氨酸至第 753 位苯丙氨酸缺失, 插入丝氨酸 ) 和 L747-A750del EGFR 第 21 外显子, 片段长度为 399bp, 主要突变有 : 核苷酸 2576T-G(L858R)

8 核苷酸 2497T-G(L833V) 核苷酸 2504A-T(H835L) 核苷酸 2556 位插入碱基 G(q852) 采用临床突变检测公认的金标准 Sanger 测序法进行检测 : 1 个体化指导 : 选出对患者效果最佳的药物, 为医生提供个体化用药的科学依据 ; 2 指导 EGFR-TKI 类药物的合理使用, 帮助医生为患者选择最优的治疗方案 ; 3 避免不合适药物无效治疗造成的病情延误, 降低治疗风险, 节省医疗资源检测位点突变外显子碱基变化 Cosmic ID G719A G>C 6239 G719S G>A 6252 G719C G>T 6253 E746-A750del(1) del E746-A750del(2) del L747-P753>S del E746-A750>I >AAT(complex) E746-A750del del E746-A750>A del E746-S752>A del E746-S752>V >T(complex) E746-S752>D del L747-A750>P >GC(complex) L747-T751>Q >GCA(complex) L747-E749del del L747-T751del del L747-S752del del L747-A750>P TTAAGAGAAG >C L747-P753>Q >CA(complex) L747-T751>S del L747-T751del del L747-T751>P >C(complex) T790M C> T 6240 S768I G>T 6241 V769-D770insASV ins GCCAGCGTG H773-V774insH ins CAC D770-N771insG ins GGT L858R T>G 6224 L861Q T>A 6213

對有嚴重 ( 第 3 級 ) 皮膚反應的病患使用時, 可能必須調整 Vectibix 的劑量 ( 請參閱第 4.4 節 ) 特殊族群尚未針對腎功能或肝功能不全的病患進行 Vectibix 的安全性與療效

對有嚴重 ( 第 3 級 ) 皮膚反應的病患使用時, 可能必須調整 Vectibix 的劑量 ( 請參閱第 4.4 節 ) 特殊族群尚未針對腎功能或肝功能不全的病患進行 Vectibix 的安全性與療效維必施注射劑 Vectibix solution for infusion 衛署菌疫輸字第 00094 號本藥限由醫師使用. 藥品名稱維必施 (Vectibix) 注射劑濃縮液 (20 毫克 / 毫升 ) 2. 定性與定量成分每毫升濃縮液含有 20 毫克 panitumumab 每一瓶 5 毫升濃