自备试剂 : β 巯基乙醇选用试剂 : 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:1) ph (amresco 货号 : , ) 试剂盒组分货号 : 组分量 Glass Bead Tubes, 0.1mm 50 Solution PM1

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恬曰郝
5 years ago
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PowerMicrobiome RNA Isolation Kit 粪便 RNA 提取试剂盒货号提取次数 26000-50 50 次简介 PowerMicrobiome RNA Isolation Kit 设计用于简便快速提取粪便肠内容物干粪口腔棉拭子分泌物等富含 PCR 抑制因子样本总 RNA 专利 IRT 技术 (Inhibitor Removal Technology )

1 PowerMicrobiome RNA Isolation Kit 粪便 RNA 提取试剂盒货号提取次数次简介 PowerMicrobiome RNA Isolation Kit 设计用于简便快速提取粪便肠内容物干粪口腔棉拭子分泌物等富含 PCR 抑制因子样本总 RNA 专利 IRT 技术 (Inhibitor Removal Technology ) 能完全去除这些样本中含有的 PCR 抑制物, 如未完全消化的植物成分裂解红细胞的亚铁血红素等试剂盒含 DNase I 及相应试剂, 可去除可能污染的基因组 DNA 最终 RNA 洗脱浓缩在 RNade-Free Water 中, 可直接用于 cdna synthesis 或 RT-qPCR 等下游实验操作预览建议粪便或生物固体加样 0.25g 粪便采样后尽快-80 保存, 以保护 RNA 完整性化学裂解缓冲液与 0.1mm 玻璃研磨珠, 共同作用充分裂解微生物细胞绑定液 (PM3) 把 RNA 吸附到离心柱滤膜上,DNase 消化残余的基因组 DNA 后, 冲洗并洗脱到 RNase-free Water 中, 最终 RNA 可直接用于 RT-qPCR 等下游实验若实验要求 RNA 需要再一步 DNase 处理, 建议使用 DNase Max Kit( 货号 : ), 一种全新的室温稳定保存的 DNase 完全去除基因组 DNA 只需 20min 即可消化掉 30μg DNA, 无需加热或 EDTA 干涉, 采用特制的树脂能轻易去除 DNase 酶使用 DNase Max Kit 处理完以后,RNA 仍能保持原有的高质量相关产品货号数量 DNase Max Kit 次 Vortex Adapter, holds 24 ( ml) tubes V unit 样本储存与保护从粪便微生物中提取的 RNA 的得率和完整性很大程度上受个体消化系统功能特定饮食菜单以及收集样本到 -80 保存耗时长短影响粪便主要成分是水 (65-85%) 未完全消化食物胆汁胆红素( 由死亡红细胞衍生 ) 和死亡细菌 ( 可达 50%) 等因为存在大量的死亡或濒死细菌及人体细胞, 从粪便中提取的 RNA 用标准分析方法鉴定能看到一定成都的降解 QPCR 检测从粪便或肠内容物提取的 RNA 应注意设计检测小片段 RNA, 以提高检测的灵敏度为了提供粪便 RNA 的质量, 最好采集后尽快处理可分装后 -80 冷冻, 避免大块样本反复冻融从冰箱中取出的样本, 完全溶解前就可以加入含 βme 的 PM2 裂解缓冲液到 Bead Tube 中马上加样开始研磨以促使保护液能充分浸泡到细胞 RNA 新鲜采集未经冷冻的样品, 也应该立即加入裂解缓冲液进行研磨, 以获得最好质量的 RNA 设备要求 : 微型离心机 (13000g) Vortex-Genie 2 涡旋仪 (MO BIO 货号 #13111-V-220) 涡旋仪适配器 (MO BIO 货号 # V1-24)

2 自备试剂 : β 巯基乙醇选用试剂 : 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:1) ph (amresco 货号 : , ) 试剂盒组分货号 : 组分量 Glass Bead Tubes, 0.1mm 50 Solution PM1 36 ml Solution PM2 11 ml Solution PM3 36 ml Solution PM ml Solution PM ml Solution PM6 2.5 ml Solution PM7 23 ml Solution PM8 5.5ml DNase I (RNase-Free), 15000units 1 vial Spin Filters 50 2 ml Collection Tubes 200 实验前请先逐一检查试剂! 保存 DNase I 4 保存, 重悬分装后 -20 保存其它组分室温 (15-30 ) 保存实验开始前注意事项 PM1 使用前必须水浴至完全没有沉淀, 可趁热使用 PM5 使用前摇匀 β 巯基乙醇加入到 PM1, 制备 PM1/βME 溶液把 β 巯基乙醇 (βme) 加入到 PM1 溶液中, 使最终浓度达到 10μ/ml PM1/μME 溶液随着时间推移会失效, 最好现配现用, 保存时间不要超过一个月每次提取需要 650μl PM1/βME 溶液也可以直接把 650μl PM1 溶液和 6.5μl βme 加入到玻璃珠研磨管中注意 : 处理 βme 时请在通风橱中进行制备 DNase I A. 把 300μl RNase-FreeWater(PM8 溶液 ) 加入到 DNase I(RNase-Free) 冻干粉中, 轻摇混匀以 50μl 分装, -20 保存注意 :DNase I 不能反复冻融超过 3 遍 B. 在实验前制备 DNase I 溶液, 化冻足够量的 DNase I, 每次提取需要 5μl 一地步稀释保存的 DNase I 和 45μl

3 的 PM6 ANBIOSCI TECH LTD 如 : 样品数量稀释保存的 DNase I PM6 溶液 1 5μl 45μl 2 10μl 90μl 10 50μl 450μl

5 操作步骤 ANBIOSCI TECH LTD 1. 加入 0.25g 粪便或生物固体 (biosoild) 到 Glass Bead Tube,0.1mm 中注意 : 若希望用苯酚裂解法, 加样前加入 500μl 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 ph 到 Bead Tube 中 2. 加入 650μl PM1/βME( 见前文制备步骤 ) 到 Glass Bead Tube,0.1mm 中或直接加入 650μl PM1 和 6.5μl 到 Glass Bead Tube 中 3. 把 Glass Bead Tube,0.1mm 固定在 MOBIO 涡旋仪适配器上 ( 货号 V1-24) Tube 管螺帽调整, 朝适配器中心方向 4. 最大转速连续涡旋振荡 10min 这一步发生了什么 : 化学裂解液和珠磨研磨同时裂解破碎细胞裂解液还能保护释放到上清液中的 RNA 5. 室温 13000g 离心 1min 把上清转移到一个干净的 2ml 收集管中 ( 试剂盒提供 ) 约可获得 μl 上清若加入的是把苯酚 / 氯仿 / 异戊醇, 把上分离层转移到一个干净的 2ml 收集管中这一步发生了什么 : 蛋白细胞碎片与研磨珠一起沉淀下来, 上清中含有人和细菌 RNA 及 DNA 6. 加入 150μl PM2 溶液, 稍微涡旋混匀 4 孵育 5min 这一步发生了什么 :PM2 溶液为抑制因子去除溶液, 作为 IRT 技术一部分可完全去除样品很重含有的抑制下游 PCR 及其它应用的抑制因子 g 离心 1min 8. 避开底部沉淀, 转移不多于 650μl 上清到一个干净的 2ml 收集管中 ( 试剂盒提供 ) 9. 加入 650μl PM3 溶液和 650μl PM4 溶液, 稍微涡旋混匀注意 : 为了防止小片段 RNA(5S,tRNA 及降解的 RNA) 与正常的 mrna rrna 共同洗脱下来, 可用 650μl 70% 乙醇代替 PM4 溶液若为了同时洗脱如 mcirorna 和 sirna 等小片段 RNA, 可把裂解物转移到一个可至少能容纳 2.6ml 的 Tube 中, 加入 650μl 100% 乙醇这部分 100% 乙醇需要自备这一步发生了什么 :PM3 为绑定盐溶液, 可辅助提取总核酸,PM4 溶液为 100% 乙醇这些溶液为把 RNA DNA 绑定到 Spin Filter 上创造化学条件 10. 加载 650μl 上清到 Spin Filter 上,13000g 离心 1min, 弃去滤液重复步骤直至过滤完所有上清注意 : 一般共需要加载三次上清若为了提高 microrna 和 sirna 而额外添加了 100% 乙醇, 可能共需要加载四次 11. 使用前先摇匀 PM5 加入 650μl PM5 溶液,13000g 离心 1min 这一步发生了什么 :PM5 为含异丙醇的冲洗缓冲液, 可去除滤膜上残留的盐溶液, 为 DNase 处理创造条件 12. 弃去滤液,13000g 再离心 1min, 以进一步去除残留的洗液 13. 把 Spin Filter 放到一个干净的 2ml 收集管中 ( 试剂盒提供 )

6 注意 : 若你想同时提取 RNA 和 DNA, 请忽略步骤加入 50μl DNase 溶液 ( 每个提取需要混匀 45μl PM6 溶液和 5μl DNase I 稀释液, 详见上文 DNase 溶液的制备 ) 15. 室温孵育 15min 这一步发生了什么 :PM6 溶液为 DNase 消化缓冲液,DNase 浸润整个滤膜, 消化其中的基因组 DNA 16. 加入 400μl PM7 溶液,13000g 离心 1min 这一步发生了什么 :PM7 溶液可灭活 DNase, 并把降解的 DNA 冲洗下来 17. 弃去滤液, 加入 650μl PM5 溶液,13000g 离心 1min 18. 弃去滤液, 加入 650μl PM4 溶液,13000g 离心 1min 这一步发生了什么 :PM5 和 PM4 为含异戊醇和酒精的冲洗缓冲液, 洗脱 RNA 前分别出去离心柱上残留的盐分 19. 弃去滤液,13000g 离心 2min, 进一步去除残留的冲洗液这一步发生了什么 : 再一次离心确保滤膜上残留的乙醇全部去除, 确保洗脱顺利进行 20. 把 Spin Filter 放到一个干净的 2ml 收集管中 ( 试剂盒提供 ) 21. 把 100μl PM8 溶液 (RNase-Free Water) 加入到离心柱滤膜中间, 常温放置至少 1min 注意 : 使用 100μl PM8 可获得最大的 RNA 洗脱得率为了获得更浓缩的 RNA,PM8 用量也不能少于 50μl PM8 用量不能低于 50μl! g 离心 1min 这一步发生了什么 :RNA 从滤膜上洗脱下来, 进入到 PM8(RNase-Free Water) 中此时 RNA 可直接用于下游酶实验 23. 弃去 Spin Filter 此时 RNA 可直接用于下游实验装有 RNA 的 Tube 管可 -80 保存感谢选择使用 PowerMicrobiome RNA Isolation Kit! 疑点难点 RNA 降解粪便样本最好的保存办法是 -80 冷冻保存, 避免反复冻融粪便固形物成分主要是含大量降解 RNA 的死亡的细菌, 提取到完整 RNA 的同时抽提出大量小片段 RNA 是正常的

7 为了减少小片段降解 RNA, 可步骤 9 中降低乙醇的浓度用 650μl 70% 乙醇代替 PM4. 若用 RNALater 保存粪便样本, 请把加样量减少到 0.1g 以免堵塞离心柱 RNALater 的使用要求对最终提取得到的 RNA 做进一步基因组 DNA 消化处理 ( 推荐使用货号 ) 裂解步骤中使用苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1)pH 可有助于保护 RNA 完整性加样前加入 500μl 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇到 Glass Bead Tube,0.1mm 中对于大多数固态样本, 水相和有机相分离不明显, 而含水量高的样品可能可以看到清洗的分成总之, 取上层溶液进入下一步处理纯度偏低 RNA 理想纯度 260/280 值应为 ,260/230 值大于 1.5 若 RNA 纯度不够, 有可能跟处理的样本类型有关若 260/230 读数较低, 可增加 PM2 的用量至 200μl 以去除更多抑制因子如果增加 PM2 用量后,RNA 纯度仍不能让人满意, 请减少加样量基因组 DNA 污染根据样本中细菌数量情况, 经过离心柱 DNase 消化后仍有可能残留少量基因组 DNA 为了完全去除基因组 DNA, 可使用无需加热或 EDTA 干预 DNase Max Kit( 货号 : ), 以确保完全去除 DNA 更多实用技巧请参阅

试剂盒组分货号 : 组分量 PowerMax Soil PowerBead Tubes 10 PowerMax Soil PowerBead Solution 165ml PowerMax Soil Solution C1 14ml PowerMax Soil Solution

试剂盒组分货号 : 组分量 PowerMax Soil PowerBead Tubes 10 PowerMax Soil PowerBead Solution 165ml PowerMax Soil Solution C1 14ml PowerMax Soil Solution PowerMax Soil DNA Isolation kit 强力土壤 DNA 大量提取试剂盒货号提取次数 12988-10 10 次简介 PowerMax Soil DNA Isolation Kit 结合了我们专利的抑制因子去除技术 (IRT), 给研究者提供一种创新有效的方法提取环境样品基因组 DNA 过去由于含有大量腐植酸类抑制的复杂样品都可以用这款试剂盒轻松搞定从各种土壤类型中提取的总

自备试剂 : β 巯基乙醇 选用试剂 : 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:1) ph (amresco 货号 : , ) 试剂盒组分 货号 : 组分 量 Glass Bead Tubes, 0.1mm 50 Solution PM1

自备试剂 : β 巯基乙醇选用试剂 : 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:1) ph (amresco 货号 : , ) 试剂盒组分货号 : 组分量 Glass Bead Tubes, 0.1mm 50 Solution PM1