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陵腾富
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1 七年制专业学位论文论文题目 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的研究生姓名指导教师姓名专业名称研究方向论文提交日期关系张晓虹徐红临床医学肿瘤学 2013 年 5 月

3 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系中文摘要 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系中文摘要研究背景 : 伊立替康 (irinotecan,cpt-11) 为 DNA 拓扑异构酶 I 抑制剂, 主要作用于细胞周期的 S 期, 抑制 DNA 单链断裂后的修复, 干扰 DNA 复制和转录, 从而发挥细胞毒效应, 对转移性结直肠癌肺癌等多种肿瘤有效, 但因其可能发生骨髓抑制及延迟性腹泻等严重不良反应, 在临床应用中受限不良反应的发生存在明显的个体差异, 研究显示尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶 1A1(uridine-diphosphoglucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1) 基因多态性影响伊立替康的主要代谢酶 UGT1A1 活性, 进而影响到其活性产物 SN-38 与灭活产物 SN-38G 的相互转化, 是造成这种化疗毒性差异的重要原因之一此外,UGT1A1 多态性具有明显的种族差异, 汉族人群 UGT1A1 基因突变率较低,UGT1A1 基因的多态性对汉族患者应用含伊立替康的方案化疗后不良反应和疗效的预测作用仍有待进一步深入, 通过检测 UGT1A1 基因多态性指导中国患者的临床用药是否合适尚需进一步探讨研究目的 : 观察临床应用含伊立替康方案化疗的恶性肿瘤患者不良反应及疗效与 UGT1A1*28 及 UGT1A1*6 基因多态性的相关性方法 :1. 研究对象 :2010 年 8 月至 2012 年 11 月在苏州大学附属第一医院采用以伊立替康为基础的方案化疗的汉族恶性肿瘤患者 107 例, 采集患者病史及外周血, 记录患者化疗期间不良反应, 采用实体瘤治疗疗效评价标准 1.1(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST 1.1) 对其中 53 例可评价的结直肠癌患者进行近期疗效的评价, 并随访其疾病进展时间 (Progression-free survival, PFS); 2. 基因分型 : 从患者外周血中抽提基因组 DNA,UGT1A1*6 位点采用高分辨率熔解曲线 (high resolution melting analysis, HRM 或 HRMA) 技术进行基因分型,UGT1A1 *28 位点采用直接测序法进行基因分型 ; 3. 通过分析 UGT1A1*6 UGT1A1*28 及两位点综合分析, 比较不同基因型之间严重不良反应的差异, 并对其中 53 例可评价的结直肠癌患者分析 UGT1A1 多态性对近期 I

4 中文摘要 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系疗效及 PFS 有无影响 4. 采用 SPSS 17.0 统计学软件进行统计学分析, 组间不良反应的比较采用卡方 (χ 2 ) 检验或 Fisher 确切概率法 ; 不同基因型之间疗效的比较采用有序分类的 Logistic 回归分析 ; 用 Kaplan-Meier 生存分析拟合 PFS 曲线, 并采用 COX 回归分析 PFS 的影响因素, 比较不同基因型间 PFS 的差异 ;P<0.05 视为差别有统计学意义结果 :107 例以伊立替康为基础化疗的晚期恶性肿瘤患者中 UGT1A1*28 及 UGT1A1*6 的纯合突变率分别为 0.9% 和 2.8% 化疗后发生 3/4 级血液毒性反应的患者 29 例, 占 27.1%; 发生 3/4 级腹泻的患者 10 例, 占 9.3% UGT1A1*28 突变者较野生型患者 3/4 级血小板减少 (P=0.09) 和腹泻 (P=0.041) 发生率明显增加,3/4 级中性粒细胞及血红蛋白减少未见明显差异 (P>0.05) UGT1A1*6 多态性与 3/4 级血液学总毒性 (P=0.036) 及中性粒细胞减少 (P=0.034) 相关, 但对血红蛋白及血小板无明显影响 (P>0.05), 并不增加严重腹泻的发生风险 (P=0.848) UGT1A1*6/*28 *28/*28 或 *6/*6 者无论血液学毒性还是迟发型腹泻的风险均明显增加对剂量进行的亚组分析结果提示, 较低剂量组不良反应与 UGT1A1 多态性之间无明显相关性, 而较高剂量组不同基因型之间不良反应的发生差别有统计学意义 UGT1A1 多态性对伊立替康化疗反应率无明显影响,UGT1A1*28 及 UGT1A1*6 两位点综合分析提示 UGT1A1 野生型较纯合型患者可获得较好的 PFS(RR=2.187,P=0.037) 结论 :UGT1A1 多态性与含伊立替康的方案化疗后 3/4 级血液学毒性及迟发性腹泻的发生相关, 且在较高剂量时尤为明显此外,UGT1A1 野生型患者可获得更长的 PFS, 但对近期疗效未见明显影响疗效关键词 : 伊立替康 ; 基因多态性 ; 尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶 1A1; 不良反应 ; 作者 : 张晓虹指导教师 : 徐红毛一香 II

5 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系英文摘要 The Relationship between the Toxicity and Efficacy of Irinotecan and UGT1 A1 Gene Polymorphisms Abstract Background: Irinotecan (CPT-11) is a DNA topoisomerase I inhibitor, effecting on the S phase of the cell cycle, that interferes with DNA replication and cell division.it is widely used for the treatment of metastatic colorectal cancer and other solid tumors. Because of it s possible serious adverse reactions, it is restricted in clinical application. However, there is an obvious individual difference in such adverse reactions, and studies showed that uridine-diphosphoglucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) gene polymorphism is one of the important causes. UGT1A1 gene polymorphisms effect the activity of the main metabolic enzyme of irinotecan, and affect its conversion of activity product of SN-38 and inactivation of SN-38G.In addition, the UGT1A1 polymorphism has obvious ethnic differences. The UGT1A1 gene mutation rate is very low in Chinese Han population, and predictive role of UGT1A1 gene polymorphism in patients with irinotecan chemotherapy efficacy and toxicity remain to be further. Whether it is appropriate by detecting UGT1A1 gene polymorphism in Chinese patients to guide clinical medication needs further investigation. Objective: To study the differences in efficacy and toxicity among UGT1A1*28 and UGT1A1*6 gene polymorphisms with irinotecan chemotherapy. Methods: 1 Subjects: A total of 107 Han Chinese patients with malignant tumor were enrolled at the First Affiliated Hospital of Soochow University from August, 2010 to November, 2012, and all patients received irinotecan based chemotherapy. Collect the patients peripheral blood and medical history, record the adverse reactions and recent clinical efficacy,follow up the progression-free survival (PFS); 2 Genotyping: Genomic DNA was extracted from peripheral blood, application of III

6 英文摘要 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系 high resolution melting analysis (HRM or HRMA) technology was used for UGT1A1*6 genotyping, and direct sequence was used for UGT1A1*28 genotyping; 3 Compare the differences among different genotypes of serious adverse reactions. And response was assessed in 53 of the colorectal cancer patients, analysis differences in response and Progression-free survival (PFS) among UGT1A1 polymorphisms; 4 Statistical analysis:using SPSS17.0 statistical software for statistical analysis, the chi-square(χ 2 ) test or Fisher s exact test was used to evaluate the association of UGT1A1 genotype with toxicity. Analysis of responce between different genotypes were compared using polytomous Logistic regression analysis, introduced the related factors for correction; PFS was calculated by the Kaplan-Meier method, and the affecting factors were analyzed by COX regression. Correlations were considered statistically significant when the twotailed P value was less than Results: In 107 cases with irinotecan based chemotherapy, homozygous mutation rates of UGT1A1*28 and UGT1A1*6 were 0.9% and 2.8%. Severe hematological toxicity occurred in 29 patients, accounting for 27.1%; 10 patients occurred in grade 3/4 diarrhea, accounted for 9.3%. The incidence of grade 3/4 thrombocytopenia (P=0.09) and delayed diarrhea (P=0.041) in the patients carrying UGT1A1*28 (TA6/7 or TA7/7) was higher than that in the wild genotype (TA6/6), while neutropenia showed no significant difference (P>0.05). UGT1A1*6 polymorphism was associated with the general toxicity of hematology (P=0.036) and grade 3/4 neutropenia (P=0.034). It seems that there was no significant effect on hemoglobin and platelet (P>0.05), and does not increase the risk of severe diarrhea (P=0.848). Comprehensive analysis of the two sites indicated that UGT1A1 mutations significantly increased the risk of both hematological toxicity and delayed diarrhea.subgroup analysis of CPT-11dose suggested that there was no significant association between toxicity and UGT1A1 polymorphisms in low dose group. In the higher dose group toxicity was significantly associated with UGT1A1 polymorphisms.the UGT1A1 polymorphism had no effect on the responce rate. Compared with defective allele groups, wild type patients may obtain a better PFS (RR=2.187,P=0.037). IV

7 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系英文摘要 Conclusion: The UGT1A1 polymorphisms significantly associated with irinotecan induced hematologic toxicity and delayed diarrhea, particularly at higher doses. UGT1A1 wild type patients may obtain longer PFS, but there was no significant effect on the response rate. Keywords: Irinotecan; gene polymorphism; UGT1A1; toxicity; efficiency Written by: Xiao-hong Zhang Supervised by: Hong Xu Yi-xiang Mao V

8 目录中文摘要...I Abstract...III 引言...1 研究对象与方法...3 结果...8 讨论...18 结论...24 参考文献...25 综述...29 中英文对照缩略词表...42 附录...43 致谢...45

9 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系引言引言伊立替康 (irinotecan, CPT-11) 是喜树碱半合成衍生物, 其主要代谢部位在肝脏, 经静脉注射后, 在体内经羧酸酯酶 (carboxylesterases, CES) 水解转化为其活性代谢产物 7- 乙基 -l0- 羟基喜树碱 (7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin, SN-38) SN-38 为 DNA 拓扑异构酶 I 抑制剂, 主要作用于细胞周期的 S 期, 抑制 DNA 单链断裂后的修复, 干扰 DNA 复制和转录, 从而发挥细胞毒效应 SN-38 主要经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶家族 (uridine diphosphate glucuronosyltransferases, UGTs) 灭活为葡萄糖醛酸产物 (SN-38G), 然后经胆汁排泄入肠, 在肠道细菌 β- 葡萄糖醛酸酶 (β-glucuronidase) 作用下转换为 SN-38, 引发肠黏膜损伤及迟发性腹泻 ; 而肠道内的 UGT 酶又可再度催化 SN-38 为 SN-38G 解毒 [1] CPT-11 现已获批单药或与 5-Fu 联合, 用于转移性结直肠癌的一线和二线治疗, 同时对胃癌小细胞肺癌卵巢癌等也有较好的疗效国外临床研究表明采用伊立替康为基础的方案化疗可以提高患者的化疗有效率无疾病进展生存时间 (progression-free survival, PFS) 和总生存时间 (overall survival, OS) [2, 3] 但因其可能发生的严重剂量限制性不良反应, 使伊立替康在临床的应用受到限制伊立替康的剂量依赖性毒性主要为迟发性腹泻和中性粒细胞减少, 两者发生率分别可达到约 46% 和 30%, 甚至可以导致患者死亡 [3] 近年有不少研究证实 UGT1A1 酶的功能及其基因多态性与伊立替康的毒性有着密切关系国外临床研究表明, 应用伊立替康治疗的高加索人中,UGT1A1 基因启动子区 TATA 重复序列的变化即 UGT1A1*28 的杂合突变型 TA6/7 和纯合突变型 [4, TA7/7 显著增加患者发生严重粒细胞减少和腹泻的风险 5] 日本学者研究发现亚洲人应用伊立替康进行治疗的患者中 UGTIA1*6( 第 1 外显子 211 位 ) 杂合突变型 G/A 和纯合突变型 A/A 显著增加患者发生 3/4 级中性粒细胞减少血小板减少及迟发性腹泻的风 [4, 6, 险 7] UGTs 酶的表达及其活性, 与 CPT-11 的疗效及不良反应均密切相关,UGT1A1 基因启动子区突变或单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 成为研究热点 UGTl 基因位于 2 号染色体,UGT1A1 是其一个亚型, 目前在 UGT 基因家族中研究 1

10 引言 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系 [8, 最多其含 30 多个基因变异体, 其中很多都可影响酶的功能和分布 9] UGT1Al*28 是目前报道最多的 UGT1A1 基因变异体 UGT1A1 基因启动子区具有一定多态性, 其不典型 TATA 盒区域中包含了 5-8 个 TA 重复序列, 野生型 UGT1A1*1 为 6 个 TA 重复序列, 即 (TA6/6 或 *1/*1), 最为常见 ; 变异型 UGT1A1*28 为 7 个 TA 重复序列, 包括纯合突变型 (TA7/7 或 *28/*28) 和杂合突变型 (TA6/7 或 *1/*28), 该变异型与可影响 UGT1A1 表达, 与伊立替康化疗所致的严重血液毒性及迟发性腹泻有关 [10] 此外,UGT1A1*6 作为伊立替康相关严重毒性的另一重要预测基因, 也受到越来越多的关注 UGT1A1*6 的多态性表现为第 1 外显子 211 位的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNP), 形成 3 种基因型 :G/G A/G 和 A/A 该变异只在亚洲人基因的编码区发现, 并已证实能降低 UGT 酶的活性随着伊立替康在我国的广泛应用, 发现中国患者严重迟发性腹泻的发生比例明显少于欧美国家这种差异一方面可能与国内化疗剂量不足有关, 另一方面研究发现 UGT1A1 基因多态性的分布存在明显的种族差异 UGT1A1*28 的纯合突变型 TA7/7 在亚洲人中仅为 0%~5% [6, 11], 远低于在非洲人和高加索人中的频率 12%~27% 和 10%~15%, 而 UGT1A1*6 突变只在亚洲人基因的编码区发现, 发生率高达 13%~23 % [12] 这种种族差异可能导致伊立替康在不同人种的毒性反应和疗效反应存在差异因此预测中国患者不良反应的发生应综合考虑 UGT1A1*6 和 UGT1A1*28 位点基因多态性的影响本研究通过对 107 例恶性肿瘤患者的 UGT1A1*6 和 UGT1A1*28 基因多态性的检测, 探讨 UGT1A1 基因多态性与伊立替康化疗的不良反应和疗效之间的关系 2

11 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系研究对象与方法研究对象与方法 1 研究对象研究对象均来自 2010 年 8 月至 2012 年 11 月在苏州大学附属第一医院采用含伊立替康的方案化疗的汉族晚期恶性肿瘤患者 107 例, 其中结直肠癌 69 例胃癌 24 例食管癌 4 例小细胞肺癌 6 例和卵巢癌 4 例具体纳入标准为 : 1) 有病理组织学或细胞学证据, 并有 CT MRI 或 PET-CT 证实复发或转移的汉族恶性肿瘤患者 ; 2) 接受一线或非一线含伊立替康的方案化疗, 方案包括伊立替康联合氟尿嘧啶卡培他宾替吉奥雷替曲塞, 或伊立替康单药, 伊立替康平均剂量为 150mg/m 2 /2w 2 UGT1A1 基因分型 2.1 血样采集选择应用伊立替康化疗的符合入组条件的患者, 抽取外周血 3mL, 置入 EDTA 抗凝管, 于 -20 保存 2.2 DNA 的提取质控及浓度标准化 1) 取 400μl 全血于 2ml 离心管中, 加入 410μl STE 溶液 90μl 10% 异丙醇 (SDS) 溶液及 10μl 蛋白酶 K 于离心管中, 轻轻摇晃 2min 混合均匀, 置于 65 水浴锅中消化过夜 ; 2) 在充分消化的血样中加入 300μl 饱和 NaCl 溶液后, 轻轻颠倒混匀 ; 3) 加入 400μl 氯仿轻摇混匀,20,12000rpm, 离心 20min; 4) 将上清液移至新的 1.5ml 离心管中, 加入等体积的预冷 (-20 ) 的异丙醇混合均匀,4,12000rpm, 离心 15min, 弃掉上清液 ; 5) 加入预冷 (-20 ) 的 75% 乙醇溶液与离心管中洗涤沉淀,4,12000rpm, 离心 15min, 弃掉上清液 ; 3

12 研究对象与方法 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系 6) 重复步骤 5); 7) 室温条件下将沉淀晾干, 加入 100μl Mili-Q 水溶解沉淀 ; 8) 取 1μlDNA 样本, 采用 1% 琼脂糖凝胶电泳对样本的质量进行检测, 并采用紫外可见分光光度计测定样本纯度及浓度 ; 9) 用 Mili-Q 水将 DNA 样本均稀释至 10ng/μl 备用 2.3 引物设计根据 Genbank 的 UGT1A1 基因序列, 利用 Primer Premier 5 软件设计 UGT1A1 基因两个药物遗传多态性位点 UGT1A1*6(rs , G>A) 和 UGT1A1*28(rs , (TA)6>(TA)7) 的特异性引物, 位点信息及引物序列如表所有引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成, 引物母液浓度为 100μM, 将所有引物均稀释至 10μM 和 1μM 备用表 UGT1A1 基因位点信息及引物序列 Primer Name Primer Sequence Product Size UGT1A1*6 F 5 - CAGCAGAGGGGACATGAAAT bp UGT1A1*6 R 5 - CAAAACATTATGCCCGAGAC -3 UGT1A1*28 F 5 - TCCCTGCTACCTTTGTGGAC bp UGT1A1*28 R 5 - CTTTGCTCCTGCCAGAGGT PCR 反应及 HRM 反应 PCR 反应检测引物扩增效率以人外周血 DNA 为模板进行 PCR 扩增, 并采用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物基因组 DNA 测序 PCR 反应体系如表

13 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系研究对象与方法表 PCR 反应体系成分 ( 浓度 ) 2*Taq Master Mix Forward Primer (1μM) Reverse Primer (1μM) DNA 模板 Mili-Q 水体积 (μl)/1 个反应 5μl 1μl 1μl 1μl 2μl 总体系反应条件 : 预变性 95,5min 94,30sec;60,30sec;72,15sec,35 个循环 72,10min 10μl HRM 反应以人外周血 DNA 为模板进行 touch down PCR 扩增, 并采用 HRM 的方法进行检测, 反应体系及条件如表表 HRM 反应体系成分 ( 浓度 ) 体积 (μl)/1 个反应 2* Master Mix 5μl 25mM MgCl 2 Forward Primer (10μM) Reverse Primer (10μM) DNA 模板 Mili-Q 水 1.2μl 0.2μl 0.2μl 1μl 2.4μl 总体系 10μl 反应条件 : 预变性 95,5min 变性 95,10sec;65 ~55 (1 /step down),15sec;72,10sec, 55 个循环 95,1min 65 ~95 退火 2.5 分析方法采用 Bioedit 软件进行序列比对, 采用 LightCycler Nano SW 1.0 软件进行 HRM 结果分析, 并随机抽取若干样本进行测序验证 5

14 研究对象与方法 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系 3 临床资料收集通过查阅患者病史影像学检查实验室检查 ( 包括血常规生化全套肿瘤标志物检测 ) 资料, 记录患者年龄性别病理类型既往抗肿瘤治疗情况, 具体化疗方案及不良反应等 4 药物毒性评价标准采用美国国家癌症研究所不良反应分度标准 3.0(National Cancer Institute Common Toxicity Criteria, version 3.0) 对患者化疗后不良反应进行评价该标准中提到的不良反应均按照 0-4 级来记录, 其中 3 或 4 级为严重不良反应本次研究纳入的不良反应主要包括腹泻和血液学指标毒性, 其中血液学毒性指标包括中性粒细胞血红蛋白血小板数量 3 个指标具体评估标准见附录一 5 疗效评价标准对 107 例患者中结直肠癌患者 69 例, 其中有可评价病灶的 53 例结直肠癌患者参照实体瘤治疗疗效评价标准 1.1(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST, Version 1.1) 评估近期疗效 ( 见附录二 ), 并随访其疾病进展时间 (Progression-free survival, PFS), 另有 16 例因转移灶术后非肿瘤进展所致的死亡或拒绝化疗未纳入疗效评估疗效分为 : 完全缓解 (complete response, CR) 部分缓解(partial response, PR) 疾病稳定(stable disease, SD) 及疾病进展 (progressive disease, PD) CR+PR 计算客观缓解率 (objective response rate, ORR),CR+ PR+SD 计算疾病控制率 (disease control rate, DCR) PFS 定义为 : 首次化疗至原发肿瘤进展或死亡的时间 6 统计分析分析采用 SPSS17.0 统计学软件不同组间不良反应的比较采用卡方检验或 Fisher 确切概率法 ; 不同基因型之间疗效的比较采用有序分类的 Logistic 回归分析 ; 用 Kaplan-Meier 生存分析拟合 PFS 曲线, 并采用 COX 回归分析 PFS 的影响因素, 比较不同 6

15 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系研究对象与方法基因型间 PFS 的差异 ;P<0.05 视为差别有统计学意义 7

16 结果 UGT1A1 基因多态性与伊立替康毒性及疗效的关系结果 1 研究对象的基本临床特征表例恶性肿瘤患者的基本临床特征临床特征人数 (N) 百分比 (%) 年龄性别类别 CPT-11 剂量化疗时机转移器官数既往手术既往放疗 > 男女结直肠癌胃癌其他 mg/m >150mg/m 一线非一线是否是否

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864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲