SOURCE: http:// 中国病理生理杂志, ( ): - 杂志网址 : : [ 文章编号 ] - ( ) - - 姜黄素通过下调 - 抑制肺癌 * - 细胞的迁移和侵袭 陈君, 焦德敏, 唐夏莉, 王剑, 李优, 陈清勇 ( 中国人民解放军第一一七医院呼吸内科, 浙江杭州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨姜黄素对肺癌 - 细胞迁移和侵袭的抑制作用及其与 - 表达的关系 方法 : 用 划痕修复和 小室实验检测姜黄素对肺癌 - 细胞活力 迁移和侵袭能力的影响 ; 用 技术检测姜黄素对 - 表达及 通路的影响 ; 经 干扰 - 后观察姜黄素对 - 细胞活力 迁移 侵袭及 通路的影响 结果 : 姜黄素能抑制 - 细胞活力, [ 收稿日期 ] - - [ 修回日期 ] - - *[ 基金项目 ] 浙江省医药卫生科技计划 ( ); 浙江省科技厅公益性技术应用研究计划 ( ); 杭州市科技发展计划 ( ; ); 浙江省自然科学基金资助项目 ( ) 通讯作者 : - ; - : @ μ 姜黄素组与对照组相比, 划痕修复率 降低, 穿膜细胞数目显著下降 姜黄素作用肺癌 - 细胞 后, - 表达下调 转染 - 和 后, - 组比对照组的细胞活力显著降低 ( <. ), 划痕修复率及穿膜细胞数目显著下降 ( <. ) 姜黄 素与 - 均抑制了 - 细胞 通路的激活 姜黄素与 - 联用时, 细胞活力降低 ( <. ), 划痕 修复率 细胞侵袭能力及 磷酸化水平下降 结论 : 在肺癌 - 细胞中, 姜黄素通过下调 - 表达 调控下 游 通路来抑制细胞迁移和侵袭 [ 关键词 ] 姜黄素 ; 肺癌 ; 细胞迁移 ; 细胞侵袭 ; - [ 中图分类号 ] [ 文献标志码 ] : - - - -, -, -,,, - (,,, - : @ ) [ ] : -, - :, - -,, -, - - - : - - μ μ - - - ( < ), - ( <. ) - ( <. ) - - - - +,,, - : - - - [ ] ; ; ; ; - 肺癌的发病率和死亡率居于恶性肿瘤的首位, 近 年来肺癌的发生率和死亡率均明显升高 肺
SOURCE: http:// 癌转移是引起肺癌患者死亡的主要原因, 如何抑制肺癌转移是目前肺癌治疗需要解决的重要问题 姜 黄素 (, ) 是一种姜黄根茎中分离提取出 来的天然小分子多酚化合物, 具有广泛的药理作用 近年来, 大量文献报道姜黄素对多种癌细胞均有抑 [ - ] 制其增殖 迁移和侵袭的作用 我们以往的研究 也发现姜黄素可调节抑制 家族的 和 通路影响肺癌细胞骨架重排, 抑制肺癌细胞的侵袭 和迁移 [ - ] 家族属于免疫球蛋白细胞黏附 分子, 和 组成的细胞间黏附系统在肿瘤细胞的粘附和侵袭中发挥重要作用 近年来的研 究发现外源性 - 的表达将通过激活 通路 提高 - 和 - 细胞的丝状伪足形成率和侵 袭能力, 且非小细胞肺癌患者血清中的 - 含量 比健康人高, - 可作为肺癌的发展转移过程中 新型的血清学和组织学标志物 但是 - 是 否参与姜黄素对肺癌转移的抑制过程尚不清楚 本研究以肺癌 - 细胞为研究对象, 通过不同 浓度姜黄素处理和 - 干扰技术来检测两 者抑制肺癌 - 细胞的迁移和侵袭的能力, 并从中 寻找两者的关系 材料 材料和方法 肺腺癌细胞株 - 购自 细胞库 ; 姜黄素 和二甲基亚砜 ( ) 均购自 ; 小牛血清购 自 ; 培养基和牛血清白蛋白购自杭州吉诺 公司 ; 转染试剂采用 购自 - ; 试剂盒购自凯基生物 ; 抗 - 抗体购自 ; 抗磷酸化及总 抗体购自 ; 抗 抗体购自 ; 标记的 抗购自 - ; 化学发光试剂盒购自 蛋白质 电泳和转膜设备和酶标仪购自 - 方法. 细胞培养和转染细胞在含有 % 小牛血清 的 - 培养基中置于 % 培养箱 中培养 采用. % 胰酶 +. % 溶液消化细胞 选用生长情况良好的对数生长期细胞进行 实验 - ( - ) 由上海吉玛公司 合成, 经前期实验, 选用干扰效果最佳序列, 上游 序列为 - -, 下游 序列为 - -. 实验测试细胞活力将对数生长期细胞 经胰酶消化后配成 浓度的细胞悬液, 每孔 μ 接入 孔板 细胞 贴壁后, 进行实验, 复孔 个 检测时, 每孔换液加入 μ, 孵育, 弃上清, 每孔加入 μ -, 振荡使沉淀充分溶解, 酶标仪 度 ( ) 值 检测吸光. 实验处理完成的细胞用裂解液 提取蛋白, 使用 试剂盒按说明书测试蛋白浓度 并配制样品, 上样 μ - 及转膜, 用含 % 牛血清白蛋白的 封闭目的蛋白, 常温封闭, 洗膜 抗按抗体说明书使用碧云天 抗稀 释液稀释后 孵育过夜, 洗膜 次, 抗用封闭液稀释合适比例后 孵育, 洗膜 次后用 法对目的蛋白进行发光, 在凝胶 成像系统中拍照, 作为内参照 用 软 件测试目的蛋白条带的灰度值进行分析. 划痕修复实验处理过的细胞在 孔板中培养, 第 天用 μ 枪头沿直线在孔底划线, 清 洗 次, 加入含相应姜黄素浓度或不含姜黄素的. % 血清的新鲜培养基培养, 在倒置显微镜下拍照 ( ), 在划痕边缘等距量取距离, 培养 后, 再拍照同样位置量取距离 划痕修复率 (%) =( 划痕宽度 划痕宽度 ) 划痕宽度 %. 小室实验加药或转染后的细胞用 无血清培养基消化配成. 的细胞悬液, 铺 好 的上室中每孔加入 μ 细胞悬液, 下室加入 μ 含有相应浓度药物的 培养基 ( % 血清 ) 培养箱内培育 后, 清洗小室 次, 冰甲醇固定细胞 后风干, 结晶紫染 色, 清水清洗小室 次, 棉签轻轻吸干上室水 分, 倒置显微镜下拍照 ( ) 用 计算细 胞数目 统计学处理所有实验均重复 次, 实验数据用均数 ± 标准 差 ( ± ) 表示, 采用 进行数 据分析 使用 制图 多组间比较 应用单因素方差分析, 组间两两比较应用 检验, 以 <. 为差异有统计学意义 结 果 姜黄素抑制 - 细胞活力 迁移和侵袭 示 ~ 姜黄素处理 - 细胞 后, 实验结果显 μ 姜黄素均能抑制 - 细胞的生 长, 抑制率分别是 (. ±. )% (. ±. )% (. ±. )% 和 (. +. )%, 随 着给药剂量的增加, 姜黄素对肺癌细胞的生长抑制 作用显著增强 ( <. ), 见图 划痕修复实验
SOURCE: http:// 结果显示, 与对照组相比, 姜黄素 μ 和 μ 组划痕愈合率分别下降了 (. ±. )% 和 (. ±. )%( <. ), 表明姜黄素能抑制 - 细胞的迁移, 见图 小室实验结果显示, 对照组 姜黄素 μ 组和姜黄素 μ 组侵袭至 小室滤膜下表面的细胞数分别为 ± ± 和 ±, 姜黄素 μ 和 μ 组较对照组细胞穿膜数目显著下降 ( <. ), 表明姜黄素能抑制 - 细胞的侵袭, 见图, - ( ) : - ; : - μ μ ; : - μ μ ± =. 图 姜黄素对 - 细胞活力 迁移和侵袭的作用 姜黄素下调 - 蛋白的表达 检测结果显示, 和 μ 姜黄素作用肺癌 - 细胞 后, - 蛋白的表达均显著下降 ( <. ), 见图 干扰 - 抑制 - 细胞活力 迁移和侵袭 通过前期实验, 我们选取干扰效果最佳的基 因片段, 构建 - 检测结果显 * <., ** < 示, 与对照组相比, - 组的 - 蛋白表达 明显下降 ( <. ), 见图 实验结果显示 - 分别转染 - 细胞 和 后, 细胞活力与对照组相比分别下降了 (. ±. )% (. ±. )% (. ±. )% 和 (. ±. )%, 转染 和 后, - 组与对照组相比差异有统计学意义 ( <. ), 表明
SOURCE: http:// - - ( ) ± = * <. 图 姜黄素作用对 - 细胞中 - 蛋白表达的影响 干扰 - 能抑制 - 细胞活力, 见图 划痕修复实验结果显示, 与对照组相比, - 组的划 痕愈合率下降了 (. ±. )%, 差异具有统计学 意义 ( <. ), 表明 - 能抑制 - 细胞的迁移, 见图 小室实验结果显示, 与对 照组相比, - 组侵袭至 小室滤膜下 表面的细胞数显著下降 ( <. ), 表明 - 能抑制 - 细胞的侵袭, 见图 姜黄素和干扰 - 均能抑制 通路 ~ 的磷酸化 ( 细胞的 磷酸化 ( 差异, 见图 μ 浓度姜黄素均能抑制 - 细胞 <. ), - 也抑制了 - <. ), 总 表达无明显 姜黄素与 - 联合对 - 细胞活力 迁 移 侵袭及 通路的影响 - 与姜黄素合用后, 细胞活力 划痕修复 率 细胞迁移及侵袭能力均较单用姜黄素组下降 ( <. ) 同时检测它们 通路磷酸化的变化, 发现与姜黄素单用组比较, - 与姜黄素合用明显抑制 通路磷酸化, 见图, - - : - - - ; : - - ; : - - ; : - - ± =. 图 干扰 - 的表达对 - 细胞活力 迁移和侵袭作用的影响 ** <
SOURCE: http:// - ( ) - : - - - ; : - - - ± = 图 姜黄素与 - 分别对 - 细胞 讨 论 ** <. ; ## <. 磷酸化水平的影响 姜黄素具有抗氧化 抗衰老及抗肿瘤的作用 以往的研究从多个方面阐释了姜黄素的抗肿瘤机 制, 例如在肺癌 和 细胞中, 姜黄 素通过激活 上调 - - 和 - 表达, 下调靶基因, 从而促进细胞凋亡 ; 姜黄素能 通过抑制 信号通路降低 - 和 - 表达, 抑制肺癌 细胞的迁移和侵袭 ; 姜黄 素还可通过抑制 通路诱导自噬 和抑制细胞毒性 在乳腺癌 - - 细胞 中, 等发现姜黄素抑制了由 引起的整 合素 α β 位置的变化, 从而抑制了细胞的增殖和丝状伪足形成 本实验结果表明, 姜黄素能下调细胞 黏附分子 - 表达并通过 途径抑制肺癌 - 细胞的活力 迁移和侵袭 是 + 依赖的免疫球蛋白样细胞间黏附分子, 该家族成员通过 和细胞骨架联系, 调 控细胞运动 - 是该家族研究较为清楚的 一个分子, - 与 - 可通过 域相互传动 作用 等报道 通过激活 和 使 通路活化 等也发现 - 可以调控血小板源性生长因子受体 ( - -, ) 及其下游通路, 影响成纤维细胞的生长过程 我们前期实验表 明, 降低 - 的表达将抑制肺癌 和 - 细 胞的迁移和侵袭能力, 说明 - 在肺癌细胞生长 中起到关键作用, - 可成为预测肺癌转移的生物标志物 在本研究中, 我们发现 - 参与 - 细胞的生长和迁移过程 因此, 作为调控细 胞黏附的重要分子, 可能是肿瘤细胞的迁移和侵袭 的重要靶点 为进一步明确姜黄素与 - 之间的关系, 还 需要通过动物水平来研究 - 抑制肿瘤的功能 目前, 等 已证实干扰 - 能抑制小鼠 体内肿瘤生长, 乳腺癌 细胞中 - 促进了不贴壁细胞中的细胞间接触组装, 与整合素 β 相 互作用并持续激活了 家族激酶 等 [ ] 则 进一步研究 - 与 - 耐药的关系, 发现 - - 通过 - 通路增强结肠癌细胞对 - 的 耐药性, 而该通路与肺癌细胞的增殖 迁移和侵袭紧 密相关 与该机制类似, 我们通过 实 验发现姜黄素抑制了 - 蛋白的表达, 且同时抑制了肺癌 - 细胞的活力 迁移 侵袭及 通路 的磷酸化, 与干扰 - 后的表现一致 进一步我 们发现姜黄素与干扰 - 联用时, 细胞活力 迁移 侵袭能力及 磷酸化水平更低, 这些结果说明 姜黄素抑制肺癌 - 细胞生长 迁移的细胞机制与 下调 - 有关, 姜黄素可能是通过下调 - 来抑制细胞活力 迁移 侵袭 不过, 本研究发现在肺癌 - 细胞中, 干扰 - 不仅能抑制细胞活力, 而且可以抑制细胞迁
SOURCE: http:// ( ) -,, - : - - ; : - - ; : - - ; : - - - - ± = μ ** <. + μ ; # <. + 图 姜黄素与干扰 - 联合应用对 - 细胞的活力 迁移 侵袭及 磷酸化水平的影响 移与侵袭, 这个结果与 等提出在乳腺癌 细胞中 - 未引起 变化和转移变 化的结果有所不同, 我们认为不同的结果可能与不同细胞有关 总之, 本研究发现了姜黄素与干扰 - 具有 同样的抑制肺癌 - 细胞活力 迁移 侵袭和 磷酸化的能力, 姜黄素能降低 - 蛋白的表达, 姜黄素与干扰 - 联合应用使细胞活力 迁移 侵袭能力及 磷酸化水平更低, 推测姜黄素抑制 细胞活力 迁移 侵袭与下调 - 有关, - 可能是姜黄素抑制肿瘤的途径之一 研究结果为姜 黄素抑制肿瘤细胞生长的机制提供了新思路, 为 - 作为新的肺癌转移治疗的靶向分子提供了 实验证据
SOURCE: http:// [ 参考文献 ] [ ], -,, -κ - [ ],, ( ): - [ ],,, - - [ ],, ( ): - [ ],,, -, - [ ],, ( ): - [ ],,, - - - - [ ],, ( ): - [ ],,, [ ] 焦德敏, 胡慧珍, 唐夏莉, 等 - 在肺癌组织中,,, - 的表达及干扰 - 对肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响 [ ] 肿瘤学杂志,, ( ): - [ ],, - : [ ],, ( ): -,,, - - - - - - - [ ],, ( ): -,,, - [ ],, ( ): -, α β [ ],, ( ): -,,, - : [ ],, ( ): -,,,, - - - [ ],, ( ): -,,, - - [ ],, - -, ( ): - [ ],,,, [ ],, ( ): - [ ],,,,, ( ): - [ ],,, - - [ ],, ( ): - -,,, [ ],, ( ): - - - [ ],, : - - [ ],, ( ): - 唐夏莉, 焦德敏, 陈君, 等 - 对肺癌 细胞的增殖 迁移 侵袭及 信号通路的影响 [ ] 中国病理生理杂志,, ( ): - ( 责任编辑 : 陈妙玲, 罗森 )