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衫连
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1 Code No 研究用 Fruit-mate for RNA Purification 说明书 v201606da

2 目录内容页码制品说明 1 制品内容 1 试剂盒外必备材料 1 保存 1 RNA 提取实验前的准备 2 实验操作 2 Troubleshooting 7 参考文献 8 关联产品 8

3 制品说明本制品作为使用 RNAiso Plus 或 NucleoSpin RNA Plant 进行 RNA 提取的辅助试剂, 可以高效地从植物材料 ( 如块根作物水果和种子等 ) 中提取高纯度的 Total RNA 由于本制品中含有高分子聚合物, 能够有效地与组织样品中的多糖多酚结合, 并可以在之后的离心步骤中除去因此, 当单纯使用 RNA 提取试剂盒很难提取植物 RNA 时, 可使用本制品进行高效提取与 RNAiso Plus 结合使用时, 将本制品加入样品之中并混合均匀, 然后离心除去不溶物向上清液中加入等体积的 RNAiso Plus, 再加入氯仿并混合均匀离心后溶液分为三层, 取最上层进行异丙醇沉淀回收 total RNA 所有 total RNA 提取过程在 1 小时之内完成与 NucleoSpin RNA Plant 结合使用时, 将本制品加入样品之中并混合均匀, 然后离心除去不溶物向上清液中加入 RA1( 或者 RAP), 充分混合后使用 NucleoSpin Fliter 除去不溶物向 flow-through 内加入 70% 乙醇调制成 lysate, 利用附有 silica membrane 的 cartridge 离心回收 total RNA 全部操作只需要 30 分钟得到的 total RNA 可用于 RT-PCR Northern blot 分析或 mrna 的纯化注 1. 以下植物 ( 部分组织 ) 使用本制品提取 RNA, 回收效率得到了提高 < 本制品对如下植物 ( 部分组织 )RNA 的提取有效果 > 樱桃番茄 ( 果实 ), 香蕉 ( 果肉 ), 草莓 ( 果实 ), 番茄 ( 种子 ), 水稻 ( 种子 ), 马铃薯 ( 根茎 ), 橘子 ( 果皮 ), 菠萝 ( 叶片 ), 芦荟 ( 叶片 ), 芒果 ( 果实 ), 拟南芥 ( 种子 ), 菊 ( 叶片 ), 蔷薇 ( 叶片 ) 本制品适用于多糖多酚含量较高的植物由于植物种类的不同, 使用本制品也可能出现没有改善效果或 total RNA 回收效率降低的情况, 因此, 在对上述植物以外的植物进行实验时需要尝试 2. RNAiso Plus 是一种基于 AGPC 方法提取 RNA 的产品制品内容 Fruit-mate for RNA purification 100 ml 试剂盒外必备材料与 RNAiso Plus 组合使用时 RNAiso Plus(Code No. 9108/9109) 氯仿异丙醇 75% 乙醇 RNase-free 水或 TE 与 NucleoSpin RNA Plant 组合使用时 NucleoSpin RNA Plant(Code No /.50/.250) 1 M 或者 2 M DTT 溶液特级乙醇 (>99%) 70% 乙醇 RNase-free tube 保存室温保存 * 自收到之日起, 适当条件下保存, 两年内有效开封后请尽快使用, 尽量避免污染 * 20 以下保存可能会出现沉淀, 使用前请于 37 溶解沉淀 -1-

4 RNA 提取实验前的准备 1. 实验应使用无菌的 RNase-free 的一次性塑料制品, 任何非 RNase-free 的塑料用具在使用前都要进行高压灭菌若使用玻璃器皿, 需要 160 干热灭菌至少 2 小时如不能进行干热灭菌, 则使用 0.1% DEPC( 焦碳酸二乙酯 ) 水溶液在 37 下处理 12 小时, 然后再灭菌使用 2. RNA 实验用的器具建议专门使用, 不要用于其它实验 3. 试剂尽可能使用 0.1% DEPC( 焦碳酸二乙酯 ) 处理, 灭菌后使用如果有些试剂不能进行高压灭菌, 则使用无菌水和无菌器皿进行溶液配制, 使用前过滤除菌 4. 样品的制备过程中应使用的防御措施 : 戴一次性干净手套, 在操作过程中避免讲话等等通过以上办法可以防止实验者的汗液唾液中的 RNA 分解酶的污染实验操作关于样品使用本制品可使多糖多酚含量较高的根茎以及果肉组织 ( 果肉果皮和种子 ) 的 RNA 提取效果得到提升, 植物种类如下所示, 未列出的植物使用本制品可能没有改善效果或 RNA 的回收效率较低 < 本制品对如下植物 ( 部分组织 )RNA 的提取有效果 > 樱桃番茄 ( 果实 ), 香蕉 ( 果肉 ), 草莓 ( 果实 ), 番茄 ( 种子 ), 水稻 ( 种子 ), 马铃薯 ( 根茎 ), 橘子 ( 果皮 ), 菠萝 ( 叶片 ), 芦荟 ( 叶片 ), 芒果 ( 果实 ), 拟南芥 ( 种子 ), 菊 ( 叶片 ), 蔷薇 ( 叶片 ) 如果使用多糖多酚含量较低的芽及嫩叶作为提取材料时, 使用本制品可能会降低收率, 因此建议单独使用 RNAiso Plus 或 NucleoSpin RNA Plant 关于 RNA 提取试剂本制品应与 RNAiso Plus ( Code No. 9108/9109 ) 或 NucleoSpin RNA Plant ( Code No /.50/.250) 组合使用与其它提取试剂的组合使用未经验证过方法 1( 使用 RNAiso Plus) [ 注 ] RNAiso Plus 是基于 AGPC 法进行 RNA 提取的制品 1. 取足量 100 mg 的植物组织于研钵中, 迅速转移至用液氮预冷的研钵中, 用研杵研磨组织, 其间不断加入液氮, 直至研磨成粉末状 2. 取 100 mg 粉末加入到 1.5 ml 液氮预冷的 RNase-free tube 中加入 1 ml 的本制品, 混匀后立即以 12,000 g,4 离心 5 分钟将上清液等体积分装于两个新的 1.5 ml tube 中 3. 分别向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入 0.5 ml 的 RNAiso Plus( 等体积 ), 盖紧离心管盖, 用力振荡, 待溶液充分乳化后 ( 无分相现象 ), 室温静置 5 分钟 4. 分别向上述每个 tube 中加入 200 μl 的氯仿, 盖紧离心管盖, 反复颠倒 tube 混合, 待溶液充分乳化 ( 无分相现象 ) 后, 再室温静置 5 分钟 12,000 g 4 离心 15 分钟从离心机中小心取出离心管, 此时匀浆液分为三层, 即 : 无色的上清液中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相 5. 吸取上清液转移至另一新的离心管中 ( 切忌吸出白色中间层 ) 6. 向上清中加入与上清等体积的异丙醇, 上下颠倒离心管充分混匀后, 在室温静置 10 分钟 12,000 g 4 离心 10 分钟一般在离心后,RNA 会沉淀在管底 7. 小心弃去上清, 缓慢地沿离心管壁加入 75% 的乙醇 1 ml( 切勿触及沉淀 ), 轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,7,500 g 4 离心 5 分钟 8. 小心弃去乙醇收集沉淀 9. 室温干燥沉淀, 加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀 [ 注 ]RNA 较难溶解, 因此请不要使用离心或加热的方法干燥 RNA -2-

5 使用 RNAiso Plus 的实验例 1 的结果 M M M:λ-EcoT14 I digest 1: 樱桃番茄 ( 果实 ) 2: 香蕉 ( 果肉 ) 3: 番茄 ( 种子 ) 4: 水稻 ( 种子 ) 5: 马铃薯 ( 根茎 ) 6: 橘子 ( 果皮 ) +:Fruit-mate 处理 -: 未经 Fruit-mate 处理图 1. 使用 RNAiso Plus 提取 total RNA 在 Fruit-mate 处理后 (+) 和未处理 (-) 的电泳图片流程图 1( 方法 1: 使用 RNAiso Plus) 100 mg 的植物组织, 液氮研磨加入 1 ml 的 Fruit-mate 混匀 12,000 g 4 离心 5 分钟小心吸取上清液, 平均分至 2 个新的 1.5 ml 离心管中 (RNase-free) 分别加入等体积的 RNAiso Plus, 各约 500 μl 混匀, 室温静置 5 分钟分别加入 200 μl 的氯仿上下颠倒 tube 混匀数次, 室温静置 5 分钟 12,000 g 4 离心 15 分钟将上清液转移至新的离心管中加入与上清液等体积的异丙醇室温静置 10 分钟 12,000 g 4 离心 10 分钟向沉淀中加入 1 ml 的 75% 乙醇清洗沉淀 7,500 g 4 离心 5 分钟弃上清保留沉淀干燥溶解于适量的 RNase-free 水中 -3-

6 方法 2( 使用 NucleoSpin RNA Plant) 1. 取足量 100 mg 的植物组织于研钵中, 迅速转移至用液氮预冷的研钵中, 用研杵研磨组织, 其间不断加入液氮, 直至研磨成粉末状 2. 取 50 mg 粉末加入到 1.5 ml 液氮预冷的 RNase-free tube 中加入 0.5 ml 的本制品, 混匀 3. 以 12,000 g,4 离心 5 分钟将上清液每 100 μl 体积分装于新的 1.5 ml tube 中 4. 分别向上述步骤 3 的 100 μl 上清液中加入 0.35 ml 的 RA1(+DTT) 或者 RAP(+DTT), 涡旋混匀 5. 上述步骤 4 的溶液加入到含有 NucleoSpin Filter(violet ring) 的 2 ml tube 中,11,000 g 室温离心 1 分钟 6. 废弃 NucleoSpin filter 向 flow-through 内加入 350 μl 70% 乙醇, 充分混匀混合液加入 NucleoSpin RNA Plant Column(light blue ring),11,000 g 室温离心 30 秒 7. NucleoSpin RNA Plant Column(light blue ring) 转移至 2 ml tube 中向 Column 中加入 350 μl MDB(Membrane Desalting Buffer),11,000 g 室温离心 1 分钟除去 flow-through 8. 加入 95 μl DNase 调制液至 NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 的中央室温 (20~25 ) 反应 15 分钟 9. 加入 200 μl RA2,11,000 g 室温离心 30 秒 10. NucleoSpin RNA Plant Column(light blue ring) 转移至新的 2 ml tube 中加入 700 μl RA3*, 11,000 g 室温离心 30 秒 * 建议添加 700 μl RA3 NucleoSpin RNA Plant Column 说明书中添加量是 600 μl 11. 除去 flow-through 加入 250 μl RA3,11,000 g 室温离心 2 分钟 12. NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 转移至新 1.5 ml tube 中加入 60 μl RNase-free H2O,11,000 g 室温离心 1 分钟 13. RNA 回收完成, 如不立即使用, 应于 -20 或 -80 保存 -4-

7 流程图 2( 方法 2: 使用 NucleoSpin RNA Plant) 50 mg 的植物组织, 液氮研磨加入 0.5 ml Fruit-mate 混匀 12,000 g 4 离心 5 分钟小心吸取上清液, 每 100 μl 分至 1 个新的 1.5 ml 离心管中 (RNase-free) 加入 0.35 ml 的 RA1(+DTT) 或者 RAP(+DTT), 涡旋混匀, 加入含有 NucleoSpin Filter (violet ring) 的 2 ml tube 中,11,000 g 室温离心 1 分钟弃 NucleoSpin filter 加入 350 μl 的 70% 乙醇并涡旋混匀混合液加入 NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 11,000 g 室温离心 30 秒 NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 转移至新的 2 ml tube 中除去 flow-through 向 column 加入 350 μl MDB 11,000 g 室温离心 1 分钟室温 (20~25 ) 反应 15 分钟除去 flow-through 加入 200 μl RA2 11,000 g 室温离心 30 秒 NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 转移至新的 1.5 ml tube 中收集 total RNA 加入 95 μl DNase 调制液至 NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 的中央 NucleoSpin RNA Plant Column (light blue ring) 转移至新的 2 ml tube 中加入 700 μl RA3 11,000 g 室温离心 30 秒加入 250 μl RA3 11,000 g 室温离心 2 分钟加入 60 μl 的 RNase-free H2O 11,000 g 室温离心 1 分钟 -5-

8 使用 NucleoSpin RNA Plant 的实验例 2 的结果从以下植物组织中, 按照方法 2 使用 RA1 进行 total RNA 提取并进行 Fruit-mate 处理有无进行提取效果比较 Total RNA 提取的各植物组织起始量相同 M M: 1 kb Ladder 1: 香蕉 ( 果肉 ) 2: 樱桃番茄 ( 果实 ) 3: 山毛榉丛生口蘑 ( 伞 + 柄 )* +:Fruit-mate 处理 RA1 添加 -: 未经 Fruit-mate 处理 RA1 添加 * 山毛榉丛生口蘑 ( 伞 + 柄 ) 使用 Fruit-mate 处理的效果不好图 2. 使用 NucleoSpin RNA Plant 提取 total RNA 在 Fruit-mate 处理后 (+) 和未处理 (-) 的电泳图片使用 NucleoSpin RNA Plant 的实验例 3 的结果从以下植物组织中, 按照方法 2 使用 RA1 或者 RAP 进行 total RNA 提取并进行 Fruit-mate 处理有无进行提取效果比较 Total RNA 提取的各植物组织起始量相同 M + RA1 RAP + RA1 RAP + RA1 RAP M: 1 kb Ladder 1: 马铃薯 ( 根茎 ) 2: 菊 ( 叶片 ) 3: 蔷薇 ( 叶片 ) +:Fruit-mate 处理 RA1 添加 RA1: 未经 Fruit-mate 处理 RA1 添加 RAP: 未经 Fruit-mate 处理 RAP 添加图 3. 使用 RA1 或者 RAP 提取 total RNA 在 Fruit-mate 处理后 (+) 和未处理 (-) 的电泳图片 -6-

9 Troubleshooting 1. 提取的 RNA 量较低样品匀浆不完全研磨样品直至成为粉末状组织中 RNA 量较低在一些植物组织中 RNA 含量较低, 据报道, 植物的根部比其他组织中的 RNA 含量低, 成熟叶片比嫩叶中含量低, 一般情况下植物组织中所能提取的 RNA 量如下表 : 组织材料起始样品量 Total RNA 提取量 Total RNA 提取量 (RNAiso Plus) (NucleoSpin RNA Plant) 樱桃番茄果实 50 mg μg 3-4 μg 香蕉果肉 50 mg μg 3-4 μg 番茄种子 50 mg μg - 水稻 50 mg 5-10 μg - 马铃薯 50 mg 5-10 μg μg 橘子果皮 50 mg 5 μg - 菊 50 mg - 50 μg 蔷薇 50 mg - 50 μg -: 没有检测样品中多糖或多酚的含量较低本制品是适用于提取多糖和多酚含量较高的植物组织 RNA 的辅助试剂参考实验操作的关于样品部分提到的本制品在相关植物中的效果如果单独使用 RNAiso Plus 或 NucleoSpin RNA Plant 能高效提取 RNA, 则添加本制品会降低回收效率其他参见 RNAiso Plus 和 NucleoSpin RNA Plant 说明书中的 troubleshooting 2. 提取的 RNA 纯度较低 Fruit-mate 和 RNAiso Plus 或 NucleoSpin RNA Plant 试剂添加量低于组织样品的量, 可能导致蛋白变性不充分在 RNA 提取过程中使用 75% 乙醇洗涤之后干燥过度,RNA 没有完全溶解因此不要加热干燥或过度干燥 RNA 如果干燥过度, 可在 60 加热 5 分钟, 然后冰上放置数小时,RNA 可能会溶解参见 RNAiso Plus 和 NucleoSpin RNA Plant 说明书中的 troubleshooting 3. 提取的 RNA 降解使用的组织材料不够新鲜提取 RNA 的组织材料应采用新鲜的组织材料, 或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于 -80 保存提取 RNA 时使用的试剂及器材中混有 RNA 分解酶参见 RNAiso Plus 和 NucleoSpin RNA Plant 说明书中的 troubleshooting 4. 提取的 RNA 中含有 DNA 污染裂解组织或细胞使用的 RNAiso Plus 量偏少, 应按建议体积量添加使用的组织材料中含有大量的有机溶剂 ( 如 : 乙醇异丙醇等 ) 高浓度的 Buffer 碱性溶剂等如果提取的 RNA 中含有 DNA 时, 建议使用 Recombinant DNase I (RNase-free) (Code No. 2270A/B) 进行 DNA 消化参见 RNAiso Plus 和 NucleoSpin RNA Plant 说明书中的 troubleshooting -7-

10 参考文献 1. Chirgwin, J. et. al, Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease, Biochemistry. 18 (24) : (1979). 2. Wallace, D., Large-and Small-Scale Phenol Extractions, Methods in Enzymology. 152 : (1987). 3. Coombs, L. et. al, Simultaneous Isolation of DNA, RNA, and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity from Small Tumor Samples Using Guanidine Isothiocyanate, Anal. Biochem. 188 : (1990). 4. Nicolaides, N. C. & Stoeckert, Jr., C. J., A Simple, Efficient Method for the Separate Isolation of RNA and DNA from the Same Cells, Biotechniques. 8 : (1990). 5. Feramisco, J. R. et. al, Molecular Cloning : , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 6. Raha, S. et. al, Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol and Lithium Chloride, Gene Anal. Techn. 7 : (1990) 关联产品 NucleoSpin RNA Plant (Code No /.50/.250) RNAiso Plus (Code No. 9108/9109) Recombinant DNase I (RNase-free) (Code No. 2270A/B) 注意本产品仅供科学研究使用, 不能用于人动物的医疗或诊断程序, 不能使用本产品作为食品化妆品或家庭用品等未经 TAKARA BIO INC. 书面许可授权或批准, 不得制造许诺销售销售进口 Takara 产品, 或者使用 Takara 产品所有的相关专利及相关商标如果您需要其他用途的许可授权, 请联络我们, 或访问我们网站您使用本产品必须遵守产品网页上适用的全部许可要求阅读了解并遵守此类声明的所有限制性条款是您的责任所有商标均属于各自商标所有者的财产某些商标并未在全部行政区注册本文件由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司翻译制作, 最新版本文件请参考 TAKARA BIO INC. 网站为正确使用 Takara 产品, 您应当掌握本产品的相关知识和使用说明 -8-

11 技术咨询热线 : , , URL: v201606da

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<4D F736F F D20D7DC524E41D0A1C1BFD6C6B1B8CAD4BCC1BAD02E646F63> AxyPrep 总 RNA 小量制备试剂盒本试剂盒用于从各种动物组织植物组织细胞细菌酵母和丝状真菌中提取总 RNA 提取的总 RNA 分子完整纯度高, 适用于 Northern Blot RT-PCR 体外翻译 Primer Extension S1 核酸酶作图 RNase 保护测定构建 cdna 文库等各种分子生物学实验一试剂盒组成贮存稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-RNA-4