1386 临床与病理杂志, 2015, 35(7) Keywords KRAS gene is high in colorectal cancer, but NRAS or BRAF gene mutation is low in colorectal can

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1 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(7) doi: /j.issn View this article at: 结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变的分子病理检测分析 吴永芳, 许春伟, 宋业颖, 班怡, 张博, 邵云, 李晓兵 ( 军事医学科学院附属医院病理科, 北京 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因各亚型突变状况 方法 : 应用 Taqman-ARMS 方法检测 101 例结直肠癌患者石蜡组织中 KRAS NRAS BRAF 基因突变情况 结果 : 结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS 基因总突变率为 42.57%, 其中 30 例 (29.70%) 检测到外显子 2 第 12 密码子突变 ; 其中 13 例 (12.87%) 检测到 KRAS 基因外显子 2 第 13 密码子突变, 为 G13D 点突变, 未检测到 G13C 点突变 ;NRAS 基因总突变率为 3.96%, 其中外显子 2 第 12 密码子突变 1 例 (0.99%), 外显子 2 第 13 密码子突变 1 例 (0.99%), 外显子 3 第 61 密码子突变 2 例 (1.98%);BRAF 基因总突变率为 3.96% 结论: 结直肠癌患者组织中 KRAS 基因突变率较高,NRAS 和 BRAF 基因突变率虽低但不容忽视 KRAS NRAS 和 BRAF 基因检测人群的筛选对结直肠癌患者治疗方案的选择意义重大, 能够更有效的指导精准医学个体化治疗 [ 关键词 ] Taqman-ARMS 方法 ; 结直肠癌 ;KRAS 基因 ;NRAS 基因 ;BRAF 基因 ; 突变率 The molecular pathology examination analysis of KRAS, NRAS and BRAF gene mutation in colorectal cancer WU Yongfang, XU Chunwei, SONG Yeying, BAN Yi, ZHANG Bo, SHAO Yun, LI Xiaobing (Department of Pathology, Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Beijing , China) Abstract Objective: To investigate the mutations of gene subtypes of KRAS, NRAS and BRAF gene in colorectal cancer. Methods: Taqman-ARMS was used to test the tissues in 101 cases of colorectal cancer with paraffin tissue KRAS, NRAS and BRAF gene mutation. Results: The total mutation rate of KRAS gene was 42.57% (43/101) in colorectal cancer. KRAS gene mutation rate of codon 12 in exons 2 was 29.70%; KRAS gene mutation rate of codon 13 in exons 2 was 12.87% (13/101). NRAS gene mutation rate of codon 12 in exons 2 was 3.96%; the total mutation rate of NRAS gene was 3.96% in colorectal cancer. NRAS gene mutation rate of codon 12 in exons 2 was 0.99%; NRAS gene mutation rate of codon 13 in exons 2 was 0.99%; and NRAS gene mutation rate of codon 61 in exons 3 was 1.98%. The total mutation rate in BRAF gene was 3.96%. Conclusion: The mutation rate of 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 许春伟, xuchunweibbb@163.com; 张博, zenwo@qq.com

2 1386 临床与病理杂志, 2015, 35(7) Keywords KRAS gene is high in colorectal cancer, but NRAS or BRAF gene mutation is low in colorectal cancer. The people of KRAS, NRAS and BRAF gene detects for the choice of treatment in patients with colorectal cancer is of great significance, can effectively guide precision medical individualized treatment. Taqman-ARMS method; colorectal cancer; KRAS gene; NRAS gene; BRAF gene; mutation rate 在全球范围内, 结直肠癌的发病率逐渐攀 升, 其发病率居世界第 3 位 [1] 结直肠癌的治疗 一直是国内外学者研究的热点 随着靶向治疗 药物表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,egfr) 抑制剂西妥昔单抗 (cetuximab) 和 帕尼单抗 (panitumumab) 的问世, 结直肠癌的治 疗进入精准医学指导下的靶向个体化治疗时代 [2] 新近研究显示,cetuximab 治疗的有效性受其下 游基因 RAS 状态的影响 RAS 基因 ( 包括 KRAS 和 NRAS) 是 EGFR 信号转导通路中一个重要的下游调 控基因, 突变型的 RAS 基因无需 EGFR 接受信号, 能够自动活化该通路并启动下游信号的转导, 因 此只有野生型 RAS 基因的患者才对抗 EGFR 单克隆 抗体的治疗有效, 而突变型的患者无效 此外, EGFR 信号转导通路中其他的下游基因如 BRAF 基因也可以影响抗 EGFR 单抗的疗效 因此, KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变的检测与分析对结 直肠患者治疗方案的选择, 特别是在应用西妥昔 单抗等靶向治疗药物的选择上具有重要意义, 从 而能够进行最有效的个体化治疗 [3] 本研究分析 结直肠癌中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变情况, 旨在总结结直肠癌患者中这 3 种基因突变率和临床 病理特征, 为精准医学下的靶向治疗提供分子病 理学依据 1 材料与方法 1.1 材料 一般材料 收集军事医学科学院附属医院 2014 年 3 月至 2015 年 2 月间经手术切除 穿刺活检及会诊结直 肠癌标本 101 例,101 例标本均行 KRAS NRAS 和 BRAF 基因套餐检测 本研究经医院医学伦理委员 会批准, 且所有患者均获得知情同意 主要试剂和仪器 FFDE 样本 DNA 分离试剂盒, 人 KRAS 基因突 变定性检测试剂盒 人 NRAS 基因突变定性检测 试剂盒和人 BRAF 基因突变定性检测试剂盒均购 自福建厦门艾德生物医药科技有限公司, 核酸蛋 白质浓度测量仪 B-500 购自上海创萌生物科技有 限公司,Mx3000P 实时荧光定量 PCR 仪购自美国 Stratagene 公司 1.2 方法 DNA 提取 采用福建厦门艾德生物医药科技有限公司的 FFPE 样本 DNA 分离试剂盒提取组织, 比照 HE 在显 微镜下标记肿瘤区域, 切片过程中仅选取相关肿 瘤区域, 将含有肿瘤区域的 DNA 组织的蜡块 10 μm 厚连续切片 5 张, 严格按照试剂盒说明步骤进行操 作 DNA 提取后应用紫外分光光度计测量 DNA 质 量及浓度 按照测量的 DNA 浓度稀释至 2~5 mg/l 备用 实时荧光定量 PCR 检测结直肠癌组织中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因改变以 DNA 为模板, 按照人 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变定性检测试剂盒, 在 Mx3000P 实时荧光定 量 PCR 仪中进行扩增 质控方面已做预实验, 并按 试剂盒说明书要求设立阳性和阴性对照 2 结果 2.1 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变分析 101 例患者共 43 例 (42.57%) 检测到 KRAS 基因 突变, 其中 30 例 (29.70%) 检测到 12 密码子突变, 包含 G12D 点突变 9 例 (8.91%), G12V 点突变 7 例 (6.93%),G12C 点突变 5 例 (4.95%),G12S 点突变 4 例 (3.96%), G12A 点突变 4 例 (3.96%) 和 G12R 点突变 1 例 (0.99%); 其中 13 例 (12.87%) 检测到 KRAS 基因 13 密码子突变, 为 G13D 点突变, 未检测到 G13C 点突变 ;NRAS 基因点突变 4 例 (3.96%), 其 中 12 密码子突变 1 例 (0.99%), 为 G12D 点突变,13 密码子突变 1 例 (0.99%), 为 G13D 点突变,61 密码 子突变 2 例 (1.98%), 包含 Q61H 和 Q61R 点突变 1 例 (0.99%);BRAF 基因 V600E 点突变 4 例 (3.96%), 未 见 V600D 和 V600R 点突变 ( 表 1)

3 结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变的分子病理检测分析吴永芳, 等 1387 表 例结直肠癌患者 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变 分析 Table 1 KRAS, NRAS and BRAF gene mutation analysis in 101 cases of colorectal cancer 基因突变例数 /% KRAS 基因 43 (42.57) 密码子 (29.70) G12D 9 (8.91) G12V 7 (6.93) G12C 5 (4.95) G12S 4 (3.96) G12A 4 (3.96) G12R 1 (0.99) 密码子 (12.87) G13D 13 (12.87) NRAS 基因 4 (3.96) 密码子 12 2 (1.98) G12D 1 (0.38) G13D 1(0.38) 密码子 61 2 (1.98) Q61H 1 (0.38) Q61R 1 (0.38) BRAF 基因 4 (3.96) V600E 4 (3.96) 3 讨论 近年来, 靶向药物联合传统化疗方案治疗结 直肠癌取得了较好的疗效, 并在结直肠癌患者, 尤其是晚期结直肠癌患者的治疗中占重要的地 位 [3] 几项大型临床研究促使 RAS 基因突变检测 成为结直肠癌患者接受抗 EGFR 治疗前的必要环 节, 接受 RAS 基因检测的患者树立也因此以很快 的速度在全球范围内增长 [4] RAS 基因家族成员 HRAS KRAS 和 NRAS 与肿瘤的发生发展密切关 系 [5] KRAS 基因是 EGFR 信号通路下游的重要癌 基因, 位于染色体 12p12.1, 在细胞生长以及血 管生成等相关的信号转导通路中起着重要调控作 用 [6-7] 大量临床实验证实 cetuximab 或 panitumumab 联合化疗一线治疗野生型 KRAS 基因结直肠癌的 有效率为 41%~61%, 而 KRAS 基因突变患者的有 效率为零, 因此 KRAS 基因突变被认为是抗 EGFR 单抗疗效不佳的独立预后因素 [8-9] [10] Xu 等发现 单纯检测 KRAS 基因, 根据 KRAS 基因状态来选择 治疗, 发现结直肠癌人群的总生存延长, 但把人 群基数缩小, 观察总 RAS, 总生存整个延长会更 明显 在 KRAS 基因野生型患者中, 实际上一部 分患者是别的 RAS 基因突变, 包括 NRAS 基因和 HRAS 基因突变 目前 KRAS 基因突变率在欧美国 家报道为 30%~40% [11-12] 最常见的突变发生在第 2 号外显子的第 12 和 13 密码子 (85%~95%), 其他 位点包括第 3 号外显子 和 146 密码子 (5%~15%) [13] 关于 KRAS 基因各个突变亚型研究 [14] 中, 国外 Nagasaka 等研究发现结直肠癌肿瘤组 织中 KRAS 基因总突变率为 30.77%, 其中 G12D 占 12.82%,G12V 占 6.41%,G12A 占 1.71%,G12S 占 2.14%,G12C 占 0.86%,G13D 占 5.13%,G12D 与 G12A 双突变共存型占 0.43%, G12D 与 G13D 双突 变共存型占 0.43%, G12S 与 G13R 双突变共存型 占 0.43%, G12S G12A 与 G13S 三突变共存型占 0.43% 国内北京大学肿瘤医院数据表明结直肠 癌肿瘤组织中 KRAS 基因总突变率为 38.82%, 其中 G12D 占 16.77%,G12V 占 6.94%,G12A 占 1.97%, G12S 占 2.38%, G12C 占 2.28%, G12R 占 0.20%, G13D 占 8.07% 和 G13C 占 0.20% [4] ; 中国医学科学院 肿瘤医院数据表明结直肠癌肿瘤组织中 KRAS 基因 总突变率为 35.69%, 其中 G12D 占 19.94%, G12V 占 7.72%,G12A 占 2.57%,G12S 占 0.64%,G13D 占 7.71% G13C 占 0.64% [3] ; 复旦大学附属肿瘤医院 数据表明结直肠癌肿瘤组织中 KRAS 基因总突变率 为 40.39%, 其中 G12D 占 15.26%,G12V 占 8.08%, G12A 占 2.51%, G12S 占 2.51%, G12C 占 3.41%, G12F 占 0.17%, G13D 占 7.90% G13C 占 0.17% G13R 占 0.17% P34L 占 0.17% [15] 国外 De Roock 等 [16] 研究发现 NRAS 基因在结直肠癌肿瘤组织中总 突变率为 1.87%, 但未报道各亚型比例 国内暂无 结直肠癌肿瘤组织中 NRAS 基因的突变情况 本 研究 101 例患者共 43 例 (42.57%) 检测到 KRAS 基因 突变, 其中 30 例 (29.70%) 检测到 12 密码子突变, 包含 G12D 点突变 9 例 (8.91%), G12V 点突变 7 例 (6.93%),G12C 点突变 5 例 (4.95%),G12S 点突变 4 例 (3.96%), G12A 点突变 4 例 (3.96%) 和 G12R 点突变 1 例 (0.99%); 其中 13 例 (12.87%) 检测到 KRAS 基因 13 密码子突变, 为 G13D 点突变, 未检测到 G13C 点突变 ;NRAS 基因点突变 4 例 (3.96%), 其 中 12 密码子突变 1 例 (0.99%), 为 G12D 点突变,13 密码子突变 1 例 (0.99%), 为 G13D 点突变,61 密码 子突变 2 例 (1.98%), 包含 Q61H 和 Q61R 点突变 1 例 (0.99%); 本研究结果与国内外研究报道基本吻 合, 但 RAS 基因检测未检出罕见点突变位点 双突 [10] 变共存型和三突变共存型 Xu 等研究发现一线 cetuximab 联合化疗治疗的患者 KRAS 基因 G12D 点

4 1388 临床与病理杂志, 2015, 35(7) 突变患者总生存明显长于其他类型的点突变, 但 [17] 明显短于 KRAS 基因野生型患者 Tejpar 等研究 发现携带 KRAS 基因 G13D 突变的结直肠癌患者能从 一线 cetuximab 联合化疗治疗中获益, 获益程度与野生型患者相仿 目前国外临床试验仅报道 NRAS 基因突变型患者一线 cetuximab 联合化疗患者总生 存明显短于 NRAS 野生型患者 [16], 暂无 NRAS 基因 突变型各亚型之间预后生存的对比的报道 BRAF 基因与 ARAF RAF1 同属于 RAF 基因 家族, 作为 RAF-MEK-ERK 信号转导通路中的重 要成员, 介导 RAS 与 MAPK 相结合, 调节肿瘤细 胞增殖 分化和凋亡 BRAF 蛋白与 KRAS 蛋白同 为 RAF-MEK-ERK 信号通路中上游调节因子, 在 MAPK/ERK 信号通路中起着举足轻重的作用 多 数研究这认为 BRAF 基因突变的结直肠癌患者对 西妥昔单抗或帕尼单抗治疗抵抗,BRAF 基因突 变是 cetuximab 或 panitumumab 疗效的独立预测因 素 [18-21] [14] 国外 Nagasaka 等研究发现结直肠癌肿瘤 组织中 BRAF 基因突变率为 8.97%, 均为 V600E 点突 变 ; 国内北京大学肿瘤医院数据表明结直肠癌肿 瘤组织中 BRAF 基因总突变率为 4.14%, 其中 V600E 占 3.93%,V600G 占 0.01%,D594N 占 0.01% [4] ; 中 国医学科学院肿瘤医院数据表明结直肠癌肿瘤 组织中 BRAF 基因总突变率为 5.77%, 其中 V600E 占 3.85%,G466V 占 1.28% 和 H608Y 占 0.64% [3] ; 复 旦大学附属肿瘤医院数据表明结直肠癌肿瘤组 织中 BRAF 基因总突变率为 1.80%, 其中 V600E 占 1.44%, V600M 占 0.18% 和 G606S 占 0.18% [15] 本 研究中 BRAF 基因 V600E 点突变 4 例 (3.96%), 未见 V600D 和 V600R 点突变 本研究结果与国内外研 [19] 究报道基本吻合 Di Nicolantonio 等对结直肠癌 BRAF 基因突变与耐药间的相关性进行了回顾性研 究, 发现 KRAS 基因野生型患者中一线 cetuximab 或 panitumumab 联合化疗对携有 BRAF 基因突变型患者 之间预后生存明显短于 BRAF 基因野生型患者 总之, 结直肠癌患者组织中 KRAS 基因存在较 高的突变率,NRAS 和 BRAF 基因突变率虽低但不容 忽视 KRAS NRAS 和 BRAF 基因检测人群的筛选 对结直肠癌患者治疗方案的选择意义重大, 能够 更有效的指导精准医学个体化治疗 参考文献 1. Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer Statistics, 2014[ J]. CA Cancer J Clin, 2014, 64(1): Soulières D, Greer W, Magliocco AM, et al. KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-egfr therapies[ J]. Curr Oncol, 2010, 17 Suppl 1: S31-S 凌云, 应建明, 邱田, 等. 结直肠癌患者 KRAS BRAF 及 PIK3CA 基因突变检测分析 [ J]. 中华病理学杂志, 2012, 41(9): LING Yun, YING Jianming, QIU Tian, et al. Detection of KRAS, BRAF, PIK3CA and EGFR gene mutations in colorectal carcinoma[ J]. Chinese Journal of Pathology, 2012, 41(9): 高静, 孙志伟, 李艳艳, 等. 中国结直肠癌患者 966 例中 KRAS 和 BRAF 基因突变分析 [ J]. 中华病理学杂志, 2012, 41(9): GAO Jing, SUN Zhiwei, LI Yanyan, et al. Mutations of KRAS and BRAF in Chinese patients with colorectal carcinoma: analyses of 966 cases[ J]. Chinese Journal of Pathology, 2012, 41(9): Lowy DR, Willumsen BM. Function and regulation of ras[ J]. Annu Rev Biochem, 1993, 62: Der CJ, Cooper GM. Altered gene products are associated with activation of cellular RASK genes in human lung and colon carcinomas[ J]. Cell, 1983, 32(1): Gideon P, John J, Frech M, et al. Mutational and kinetic analyses of the GTPase-activating protein (GAP)-p21 interaction: the C-terminal domain of GAP is not sufficient for full activity[ J]. Mol Cell Biol, 1992, 12(5): Lièvre A, Bachet JB, Boige V, et al. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab[ J]. J Clin Oncol, 2008, 26(3): De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, et al. KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab[ J]. Ann Oncol, 2008, 19(3): Xu JM, Liu XJ, Ge FJ, et al. KRAS mutations in tumor tissue and plasma by different assays predict survival of patients with metastatic colorectal cancer[ J]. J Exp Clin Cancer Res, 2014, 33(1): Rajagopalan H, Bardelli A, Lengauer C, et al. Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status[j]. Nature, 2002, 418(6901): Samowitz WS, Curtin K, Schaffer D, et al. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumor location, stage, and survival: a population-based study[ J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2000, 9(11): Lea IA, Jackson MA, Li X, et al. Genetic pathways and mutation profiles of human cancers: site- and exposure-specific patterns[ J]. Carcinogenesis, 2007, 28(9): Nagasaka T, Sasamoto H, Notohara K, et al. Colorectal cancer with mutation in BRAF, KRAS, and wild-type with respect to both oncogenes showing different patterns of DNA methylation[ J]. J Clin Oncol, 2004, 22(22): 朱晓丽, 蔡旭, 张玲, 等. 中国结直肠癌患者中 KRAS 与 BRAF 基

5 结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变的分子病理检测分析吴永芳, 等 1389 因突变特征及其临床病理相关性 [ J]. 中华病理学杂志, 2012, 41(9): ZHU Xiaoli, CAI Xu, ZHANG Ling, et al. KRAS and BRAF gene mutations in correlation with clinicopathologic features of colorectal carcinoma in Chinese[ J]. Chinese Journal of Pathology, 2012, 41(9): De Roock W, Claes B, Bernasconi D, et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis[ J]. Lancet Oncol, 2010, 11(8): Budinska E, Popovici VC, Sikora KO, et al. Identification and validation of gene expression subtypes in a large set of colorectal cancer samples[ J]. J Clin Oncol, 2012, 30: abstr Richman SD, Seymour MT, Chambers P, et al. KRAS and BRAF mutations in advanced colorectal cancer are associated with poor prognosis but do not preclude benefit from oxaliplatin or irinotecan: results from the MRC FOCUS trial[ J]. J Clin Oncol, 2009, 27(35): Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, et al. Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer[ J]. J Clin Oncol, 2008, 26(35): Tol J, Koopman M, Cats A, et al. Chemotherapy, bevacizumab, and cetuximab in metastatic colorectal cancer[ J]. N Engl J Med, 2009, 360(6): Tol J, Dijkstra JR, Klomp M, et al. Markers for EGFR pathway activation as predictor of outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with or without cetuximab[ J]. Eur J Cancer, 2010, 46(11): 本文引用 : 吴永芳, 许春伟, 宋业颖, 班怡, 张博, 邵云, 李晓兵. 结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS NRAS 和 BRAF 基因突变的分子病理检测分析 [ J]. 临床与病理杂志, 2015, 35(7): doi: / j.issn Cite this article as: WU Yongfang, XU Chunwei, SONG Yeying, BAN Yi, ZHANG Bo, SHAO Yun, LI Xiaobing. The molecular pathology examination analysis of KRAS, NRAS and BRAF gene mutation in colorectal cancer[ J]. Journal of Clinical and Pathological Research, 2015, 35(7): doi: /j.issn

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