GENFINE BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 :FRI1402 FinePure FFPE DNA/RNA Kit FinePure 固定组织 DNA/RNA 共提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 目录号 :FR603 产品内容 : Contents Buffer FDA Buffer MDA Buffer GHL Buffer DW Buffer DW2 Buffer TB Proteinase K FR603 (50 preps) 40 ml 30 ml 12 ml 2 x 1.2 ml FinePure Mini Spin Columns 2 x 50 个 2 ml Collection Tubes 2 x 50 个 1.5 ml RNase Free Microcentrifuge Tubes 2 x 50 个 RNase A(10 mg/ml) 300 μl DNase I (2,000 U) DNase I Buffer Buffer RB Buffer FRW Buffer RW2 RNase Free ddh 2O 1 瓶 4 ml 40 ml 12 ml 储存条件 : 本试剂盒中的 DNase I 组分采用冰袋运输, 收到后立即将 DNase I 置于 2-8 保存, 其他 试剂室温 (15-25 ) 保存 本产品仅供科研使用 请勿用于医药 临床治疗 食品及化妆品等用途 1
产品简介 : 本试剂盒可以从福尔马林固定 石蜡包埋组织样本中同时提取基因组 DNA 和总 RNA 根据 DNA 和 RNA 在裂解液中的溶解度不同, 在特殊的裂解液条件依次释放组织切片中的 DNA 和 RNA, 克服了福尔马林交联造成的抑制效应 该试剂盒通过特异性结合 DNA 和 RNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统, 将高品质的 DNA 和 RNA 纯化至小洗脱体积中 由于固定和包埋的条件不同,FFPE 样本中提取得到的 DNA 和 RNA 多为片段化的核酸, 完整性要低于新鲜或冷冻样本 提取的 DNA 和 RNA 纯度高, 质量稳定可靠, 使用本试剂盒提取的 FFPE DNA 和 RNA 可适用于多种下游应用, 如 PCR 和 Real-time PCR;SNP 基因分析 STR 基因分析 ; 药物基因组学研究 产品特点 : 样本广泛 : 可从福尔马林固定 石蜡包埋组织 福尔马林等固定液中的组织中分离纯化基因组 DNA 和 RNA 轻松提取 : 轻松提取纯化高品质, 高得率的即用型 DNA 和 RNA, 结果重复性好 稳定可靠 : 彻底去除污染物和 PCR 抑制剂 注意事项 : 1 拿到样品后要尽快在 4-10% 的福尔马林中固定, 固定时间以 8-24 h 内为宜, 时间过长导致基因组断裂, 影响下游实验 2 确保包埋前的样品彻底脱水, 残留的福尔马林会抑制 PCR 检测酶的作用 3 本产品适用于医学 科学实验研究 4 本产品所提 DNA 的完整性依赖于样本类型 储存时间以及固定条件 如果甲醛固定时间过长或样本存放时间过久 (>1 年 ) 则易导致 DNA 完整性受损, 无法扩出长片段 5 若缓冲液 FDA MDA GHL RB 中有沉淀, 可在 60 水浴中重新溶解, 摇匀后使用 6 试剂盒中各试剂在使用前应按照说明书要求操作, 所有离心步骤均在室温下进行 DNase I 母液的配制 : 先用 1 ml 注射器吸取 550 μl RNase Free ddh 2 O, 然后打进装有 DNase I 干粉 (2,000 U) 的玻璃瓶中, 轻柔混匀, 分装后 -20 贮存 ( 可保存 9 个月 ) ( 如果需要另外购买 DNase I, 2
目录号 :RA102-01) 注意 : 从 -20 融化后的 DNase I 母液保存于 4 ( 可保存 6 周 ), 不要再次冻存 操作步骤 : 使用前请先在 Buffer DW2 和 Buffer RW2 中加入无水乙醇, 加入体积请参照瓶上的标签 1. 样本处理 : a. 石蜡切片 : 取石蜡切片 (5-10 μm 厚,1 1 cm 2 大小 )5-8 张 b. 石蜡块 : 手术刀刮取约 30 mg 的组织样本 ( 尽量去除多余的石蜡 ) 注意 : 如果样品表面暴露于空气中, 最初刮取的 2-3 片弃掉不用 c. 福尔马林等固定液中的样本 : 取 30 mg 样本, 用手术刀切为数块, 置于 1.5 ml 离心管中, 加入 500 μl PBS(10 mm,ph7.4) 涡旋振荡混匀,12,000 rpm 离心 1 min, 重复 2 次, 然后从步骤 7 开始操作 2. 将石蜡切片或石蜡块样本装于 1.5 ml 无菌离心管中, 加入 1 ml 二甲苯, 剧烈涡旋 10 sec, 静置 1 min 3. 12,000 rpm 离心 2 min, 弃上清 ( 注意 : 不要倒掉沉淀 ) 4. 加入 1 ml 无水乙醇到上述管中, 涡旋混匀 10 sec 5. 12,000 rpm 离心 2 min, 弃上清 ( 注意 : 不要倒掉沉淀 ) 6. 室温放置 5-10 min, 充分挥发乙醇 7. 加入 150 μl Buffer FDA 和 10 μl Proteinase K 到上述沉淀块中, 涡旋振荡混匀 8. 置于 56 孵育 15 min 9. 冰上放置 3 min 10. 13,000 rpm 离心 15 min 11. 轻轻转移上清到新的离心管中进行 RNA 的提取 ( 步骤 12-25), 保留沉淀块进行 DNA 的提取 ( 步骤 26-34 ) RNA 的提取纯化 : 12. 将步骤 11 中的上清溶液置于 80 孵育 15 min 13. 加入 220 μl 的 Buffer RB, 涡旋混匀 14. 加入 660 μl 的无水乙醇, 涡旋混匀 ( 可能会出现沉淀 ) 15. 转移 700 μl 溶液和沉淀至吸附柱 FinePure Mini Spin Columns 中 ( 吸附柱放在收集管 3
中 ),12,000 rpm 离心 1 min, 弃掉收集管中的废液, 将吸附柱放回收集管中 16. 重复步骤 15 直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱, 弃废液, 将吸附柱放回收集管中 17. 加入 350 μl Buffer FRW 到吸附柱中,12,000 rpm 离心 30 sec, 弃废液, 将吸附柱放回收集管中 18. DNase I 工作液的配制 : 取 10 μl DNase I 母液放入新的 RNase Free 离心管中, 加入 70 μl DNase I Buffer, 轻柔混匀 19. 加入 80 μl 的 DNase I 工作液向吸附柱中央, 室温放置 15 min 20. 加入 350 μl Buffer FRW 到吸附柱中,12,000 rpm 离心 30 sec 21. 将收集管中的滤液重新加入吸附柱中,12,000 rpm 离心 30 sec 22. 加入 500 μl Buffer RW2( 使用前请先检查是否已加入乙醇 ) 到吸附柱中,12,000 rpm 离心 30 sec, 弃废液, 将吸附柱放回收集管中 23. 重复步骤 22 24. 12,000 rpm 离心 3 min, 倒掉废液 将吸附柱置于室温放置数分钟, 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液 25. 将吸附柱转入一个新的 1.5 ml RNase Free Microcentrifuge Tubes 中, 向吸附膜的中间部位悬空滴加 30-100 μl RNase Free ddh 2 O,12,000 rpm 离心 1 min, 得到 RNA 溶液 注意 : 洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl, 体积过小影响回收效率 RNA 溶液请于 -70 保存 DNA 的提取纯化 : 26. 在步骤 11 中得到的组织沉淀块中加入 200 μl Buffer FDA 和 20 μl Proteinase K, 充分混匀,56 孵育 1 h 直至样本完全裂解 可选步骤 : 如果需要制备无 RNA 污染的 DNA, 加入 4 μl RNase A(10 mg/ml, FA101-02) 混匀后, 室温放置 2 min 27. 置于 90 静止孵育 1 h, 期间不要搅动, 然后冷却至室温 28. 加入 700 μl Buffer GHL, 涡旋震荡充分混匀, 短暂离心使管壁上的溶液收集到管底 29. 将上一步所得的混合液加入一个吸附柱 FinePure Mini Spin Columns 中,8,000 rpm 离心 2 min, 倒掉废液, 重新将吸附柱放回收集管中 注意 : 吸附柱最大容量为 700 μl, 可将剩余液体重复上述步骤上柱 4
30. 加入 500 μl Buffer DW 到吸附柱中,8,000 rpm 离心 30 sec, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱放回收集管中 31. 加入 500 μl Buffer DW2( 使用前请先检查是否已加入乙醇 ) 到吸附柱中,8,000 rpm 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱放回收集管中 32. 重复操作步骤 31 33. 将吸附柱放回收集管中,12,000 rpm 离心 3 min, 倒掉废液 34. 将吸附柱转入一个干净的离心管中, 向吸附膜的中间部位悬空滴加 65 预热的 30-100 μl Buffer TB 洗脱,12,000 rpm 离心 1 min, 将收集有 DNA 的离心管 -20 保存 注意 : 洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl, 体积过小影响回收效率 为增加基因组 DNA 的得率, 可将离心得到的溶液再加入吸附柱中, 室温放置 2 min,12,000 rpm 离心 2 min 洗脱液的 ph 对于洗脱效率有很大影响, 若用 ddh 2 O 做洗脱液应保证其 ph 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ; 且 DNA 产物应保存在 -20, 以防 DNA 降解 5