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好虞
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1 SolPure DNA Kits 盐析法 DNA 抽提试剂盒从各种生物样品中提取高分子量 DNA

2 目录简介原理试剂盒组成保质期准备工作方案 1: 血液 DNA 提取方案方案 2: 旧血 DNA 提取方案方案 3: 血液 DNA 快速提取方案方案 4: 凝血 DNA 提取方案方案 5: 血液黄层 DNA 提取方案方案 6: 组织 DNA 提取方案方案 7: 体液 DNA 提取方案方案 8: 细胞 DNA 提取方案方案 9: 细菌 DNA 提取方案方案 10: 口腔拭子 DNA 提取方案常见问题回答版本 : 第 1 页共 24 页

3 简介 SolPure DNA Kits 采用改良盐析法纯化方式, 为血液样品组织样品培养细胞口腔拭子, 细菌等样品的基因组 DNA 提取提供一条安全而经济的解决方法提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提, 也无需用到任何昂贵的试剂, 是目前核酸抽提中最为经济的试剂盒试剂盒对样品用量无限制, 可灵活调节各种用量的样品得到的 DNA 可直接用于 PCR 酶切,Southern 杂交等实验 SolPure Blood DNA Kit 适合于从血液样品中提取高分子量的基因组 DNA SolPure Tissue DNA Kit 适合于从动物组织中提取高分子量的基因组 DNA SolPure Cell DNA Kit 适合于从培养细胞样品中提取高分子量的基因组 DNA SolPure Bacterial DNA Kit 适合于从细菌或真菌样品中提取高分子量的基因组 DNA SolPure Buccal Cell DNA Kit 适合于从口腔脱落细胞, 拭子中提取基因组 DNA 原理 SolPure DNA Kits 是改良的盐析法纯化方式 ( 血液样品在红细胞裂解液中裂解去除红细胞, 离心收集白细胞 ), 组织白细胞或培养细胞在裂解中裂解,DNA 释放到裂解液中, 加入 RNASE A 消化去除 RNA; 加入高盐溶液至裂解液中盐析沉淀蛋白质和杂质 ; 离心去除沉淀得到只含 DNA 的上清液, 加入异丙醇沉淀回收 DNA;70% 乙醇洗涤去除盐分, 最后加入 Buffer TE 溶解 DNA 保质期 SolPure DNA Kits 除 RNase A Lysozyme Proteinase K 和 Glycogen 外, 其它组分可在室温下 (15-25 ) 干燥保存 12 个月 RNase A Lysozyme Proteinase K 和 Glycogen 室温运输, 收到试剂盒后, 取出 RNase A Lysozyme Proteinase K 和 Glycogen 并保存于 2-8 低温保存或运输过程中,Buffer WLB 可能会有沉淀形成, 需 37 水浴让沉淀完全溶解第 2 页共 24 页

4 组成 SolPure Blood DNA Kit 产品编号 D D D 可处理的血液体积 50 ml 300 ml 1000 ml 10 x Buffer RBC 20 ml 100 ml 400 ml Buffer WLB 60 ml 350 ml 2 x 550 ml Buffer PPS 20 ml 120 ml 350 ml Buffer TE 10 ml 50 ml 200 ml RNase A 300 µl 1.8 ml 5.5 ml 说明书 SolPure Tissue DNA Kit 产品编号 D D D 可处理的组织量 1 g 5 g 50 g Buffer WLB 40 ml 200 ml 2 x 900 ml Buffer PPS 15 ml 70 ml 600 ml Proteinase K 3.3 mg 16 mg 160 mg Protease Dissolve Buffer 1 ml 1 ml 12 ml RNase Solution 160 µl 800 µl 8 ml Buffer TE 20 ml 100 ml 550 ml 说明书 SolPure Cell DNA Kit 产品编号 D D D 可处理的细胞数量 2 x x x Buffer WLB 40 ml 200 ml 2 x 900 ml Buffer PPS 15 ml 70 ml 600 ml RNase Solution 160 µl 800 µl 8 ml Buffer TE 20 ml 100 ml 550 ml 说明书第 3 页共 24 页

5 组成 SolPure Bacterial DNA Kit 产品编号 D D D 可处理的菌液体积 50 ml 200 ml 1000 ml Buffer WLB 40 ml 160 ml 800 ml Buffer PPS 15 ml 50 ml 270 ml Lysozme 15 mg 60 mg 300 mg RNase Solution 160 µl 650 µl 3.5 ml Buffer TE 30 ml 120 ml 250 ml 说明书 SolPure Buccal Cell DNA Kit 产品编号 D D D 可处理的组织量 100 Preps 500 Preps 1000 Preps Buffer WLB 40 ml 200 ml 400 ml Buffer PPS 15 ml 70 ml 130 ml Glycogen Solution 60 µl 300 µl 600 µl RNase Solution 160 µl 800 µl 1.6 ml Buffer TE 10 ml 60 ml 120 ml 说明书第 4 页共 24 页

6 需要准备材料和工具 70% 乙醇异丙醇灭菌的 1.5ml 离心管, 或 15ml 离心管, 或 50ml 离心管 <15,000 x g 小型离心机, 或适合 15ml/50ml 离心管的离心机 (2,000 x g) 用灭菌水把 10 x Buffer RBC 稀释成 1 x Buffer RBC, 并于室温保存 Lysozyme 的配制 (100mg/ml): Lysozyme 以干粉提供, 使用前须加入适量的 Buffer TE 溶解, 使其终浓度为 50mg/ml 溶解后, 分装保存于 2-8 溶解 Proteinase K (20mg/ml): 加入 Proteinase Dissolve Buffer 溶解 Proteinase K 至终浓度为 20mg/ml Proteinase K 干粉在 2-8 保存一年, 但溶解的 Proteinase K 须分装保存于 -20 反复冻溶 Proteinase K 会影响其活性第 5 页共 24 页

7 方案 1. 血液和骨髓 DNA 提取 (D3311) 该方案适合于从 300µl, 3ml 或 10ml, 或其它体积的抗凝全血和骨髓样品中提取高分子量基因组 DNA, 按下表的比例加入各种试剂血液体积 300µl 400µl 500µl 1ml 2ml 3ml 10ml 1 x Buffer RBC 900µl 1.2ml 1.5ml 3ml 6ml 9ml 30ml Buffer WLB 300µl 400µl 500µl 1ml 2ml 3ml 10ml Buffer PPS 100µl 133µl 167µl 333µl 667µl 1ml 3.3ml 异丙醇 300µl 400µl 500µl 1ml 2ml 3ml 10ml 70% 乙醇 300µl 400µl 500µl 1ml 2 ml 3ml 10ml Buffer TE 100µl 100µl 100µl 200µl 200µl 250µl 1ml 裂解红细胞 1. 吸取 900µl 1 x Buffer RBC 至 1.5ml 离心管 ; 9ml 1 x Buffer RBC 至 15ml 离心管 ; 或 30ml 1 x Buffer RBC 至 50ml 离心管中注 :10 x Buffer RBC 使用前须用灭菌水稀释 10 倍 2. 加入 300µl 3ml 或 10ml 全血或骨髓样品至装有 1 x Buffer RBC 的离心管中, 颠倒次混匀 3. 室温放置 1 分钟 5 分钟或 5 分钟, 期间颠倒混匀 2-3 次注 : 处理 1 小时前采取的血样时, 需放置 3 分钟以上, 以确保红细胞充分裂解 4. 13,000 x g 离心 1 分钟, 2,000 xg 离心 5 分钟, 2,000 xg 离心 5 分钟 5. 倒弃或吸弃上清液, 剩余 ~30µl, ~200µl, 或 ~200µl 溶液和白细胞沉淀裂解白细胞 6. 剧烈涡旋让白细胞沉淀在残液中充分分散 7. 加入 µl, 3ml 3ml, 或 10ml Buffer WLB 至白细胞重悬液中立即用移液枪吸打或剧烈涡旋 30 秒裂解细胞若吸打或涡旋后有团状物,37 水浴 1-2 小时使之溶解第 6 页共 24 页

8 去除 RNA 污染 8. ( 可选 ) 若需去除 RNA, 加入 1.5µl, 15µl, 或 50µl RNase Solution 至裂解液中颠倒混匀,37ºC 温育分钟冰上放置 1 分钟, 3 分钟, 或 3 分钟冷却样品去除蛋白质 9. 加入 µl, 1ml 1ml, 或 3.33ml Buffer PPS, 最高速度涡旋混匀 30 秒 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟, 2,000 x g 离心 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 5 分钟注 : 离心后会形成紧密的蛋白沉淀若沉淀不紧密, 以最高速度涡旋混匀 30 秒, 冰上放置 5 分钟重复此步离心去除蛋白质沉淀 DNA 11. 吸取 300µl 异丙醇至 1.5ml 离心管中 ; 或 3ml 异丙醇至 15ml 离心管中 ; 或 10ml 异丙醇至 50ml 离心管中 12. 把第 10 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次或直至看到丝状或团状的 DNA 沉淀 ,000-16,000 x g 离心 3 分钟, 2,000 x g 离心 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 5 分钟 14. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液倒弃上清液时要注意 DNA 沉淀不要倒掉沉淀乙醇脱盐和干燥 15. 加入 300µl, 3ml, 或 10ml 70% 乙醇至 DNA 沉淀中颠倒或涡旋洗涤 DNA 沉淀 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟, 2,000 x g 离心 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 5 分钟 17. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液倒弃上清液时要注意第 7 页共 24 页

9 DNA 沉淀不要倒掉沉淀 18. 空气干燥 5 分钟, 5 分钟, 或 15 分钟溶解 DNA 19. 加入 µl, µl, 或 1ml Buffer TE 至 DNA 沉淀团中涡旋 5 秒 65 温育 30 分钟, 1 小时, 或 1 小时溶解 DNA 20. 室温或 2-8ºC 放置过夜使 DNA 充分溶解把 DNA 保存于 2-8ºC 或 -20ºC 第 8 页共 24 页

10 方案 2: 血液 DNA 快速抽提方案 (D3311) 该方案是专门为处理 10ml 血液样品 DNA 提取优化的方案, 它能更加高效快速地从血液样品提取 DNA 该方案也可以适当调节溶液用量来处理其它体积的血液样品 1. 吸取 30ml 1 x Buffer RBC 至 50ml 离心管中注 :10 x Buffer RBC 使用前须用灭菌水稀释 10 倍 2. 转移 10ml 血液样品至装有 RBC 的离心管中颠倒混匀 10 次, 室温静置 5 分钟, 其间颠倒混匀 2-3 次 3. 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀白细胞倒弃上清液, 反扣于吸水纸吸尽残液 ( 注意不要丢失白细胞沉淀 ) 4. 加入 3.33ml Buffer PPS 至白细胞沉淀中, 最高速度涡旋 30 秒重悬白细胞 5. 加入 10ml Buffer WLB 至样品中最高速度涡旋混匀 2 分钟 6. 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀去除蛋白质 7. 转移 10ml 异丙醇至 50ml 离心管中 8. 把第 6 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次或直至看到丝状或团状的 DNA 沉淀 9. 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀 DNA 10. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于干净的吸水纸吸干残留的溶液 11. 加入 10ml 70% 乙醇, 颠倒洗涤 DNA 沉淀 12. 2,000 x g 离心 5 分钟 13. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液空气干燥 10 分钟倒弃上清液时要注意 DNA 沉淀不要倒掉沉淀 14. 加入 1ml Buffer TE 至 DNA 沉淀中涡旋 5 秒 65 温育 1 小时溶解 DNA 15. 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 9 页共 24 页

11 方案 3: 旧血样品的 DNA 提取 (D3311) 血液在室温 (15-25 ) 超过 24 小时, 或 2-8 放置时间超过 5 天后, 血液样品中可能会出现溶血现象或会存在凝固的小块, 最好采用该方案进行操作, 以提高 DNA 的产量该方案也可以适当调整处理其它体积的血液样品 1. 吸取 30ml 1 x Buffer RBC 至 50ml 离心管中加入 10ml 全血样品至离心管中颠倒混匀 10 次室温静置 5 分钟, 期间颠倒混匀 2-3 次 2. 2,000 x g 离心 5 分钟小心吸弃上清液, 剩余 3.5ml 上清液和沉淀 3. 涡旋让沉淀在残液中充分重悬 4. 加入 10ml Buffer WLB 至重悬液中涡旋混匀 30 秒 37 水浴 2 小时或过夜, 以确保细胞的充分裂解 5. 加入 50µl RNase Solution, 颠倒混匀 10 次 37 水浴分钟 6. 冰上放置 5 分钟冷却样品 7. 加入 4.5ml Buffer PPS 至裂解液中最高速度涡旋 30 秒 8. 2,000 x g 离心 10 分钟 9. 吸取 13.5ml 异丙醇至 50ml 离心管 10. 小心把第 8 步的上清液倒入离心管中颠倒离心管次 2,000 x g 离心 10 分钟 11. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残留溶液 12. 加入 10ml 70% 乙醇至 DNA 沉淀团颠倒混匀 2,000 x g 离心 5 分钟 13. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残留溶液空气干燥 10 分钟 14. 加入 500µl Buffer TE 至 DNA 沉淀团中涡旋 5 秒温育 1 小时溶解 DNA, 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 10 页共 24 页

12 方案 4: 凝固血液 DNA 抽提 (D3311) 该方案适合于从 50µl 或 1ml 凝固的血液中提取 DNA 该方案需另外准备一管 Proteinase K(20mg/ml) 1. 转移 50µl 凝血样品和 550µl Buffer WLB 至 1.5ml 离心管中 ; 或转移 1ml 凝血样品和 11ml Buffer WLB 至 50ml 离心管中 2. 加入 3µl, 或 60 60µl Proteinase K (20mg/ml) 至样品中颠倒 15 次振荡水浴 3 小时至过夜, 或直至所有颗粒都完全消化 4. 加入 3µl 或 60µl RNase Solution 至样品中颠倒混匀,37 水浴 15 分钟 5. 冰上放置 3 分钟冷却裂解液 6. 加入 µl, 或 4ml Buffer PPS 至裂解液中最高速度涡旋 30 秒, 冰上放置 10 分钟 7. 13,000-16,000 x g 离 3 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟 8. 吸取 600µl 异丙醇和 1µl Glycogen(20mg/ml) 至 1.5 ml 离心管中 ; 或 12ml 异丙醇和 20µl Glycogen(20mg/ml) 至 50ml 离心管中 9. 把第 7 步的上清液转移至装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次室温静置 5 分钟 ,000-16,000 x g 离心 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟沉淀 DNA 11. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液 12. 加入 600µl 或 12ml 70% 乙醇至样品中颠倒混匀数次 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟, 或 2,000 x g 离心 5 分钟 14. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残留溶液空气干燥 10 分钟或 15 分钟 15. 加入 20µl 或 0.4ml Buffer TE 至 DNA 沉淀涡旋 5 秒 65 温育 30 分钟或 1 小时溶解 DNA 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 11 页共 24 页

13 方案 5: 血液黄层 DNA 提取 (D3311) 该方案适合于从血液黄层样品 (Buffy Coat) 中提取基因组 DNA 血液黄层 (Buffy Coat) 及其制备 1. 取抗凝血液至合适的离心管中室温下 (15-25 ),1100 x g 离心 10 分钟后, 形成明显的三层结构 : 澄清的上层液为血浆, 中间层就是血液黄层 (Buffy Coat), 含浓缩的淋巴细胞, 而最下层则为富集的红细胞血液黄层含有浓缩的淋巴细胞, 相同体积的血液黄层的 DNA 产量是血液的 5-10 倍转移倍的黄层样品至新的离心管中 ( 举例 :3ml 抗凝血液可获得 µl 的血液黄层 ) 2. 冻藏的血液黄层 (Buffy Coat) 样品须于 37 振荡水浴快速解冻解冻后放置于冰上等待使用红细胞的去除 3. 吸取 µl 血液黄层至 15ml 离心管中加入 3 倍体积 1 x Buffer RBC 至样品中颠倒混匀 5-10 次室温放置 10 分钟, 期间颠倒混匀 2-3 次注 : 试剂盒提供 10 x Buffer RBC, 使用前必须用灭菌水稀释 10 倍才能使用 4. 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀白细胞小心倒弃或吸弃上清液, 剩余 ~200µl 残液和细胞沉淀裂解和纯化 5. 剧烈涡旋 15 秒让白细胞在残液中充分重悬 6. 加入 3ml Buffer WLB 至细胞重悬液中立即用移液枪吸打几次或剧烈涡旋 30 秒若吸打或涡旋后还有细胞团块, 37 温育 2 小时使之消失 7. 加入 15µl RNASE Solution 至裂解液中颠倒 25 次混匀 37 温育分钟冰上放置 3 分钟冷却样品 8. 加入 1ml Buffer PPS 至裂解液中最高速度涡旋混匀 30 秒 9. 2,000 x g 离心 10 分钟沉淀蛋白质 10. 吸取 3ml 异丙醇至 15ml 离心管中第 12 页共 24 页

14 11. 小心把第 9 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次或直至可看到丝状或团状的 DNA 沉淀 12. 2,000 x g 离心 5 分钟 13. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸干残液 14. 加入 3ml 70% 乙醇至 DNA 沉淀中颠倒混匀数次 15. 2,000 x g 离心 5 分钟 16. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸吸尽残液空气干燥 10 分钟 17. 加入 250µl Buffer TE 至 DNA 沉淀中涡旋 5 秒 65 温育 1 小时溶解 DNA 18. 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 13 页共 24 页

15 方案 6. 动物组织 DNA 提取 (D3312) 该方案适合于从各种动物组织样品中提取高分子量基因组 DNA 根据下表调整试剂用量就可以处理不同用量的组织组织用量 10mg 20mg 30mg 50mg 100mg Buffer WLB 300µl 600µl 900µl 1.5ml 3ml Proteinase K 1.5µl 3µl 4.5µl 7.5µl 15µl RNase Solution 1.5µl 3µl 4.5µl 7.5µl 15µl Buffer PPS 100µl 200µl 300µl 500µl 1ml 异丙醇 300µl 600µl 900µl 1.5ml 3ml 70% 乙醇 300µl 600µl 900µl 1.5ml 3ml Buffer TE 100µl 200µl 300µl 500µl 1ml 1. 剪取 5-10mg, 或 mg 动物组织, 用液氮将样品研磨成粉末状把样品转移至 1.5ml 离心管或 15ml 离心管中注 : 除液氮研磨外, 其它匀浆方法, 如玻璃匀浆器匀浆, 一次研磨杵等都可以使用, 使用这些方法匀浆时, 将组织和 Buffer WLB 混合后, 再进行匀浆 2. 加入 µl 或 3ml Buffer WLB 至装有样品的离心管中颠倒混匀 3. 加入 µl 或 15 15µl Proteinase K 至裂解液中颠倒混匀,55 水浴 3 小时或直至组织样品完全消化 4. 加入 µl 或 15 15µl RNase Solution 至裂解液中颠倒混匀,37 水浴分钟 5. 冰上放置 3 分钟冷却样品 6. 加入 µl 或 1ml Buffer PPS 至裂解液中最高速度涡旋 30 秒冰上放置分钟 7. 13,000-16,000 x g 离 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟 8. 吸取 µl 异丙醇至 1.5ml 离心管 ; 或 3ml 异丙醇至 15 离心管中第 14 页共 24 页

16 9. 把第 7 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次或直至可看到丝状或团状的 DNA 沉淀注 : 若样品 DNA 产量低于 1µg, 加入 0.5µlGlycogen(20mg/ml) 至混合液中提取得率 ,000-16,000 xg 离心 3 分钟, 或 2,000 xg 离心 10 分钟 11. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸尽残液 12. 加入 µl 或 3ml 70% 乙醇至 DNA 沉淀中颠倒混匀数次 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟, 或 2,000 x g 离心 3 分钟 14. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸尽残液空气干燥 10 分钟或 15 分钟 15. 加入 µl 或 1ml Buffer TE 至 DNA 沉淀中涡旋 5 秒温育 1 小时溶解 DNA 17. 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 15 页共 24 页

17 方案 7: 体液 DNA 抽提 (D3312) 该方案适合于从 50µl 或 1ml 体液 ( 如唾液, 血清, 尿液, 全血, 奶汁 ) 中提取 DNA 1. 加入 550µl Buffer WLB 至 1.5ml 离心管中, 或加入 5ml Buffer WLB 至 15ml 离心管中 2. 转移 50 50µl 或 1ml 体液样品至装有裂解液的离心管中 3. 加入 1.5µl 或 15µl Proteinase K 至裂解液中混匀,55 水浴 1-3 小时 4. 加入 1.5µl 或 15µl RNase Solution 至裂解液中混匀,37 水浴 15 分钟 5. 冰上放置 3 分钟冷冻样品 6. 加入 200µl 或 2ml Buffer PPS 至裂解液中涡旋 30 秒, 冰上放置 5 分钟 7. 13,000-16,000 x g 离 3 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟 8. 吸取 600µl 异丙醇和 0.5µl Glycogen 至 1.5ml 离心管 ; 或 6ml 异丙醇和 10µl Glycogen 至 15ml 离心管中 9. 把第 7 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次室温静置 5 分钟 ,000-16,000 x g 离心 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟 11. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于干净的吸水纸吸干残留的溶液 12. 加入 600µl 或 6ml 70% 乙醇至 DNA 沉淀中颠倒混匀几次 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟, 或 2,000 x g 离心 3 分钟 14. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液空气干燥 10 分钟, 或 15 分钟倒弃上清液时要注意 DNA 沉淀不要倒掉沉淀 15. 加入 20 µl, 或 0.1ml Buffer TE(10Mm Tris, ph8.0), 涡旋 5 秒 65 温育 30 分钟, 或 1 小时溶解 DNA 16. 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 16 页共 24 页

18 方案 8: 培养细胞 DNA 提取 (D3313) 该方案适合于从 1-2 x 10 6, 或 1-2 x 10 7 个培养细胞中提取高分子量基因组 DNA 1. 收集细胞 a). b). 悬浮培养细胞 : 计算细胞数量, 按第 2 步进行操作贴壁培养细胞 : 计算细胞数量, 采用胰酶消化或用细胞刮收集细胞胰酶处理 : 吸弃培养液, 用 PBS 洗涤细胞, 然后加入含 % 胰酶 (trypsin) 的 PBS 当细胞完全脱落后, 按第 2 步进行操作 ; 细胞刮 : 用细胞刮把细胞从培养瓶或培养皿刮下, 然后按第 2 步进行操作 ; 2. 转移含 1-2 x 10 6 或 1-2 x10 7 个细胞培养液或胰酶消化液至 1.5ml 离心管或 15ml 离心管中 3. 13,000-16,000 x g 离心 5 秒, 或 500 x g 离心 5 分钟收集细胞 4. 小心吸弃或倒弃培养液, 剩余 ~20µl 或 ~200µl 液体和细胞 5. 剧烈涡旋或用移液枪吸打, 使细胞在残液中充分重悬分散 6. 加入 µl 或 3ml Buffer WLB 至重悬细胞中最高速度涡旋 20 秒或用移液枪吸打混匀 5-10 次 7. 加入 1.5µl 或 15µl RNase Solution 至裂解液中混匀,37 水浴 30 分钟 8. 冰上放置 3 分钟冷却样品 9. 加入 µl 或 1ml Buffer PPS 至裂解液中最高速度涡旋 30 秒 ,000-16,000 x g 离 5 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟 11. 吸取 µl 异丙醇至 1.5ml 离心管 ; 或 3ml 异丙醇至 15 离心管中 12. 把第 10 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次或直至可看到丝状或团状的 DNA 沉淀 ,000-16,000 x g 离心 3 分钟, 或 2,000 x g 离心 10 分钟 14. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸尽残液第 17 页共 24 页

19 15. 加入 µl 或 3ml 70% 乙醇至 DNA 沉淀中颠倒混匀数次 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟, 或 2,000 x g 离心 3 分钟 17. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸尽残液空气干燥 10 分钟或 15 分钟 18. 加入 µl 或 1ml Buffer TE 至 DNA 沉淀中涡旋 5 秒温育 1 小时溶解 DNA 20. 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 18 页共 24 页

20 方案 9: 细菌 DNA 提取 (D3314) 该方案适合于从 <1.5 x 10 9 细菌中提取 DNA 更多数量的细菌也可以使用, 只需相应地扩大各种试剂的用量即可 1. 样品的裂解 A. 革兰氏阴性细菌的裂解 A1. 转移 0.5ml 细菌培养液 (<1.5 x 10 9 个细菌 ) 至 1.5ml 离心管中 ; A2. 13,000-16,000 x g 离心 30 秒收集细菌 ; 小心倒弃上清液 ; A3. 加入 300µl Buffer WLB, 涡旋或吸打重悬细菌 ; A4. 80 水浴 10 分钟裂解细菌 ; A5. 其余按第 2 步进行操作 B. 革兰氏阳性或阴性细菌的裂解 B1. 转移 0.5ml 细菌培养液 (<1.5 x 10 9 个细菌 ) 至 1.5ml 离心管中 ; B2. 13,000-16,000 x g 离心 30 秒收集细菌 ; 小心倒弃上清液 ; B3. 加入 100µl Buffer TE 和 10µl Lysozyme 涡旋重悬细菌,37 水浴 30 分钟消化细胞壁 ; B4. 13,000-16,000 x g 离心 1 分钟收集细菌原生质体 ; 小心倒弃上清液 ; B5. 加入 300µl Buffer WLB, 涡旋重悬细菌 ; B 水浴 10 分钟裂解细菌 ; B7. 其余按第 2 步进行操作 2. 加入 1.5µl RNase Solution 至裂解液中混匀,37 水浴分钟 ; 3. 冰上放置 3 分钟冷冻样品 ; 4. 加入 100µl Buffer PPS 至裂解液中最高速度涡旋 30 秒第 19 页共 24 页

21 5. 13,000-16,000 x g 离 3 分钟 6. 吸取 300µl 异丙醇至新的 1.5 ml 离心管中 7. 把第 5 步获得的上清液倒入装有异丙醇的离心管中颠倒离心管次 8. 13,000-16,000 x g 离心 3 分钟小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液倒弃上清液时要注意 DNA 沉淀不要倒掉沉淀 9. 加入 300µl 70% 乙醇至 DNA 沉淀中颠倒数次洗涤 DNA 沉淀 ,000-16,000 x g 离心 1 分钟 11. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于吸水纸吸干残留的溶液, 空气干燥 10 分钟 12. 加入 50µl Buffer TE 至 DNA 沉淀中涡旋 5 秒,65 温育 1 小时溶解 DNA 13. 室温轻轻振荡过夜充分溶液 DNA 第 20 页共 24 页

22 方案 10. 拭子 DNA 提取 (D3315) 该方案适合于从 1 个口腔拭子中提取 DNA 1. 收集口腔细胞 : 用拭子在口腔内来回刮 10 次 ;( 取样前 1 小时内最好不要吃喝 ) 2. 加入 300µl Buffer WLB 至 1.5ml 离心管中用剪刀或镊子把拭子的头部转移至离心管中 3. 选择一种方法来裂解样品 ; a). 65 水浴分钟 ; b). 若需获得最高产量 : 加入 1.5µl Proteinase K 至裂解液中颠倒混匀,55 水浴 1 小时 4. 加入 1.5µl RNase Solution 至裂解液中颠倒混匀,37 水浴分钟 5. 冰上放置 3 分钟 ; 取出拭子, 并在离心管边缘挤压以尽量回收溶液, 去除拭子 6. 加入 100µl Buffer PPS 至裂解液中高速涡旋 20 秒, 冰上放置 5 分钟 7. 13,000-16,000 x g 离 3 分钟 8. 吸取 300µl 异丙醇和 0.5µl 糖原 (Glycogen) 至新的 1.5ml 离心管中, 把第 7 步获得的上清液倒入离心管中 9. 颠倒离心管次室温静置 5 分钟 13,000-16,000 x g 离心 5 分钟 10. 小心倒弃上清液, 并把离心管反扣于干净的吸水纸吸干残留的溶液倒弃上清液时要注意 DNA 沉淀不要倒掉沉淀 11. 加入 300µl 70% 乙醇至沉淀中混匀,13,000-16,000 x g 离心 3 分钟 12. 小心倒弃上清液, 把离心管反扣于吸水纸上空气干燥 5 分钟 13. 加入 20µl Buffer TE 至 DNA 沉淀中涡旋 5 秒温育分钟溶解 DNA 第 21 页共 24 页

23 常见问题回答该列表可能有利于解决提取过程所碰到的问题 Magen 的技术人员也可以随时为您提供服务, 若您对试剂盒存在问题或建议, 或您在分子生物学碰到问题, 都请您联系我们我们将竭尽所能为您排扰难解现象原因及解决方法产量低或纯度低加入 Buffer WLB 之前, 必须涡旋让细胞沉淀团在残液中充分细胞没有充分裂解重悬加入 Buffer WLB 后, 吸打或涡旋后, 细胞沉淀团还没有消失, 用移液枪吸打次或在 37oC 水浴分钟至沉淀团消失加入异丙醇后混匀不充分 DNA 沉淀丢失蛋白质沉淀不完全蛋白质沉淀被吸出 DNA 溶解不充分加入异丙醇后, 须颠倒混匀次, 或直至看到丝状的沉淀在倒弃上清液时,DNA 沉淀团被倒掉加入 PPS Solution 后, 必须高速涡旋 20 秒, 让蛋白质充分沉淀蛋白质沉淀不紧密, 重复涡旋 20 秒, 冰上放置 5 分钟, 再离心去除蛋白质沉淀室温或 2-8oC 过夜让 DNA 充分溶解, 其间偶尔颠倒混匀加速 DNA 的溶解第 22 页共 24 页

24 Note: 第 23 页共 24 页

25 Note: 第 24 页共 24 页

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封底

广州美基生物科技有限公司 Tel: +86 20 22927158 Support:13430287051 magenbio@aliyun.com www.magentec.com.cn HiPure Blood DNA Kits 血液等液体样品 DNA提取试剂盒从血液等液体样品中提取 DNA 目录简介 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -