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1 AxyPrep 基因组 DNA 小量试剂盒本试剂盒采用独特的裂解和蛋白酶 K 消化技术, 结合 DNA 制备膜选择性地吸附 DNA 的方法达到纯化基因组 DNA 的目的每次制备可获得多至 20 µg 的基因组 DNA 用于 PCR Southern 印迹分析 RAPD RFLD 等分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-GDNA-4 AP-MN- MS-GDNA-50 制备次数 4 preps 50 preps Miniprep column ml 离心管 ml 离心管 4 50 RNase A 10 µl 60 µl Buffer C L 1 ml 9 ml Proteinase K 1.2 mg 18 mg PK Buffer 90 µl 1.2 ml Buffer P D 2 ml 25 ml Buffer W1 3 ml 30 ml Buffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml Eluent 1 ml 12 ml 说明书 1 1 Miniprep column: 小量制备管室温密闭贮存 RNase A: 50 mg/ml, 室温保存 Buffer C-L: 裂解液, 室温密闭贮存 Proteinase K: 冻干的蛋白酶 K 可室温贮存 6 个月, 长时间保存请置于 4 ; 溶解后, 在 2-8 可贮存 2 个月, 长时间保存请勿置于室温中 Buffer PK: 蛋白酶 K 溶解液, 室温密闭贮存 Buffer P-D: 蛋白去除液, 室温密闭贮存 Buffer W1: 洗涤液, 室温密闭贮存 Buffer W2 concentrate: 去盐液使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇, 混合均匀, 室温密闭贮存可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 Eluent:2.5 mm Tris-HCl,pH 8.5, 室温密闭贮存二注意事项 Buffer C-L Buffer P-D 和 Buffer W1 含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻若沾染皮肤眼睛时, 要立即用大量水冲洗, 必要时寻求医疗咨询 Page 1

2 三实验准备 1. 第一次使用时, 在 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀 2. 根据瓶上标签将蛋白酶 K 溶解于 Buffer PK 中, 请勿旋涡振荡 3. 准备 56 水浴 4. 使用前检查 Buffer C-L 是否有沉淀析出, 若出现沉淀, 请于 37 水浴加热至沉淀完全溶解后再使用 5. 将 Eluent 或去离子水加热至 65 有利于基因组 DNA 的充分洗脱四操作步骤步骤 1-5 请根据不同的样品选择相应的操作, 匀浆裂解和除蛋白质及其它杂质从动物组织中提取基因组 DNA 1. 取 1-20 mg 动物或人组织, 移入冰水浴预冷的研钵中, 快速用力研磨成匀浆 * 下列组织请加液氮研磨至粉末状后, 将研钵置于 56 水浴, 当粉末开始融化时继续研磨 1 min, 匀浆后加入 350μl PBS 和 0.9 µl RNase A, 再进入步骤 3 的操作下 A. 富含 DNA 酶的胰脏, 脾脏, 胸腺, 淋巴等组织 B. 富含胶原蛋白的皮肤肌健等组织 C. 富含角质蛋白的组织或坚硬的组织如骨骼等 2. 加入 350 µl Buffer PBS 和 0.9 µl RNase A 后温和地研磨 30 s 3. 收集 350 µl 研磨好的组织匀浆并转入 2 ml 离心管如匀浆体积不足 350 µl, 补充 PBS 至 350 µl 4. 加入 150 µl Buffer C-L 和 20 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min 从植物组织中提取基因组 DNA 1. 按下表称取适量的新鲜植物组织 ( 如选用的是冷冻干燥的组织, 则组织用量减半 ) 剪成小块放入研钵中 ; 加入液氮, 使组织冷冻完全后, 快速用力研磨至粉末状研磨时应间断加入液氮以防止组织融化, 研磨充分后将研钵放入 56 水浴至样品粉末刚开始融化 * 表 1 新鲜植物样品使用量按下表收集植物花或叶片植物茎植物根植物种子 mg * 样品研磨应充分, 否则严重影响基因组 DNA 的得率 * 如从培养的植物细胞中提取基因组 DNA, 收集培养的植物细胞,10,000 g 离心 1 min, 加入 Page 2

3 150 µl PBS 充分悬浮细胞并转入研钵中, 加入液氮, 使组织冷冻完全后, 快速用力研磨至粉末状研磨时应间断加入液氮以防止组织融化, 研磨充分后将研钵放入 56 水浴至样品粉末刚开始融化 2. 加入 350 µl PBS 和 0.9 µl RNase A 贮存液, 用力碾磨 30 s * 如新鲜植物叶超过 120 mg 或干植物叶超过 60 mg, 加入 700 µl PBS 按照步骤 2 完全操作后, 将匀浆样品分到两个 2 ml 离心管中, 然后按照步骤 4-5 平行操作两管, 第 6 步和接下来的步骤合并到一管操作, 以提高洗脱的 DNA 的浓度 3. 转移 350 µl 研磨好的匀浆至 2 ml 离心管中, 如匀浆体积不足 350 µl, 补充 PBS 至 350 µl 4. 加入 150µl Buffer C-L 和 20 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min * 富含纤维的根 / 茎等组织或富含淀粉蛋白质的种子等样品, 可延长水浴时间至 30 min 从培养细胞淋巴细胞骨髓干血和骨头中提取基因组 DNA 根据培养细胞的类型来操作, 若从植物细胞中提取基因组 DNA, 请按步骤 ( 从植物组织中提取基因组 DNA) 来匀浆 A. 悬浮培养的动物细胞或新鲜分离的动物组织单细胞悬液 1A. 用 2 ml 离心管收集细胞悬浮液,2,000 g 离心 5 min, 弃尽上清 2A. 加入 350 µl 去离子水或 PBS 悬浮细胞 B. 单个细胞培养或 96 孔板 24 孔板 12 孔板和 6 孔板细胞培养 1B. 尽可能的丢掉上清液, 加 350µl PBS 到每孔中, 室温静置 1 min 2B. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 C. 淋巴细胞 1C. 加 350µl PBS 到每孔中, 室温静置 1 min 2C. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 D. 骨髓 1D. 切除骨头的两端, 用针头吸 350µl PBS 从骨头一端冲出骨髓 2D. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 E. 干血 1E. 加 350µl PBS 到每孔中, 室温静置 1 min 2E. 用吸头来回吸注几次, 至干血完全溶解, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 Page 3

4 F. 骨头 1F. 取 mg 骨头, 移入冰水浴预冷的研钵中, 快速用力研磨成匀浆 ; 加入 350 µl PBS, 用力碾磨 30 s 2F. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 3. 加入 0.8 µl RNase A, 漩涡振荡 15s, 室温静置 1min 4. 加入 150µl Buffer C-L 和 8 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min 从酵母中提取基因组 DNA 1. 收集酵母细胞,10,000 g 离心 1min 用 350 µl PBS 悬浮酵母细胞并转移至研钵中, 加入液氮, 待样品被完全冷冻后, 快速用力研磨至粉末状将研钵放入 56 水浴至样品粉末刚开始融化时进入下一步操作 * 当 OD600 为 1 时, 酵母浓度为细胞 /ml * 酵母细胞壁较为坚韧, 应适当延长研磨时间和研磨次数以确保充分破碎酵母细胞壁 * 研磨时应及时加入液氮, 防止样品在研磨时融化 2. 加入 1.2 µl RNase A 贮存液, 快速用力碾磨 30 s 3. 转移 350µl 研磨好的匀浆至 2 ml 离心管中, 如匀浆体积不足 350µl, 补充 PBS 至 4. 加入 150µl Buffer C-L 和 20 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min 步骤 6-10, 可选择负压法或离心法 A. 负压法 6A. 将 DNA 制备管插到负压装置的插口上, 将步骤 5 的离心后的上清液移到制备管中, 开启并调节负压装置至英寸汞柱 7A. 保持负压, 加入 500µl Buffer W1, 吸尽管中液体 8A. 保持负压, 加入 700µl 已加入乙醇的 Buffer W2, 吸尽管中液体 ; 以同样的方法再用 700µl Buffer W2 洗涤一次 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇 * 沿管壁加入 Buffer W2 有助于彻底冲洗附在管壁上的盐分 * 两次用 Buffer W2 冲洗能确保盐分被完全消除, 消除对酶切反应的影响 9A. 将 DNA 制备管放回 2 ml 离心管中,12,000 g 离心 1 min Page 4

5 B. 离心法 6B. 将 DNA 制备管置于 2 ml 离心管中, 将步骤 5 中的混合液移至制备管中,12,000 g 离心 1 min 7B. 弃滤液, 将制备管置回到原来的 2 ml 离心管中, 加入 500µl Buffer W1,12,000 g 离心 1 min 8B. 弃滤液, 将制备管置回到原来的 2 ml 离心管中, 加入 700µl Buffer W2,12,000 g 离心 1 min, 以同样的方法, 用 700µl Buffer W2 再洗涤一次 * 确认 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 * 再次用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除, 消除对酶切反应的影响 9B. 弃滤液, 将制备管置回原来的 2 ml 离心管中,12,000 g 离心 1 min 10. 将 DNA 制备管置于另一洁净的 1.5 ml 离心管中, 在制备管膜中央加 µl Eluent 或去离子水, 室温静置 1 min,12,000 g 离心 1min 洗脱 DNA * 将去离子水或 Eluent 加热至 65 将提高洗脱效率五流程图加入 350 μl PBS 按说明书要求加入 RNase A 加入 150 μl Buffer C-L 按说明书要求加入 Proteinase K 56 C 水浴 10 min 裂解加入 350 μl Buffer P-D 中和加入 500 μl Buffer W1 加入 700 μl Buffer W2 加入 700 μl Buffer W2 结合洗涤加入 μl Eluent 或去离子水洗脱 Page 5

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<4D F736F F D20D7DC524E41D0A1C1BFD6C6B1B8CAD4BCC1BAD02E646F63> AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-RNA-4