2012,32(8) 冯舵等 : 福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达纯化活性检测及晶体生长的初步研究 25 株 E.coliBL21(DE3) 菌株为本实验室保存一对引物是由六合华大基因科技有限公司合成 DNA 连接酶购自北京百灵克生物科技有限公司 DNA 聚合酶购自宝生物工程公司质粒提取试剂

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奥魏
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2012,32(8):24 29 福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达纯化活性检测及晶体生长的初步研究冯 1 舵张 2 阔 1 李倩倩 1 韩翠晓高 1 伟 (1 北京林业大学理学院 / 林木育种国家工程实验室北京中国科学院生物物理所北京 ) 摘要 Sf2523 蛋白属于硫氧还蛋白过氧化物酶 (Prx) 家族, 在有氧代谢过程中消除活性氧, 起到保护生命大分子的重要作用通过构建原核表达体系, 可溶性表达并纯化了 Sf2523 酶蛋白, 并对蛋白进行了过氧化物酶活性检测, 证明其依然具有天然活性, 酶的核心结构并未发生变化由分子排阻色谱结果发现, 酶蛋白体内和体外聚集状态不同, 离体蛋白聚集状态不稳定, 趋于二体化将纯化的单体蛋白即时进行了结晶实验, 初筛长出了针状晶体通过进一步切除标签蛋白进行优化处理, 最终得到了均匀的三维单晶关键词硫氧还蛋白过氧化物酶蛋白纯化酶活性晶体生长福氏志贺痢疾杆菌中图分类号 Q789 活性氧 (reactiveoxygenspecies,ros), 是需氧细胞代谢过程中产生的活性氧簇, 对细胞的核酸蛋白质以及脂质等生物大分子产生氧化损伤 [1] 为了维持胞内低水平的 ROS, 生物体在进化过程中, 产生了诸多抗氧化系统硫氧还蛋白过氧化物酶家族 (peroxiredoxin, Prx) 就是比较重要的一类抗氧化蛋白, 广泛存在于真细菌古生菌酵母藻类高等植物以及哺乳动物中, 具有高度保守结构域的同系物达一百多种 [2 3] 与其他氧化物酶不同, 过氧化物还原酶利用活性半胱氨酸残基进行生化反应, 而不是辅基或者金属离子等氧化还原辅因子 [4] 依据不同的催化机制,Prx 蛋白被细分成三类 : 典型 2 cys 非典型 2 cys 以及 1 cys 型 [5] 本文的研究对象是存在于福氏志贺痢疾杆菌 2a 型 301 菌株中的硫氧还蛋白过氧化物酶 (thioredoxin dependentthiol peroxidase, 简称 Sf2523), 属于 Prx 家族中的 Bcp (bacterioferitincomigratoryprotein) 亚家族, 由 156 个氨基酸组成, 其中 4~156 共 153 个氨基酸残基构成其 Thioredoxin 结构域, 第 45 位高度保守的半胱氨酸残基是其活性位点, 催化机制属于非典型 2 cys, 即 45 位和收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 教育部新世纪优秀人才支持计划 (NECT ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :w_gao@bjfu.edu.cn 50 位半胱氨酸残基形成分子内二硫键, 通过硫氧还蛋白作为氢供体, 进行氧化还原反应 (2R SH+ROOH= R S S R +H 2 O+ROH) 以消除代谢产生的过氧化物, 从而在抗氧化损伤机制中起到重要作用福氏志贺菌 (Shigela) 属于革兰氏阴性菌, 兼性厌氧, 不形成孢子, 可感染人类及灵长类动物, 是细菌性 [6] 痢疾的主要病原菌之一据 WHO 简报称, 该致病菌每年在世界范围内造成亿人感染,110 万人死亡, 大部分为发展中国家 5 岁以下的儿童目前临床分离菌株有 95% 以上对多种抗生素出现抗药性, 原有的疫苗也不理想, 从而使得目前有效防治痢疾的手段严重匮乏, 因此,WHO 也已经把研制志贺菌新型疫苗作为一项重要的工作本文主要对 Sf2523 蛋白进行了基因克隆表达纯化催化活性检测以及初步结晶学性质的研究, 为进一步揭示过氧化物酶家族的生理机能和作用机制提供佐证, 同时也有助于寻找病原菌代谢途径中新的药物靶点, 从而克服病原菌对现有抗生素的耐药性, 这也是当前新药研发的一个热门方向 1 材料与方法 1.1 材料 Sf2523 基因 pet 28b(+) 质粒 E.coliDH5α 菌

2 2012,32(8) 冯舵等 : 福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达纯化活性检测及晶体生长的初步研究 25 株 E.coliBL21(DE3) 菌株为本实验室保存一对引物是由六合华大基因科技有限公司合成 DNA 连接酶购自北京百灵克生物科技有限公司 DNA 聚合酶购自宝生物工程公司质粒提取试剂盒胶回收试剂盒以及默克的二硫苏糖醇 (DTT) 4 羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES) 凝血酶 Sigma 的三氯乙酸 (TCA) 购自北京科创顺达科技有限公司亲和柱 NiFastflow6.0, 分子筛层析柱 Superdex20010/300GL, 及纯化系统 AKTA Purifier10 购自 GE 公司蛋白质晶体筛选试剂盒 CrystalScreensIand I 和 IndexScreen 购自 Hampton Research 公司 1.2 方法 Sf2523 基因引物的设计依据目的基因序列以及 pet 28b(+) 质粒的 MCS, 利用 primer5.0 设计 PCR 引物 :F:5 GACAGCCATATGTCCACTGAAAGCCG ( 引入 NdeⅠ 酶切位点 );R:5 GACATGCTCGAGTTAGG CGTGTTCTTTCAGC( 引入 XhoⅠ 酶切位点 ) Sf2523 基因原核表达载体的构建及鉴定通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段, 用限制性内切酶 Nde Ⅰ /XhoⅠ 进行双酶切, 插入同样酶切好的 pet 28b (+) 中, 由于设计下游引物时引入了终止子, 得到 N 端有 6 个 His 标签的重组蛋白, 利于后期的酶切去标签工作, 转化重组子到 DH5α 克隆菌株中, 进行菌液 PCR 验证阳性克隆, 送测序公司确定插入基因的正确性, 同时进行双酶切实验进一步确定是否插入正确目的蛋白的诱导表达与 SDS PAGE 鉴定将重组表达质粒转化 BL21 感受态细胞构建工程菌挑取工程菌的单菌落接种于 50ml 含有 Kan + 的 LB 培养基中,37 200r/min 振荡培养过夜, 以 1% 的接种量接入 1000ml 含 Kan + 的 LB 培养基中,37 200r/min 振荡培养至 OD 600 约 0.6, 加入异丙基 β D 硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度 0.6mmol/L, 诱导 3h, 低温离心收集菌体, 冰浴超声破碎, 再次低温离心, 取上清进行亲和层析 ( 详细步骤见节 ) 分别取诱导前诱导后破碎全细胞离心后上清和沉淀 Ni 柱洗脱样品, 检测蛋白的表达情况和可溶性 Sf2523 蛋白的大量表达和纯化将转化了重组质粒的 BL21 表达菌株接种到 50ml 含 Kan + 的 LB 培养基中,37,200r/min 振荡培养过夜, 第二天扩大培养至 1L 的 LB 培养基中, 接种量 1%,37,200r/min 振荡培养至 OD 600 为 0.6~0.8( 大约 3h) 加入 IPTG 至终浓度 0.6mmol/L, 诱导表达 3h,4 4000r/min 离心收集菌体用裂解液 (25mmol/L Tris ClpH 8.0, 300mmol/LNaCl,10%glycerol) 重悬菌体, 加入 PMSF 保护液, 冰浴超声破菌,4,15000r/min 离心 30min 取上清液转移至新管中 BuferA(25mmol/L Tris Cl, 300mmol/LNaCl,20mmol/L 咪唑,pH8.0) 平衡镍柱, 缓慢上样, 用 bufera 洗脱杂蛋白, 洗至 A 280 接近零值, 并且示数不再变动, 再用 buferb(25mmol/ltris Cl, 300mmol/LNaCl,150mmol/L 咪唑,pH8.0) 洗脱目标蛋白将目标蛋白通过 10kDa 的浓缩管, 用 buferc (10mmol/LTris Cl,pH8.0,100mmol/LNaCl) 浓缩蛋白溶液至 1ml, 用 buferc 平衡分子筛, 上样后收集目标峰取样 SDS PAGE 检测目标峰成分 Sf2523 蛋白过氧化物酶活性检测为检测重组蛋白是否具有天然活性, 从而进一步推断目的蛋白 [7] 是否折叠正常参照 Lim 等的方法进行活性检测反应体系为 1ml, 包括 5mmol/L 的 DTT,50mmol/L 的 HEPES HCl(pH7.0) 缓冲液和 15μg/ml 的 Sf2523 蛋白, 加入 H 2 至终浓度 200μmol/L 25 反应 0min 2.5min 5min 7.5min,10min 时, 加入 100μl10%(m/V) 的 TCA, 混匀后立即加入 200μl 的 10mmol/L Fe(NH 4 ) 2 SO 4 和 100μl 的 2.5mmol/LKSCN, 测定 D 490 根据反应剩余的 H 2 和 KSCN Fe(NH 4 ) 2 SO 4 形成的化合物的 D 490 来判断 Sf2523 蛋白过氧化物酶活性 Sf2523 蛋白聚集状态分析实验与 SDS PAGE NATIVE PAGE 检测 Sf2523 蛋白的聚集状态使用 AKTA 的 Superdex200 分子排阻色谱柱进行鉴定, 用 buferd(10mmol/ltris Cl,pH8.0,100mmol/LNaCl, 5mmol/LDTT) 替换 buferc 重复节中的实验步骤将亲和柱纯化的蛋白 4 放置 48h, 用 buferc 重复节中的实验步骤将节峰图及本步骤两组峰图进行分析比较分子量标准参照 GE 官方数据 :Thyroglobulin(Mr669000),Feritin(Mr440000), BSA(Mr67 000), β lactoglobulin(mr35 000), RibonucleaseA(Mr13700),CytochromeC(Mr13600), Aprotinin(Mr6512),VitaminB12(Mr1355) 取样进行 SDS PAGE NATIVE PAGE 检测 Sf2523 蛋白结晶条件筛选实验晶体生长条件筛选采取座滴法, 利用 Bradford 法测定蛋白浓度, 将目的蛋白样品浓缩至 20mg/ml, 使用 Hampton 公司生产的 CrystalScreensIand I 和 IndexScreen 试剂盒共 198 个条件进行筛选, 采用 MolecularDimensions 公司生产的 96 孔座滴结晶板, 池液 80μl, 蛋白液与池液 1 1 比

26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.82012 例混合后, 盖上覆膜, 置于 16 培养箱,48h 后显微镜下观察晶体生长情况 1.2.8 切除 His 标签优化晶体生长通过 Lasergene 软件预测 ( 图 1), 载体上表达的氨基酸 (MGSSHHHHHHSSGLVPAGSH) 使蛋白 N 端柔性增强, 不利于结晶同时, 由于目标蛋白很小, 标签对于结晶行为的影响相对就会变大, 所以使用凝血酶切除标签后, 重复 1.

2kDa 吻合, 同时蛋白可溶性良好,90% 以上存在于上清中经过亲和层析初步纯化后亲和柱初步处理后, 目的蛋白依然有一些杂带, 需要进一步纯化处理图 1 Lasergen 软件分析 Sf2523 蛋白二级结构 Fig.1 Secondarystructurepredictionof Sf2523usingLasergen 2 结果 2.

2) 由华大基因测序, 证明插入正确且无突变图 3 蛋白质可溶性表达检测 Fig.

induced;4:precipitatepartafteriptg induced;5:ni column 2.

3 26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No 例混合后, 盖上覆膜, 置于 16 培养箱,48h 后显微镜下观察晶体生长情况切除 His 标签优化晶体生长通过 Lasergene 软件预测 ( 图 1), 载体上表达的氨基酸 (MGSSHHHHHHSSGLVPAGSH) 使蛋白 N 端柔性增强, 不利于结晶同时, 由于目标蛋白很小, 标签对于结晶行为的影响相对就会变大, 所以使用凝血酶切除标签后, 重复节实验步骤进行结晶实验 2.2 Sf2523 蛋白可溶性检测与亲和层析将所取样品与 5 loadingbufer 混合, 沸水处理 5min, 离心后经 15% 的 SDS PAGE 检测结果显示 ( 图 3) 阳性克隆菌株成功表达目的蛋白, 目的条带在 18.4kDa 附近, 与理论值 19.2kDa 吻合, 同时蛋白可溶性良好,90% 以上存在于上清中经过亲和层析初步纯化后亲和柱初步处理后, 目的蛋白依然有一些杂带, 需要进一步纯化处理图 1 Lasergen 软件分析 Sf2523 蛋白二级结构 Fig.1 Secondarystructurepredictionof Sf2523usingLasergen 2 结果 2.1 原核表达载体的构建及鉴定以实验室保存的 Sf2523 基因为模板, 用设计的引物扩增目的基因, 克隆到 pet28 表达质粒上, 构建仅 N 端有标签的表达系统挑取菌落 PCR 正确的菌落培养, 提取质粒后进行 NdeⅠ /XhoⅠ 双酶切重组质粒, 可得到一条 500bp 左右的条带, 与 Sf2523 基因理论值 471bp 吻合 ( 图 2) 由华大基因测序, 证明插入正确且无突变图 3 蛋白质可溶性表达检测 Fig.3 SolubleexpresionanalysisofSf2523protein M:Marker;1:WholecellysesanalysisbeforeIPTG induced;2: WholecellysesanalysisafterIPTG induced;3:supernatantpart afteriptg induced;4:precipitatepartafteriptg induced;5:ni column 2.3 Sf2523 蛋白分子筛层析目的蛋白主峰在 SuperdexG20010/300GL 层析柱上 18ml 左右, 在 16ml 左右出现一个小峰 ( 图 4a), 经 15% 的 SDS PAGE 检测 ( 图 4b), 两个峰的成分均为目的蛋白, 分别为目的蛋白单体聚集态和二体聚集态图 2 酶切鉴定重组子 Fig.2 Identificationoftherecombinantplasmid Leftlane:DL2000marker;Rightlane:recombinantplasmiddigested byndeⅠandxhoⅠ 图 4 分子筛层析纯化 Sf2523 蛋白 (a) 及鉴定 (b) Fig.4 PurificationofSf2523usingsuperdex 200(a)andidentification(b) 2.4 Sf2523 过氧化酶活性实验活性实验以 DTT 作为硫醇供体, 反应时间为横坐

4 2012,32(8) 冯舵等 : 福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达纯化活性检测及晶体生长的初步研究 27 标,H 2 剩余百分率为纵坐标绘制曲线 ( 图 5), 结果显图 5Sf2523 蛋白还原 H 2 活性的测定 Fig.5 ReductionofH 2 bysf2523protein Reactionmixtures(1 ml) containing50 mmol/l HEPES (ph 7.0),5mmol/LDTT,200μmol/LH 2 and15μg/mlsf2523 protein.theremainingh 2 inthereactionmixturewasmeasured usingtheferithiocyanatesystem.theresultswereexpresedasthe ratioofd 490 recordedwiththesf2523tothatrecordedwithoutthe Sf2523 示随着反应时间的延长,H 2 剩余百分率逐步降低, 说明 H 2 被 Sf2523 酶蛋白还原了, 酶蛋白依然具有天然活性, 天然结构正常此外, 对其进行额外的温度依赖性实验显示目的蛋白在 35 时, 催化活性达到最佳在温度达到 55 时, 酶活力依然保持 90% 左右, 表明 Sf2523 蛋白酶抗温度胁迫能力较强 2.5 Sf2523 蛋白聚集状态分析与 SDS PAGE 和非变性胶检测根据已知同源蛋白的性质,Sf2523 蛋白半胱氨酸氨基酸残基 C45 与 C50 的巯基在分子内或者分子间发生相互作用 ( 具体机制尚无报道 ), 导致其在氧化状态和还原状态聚集状态不同, 分子筛结果显示 ( 图 6), 氧化状态下为单体和二体混合物, 还原状态下主要以单体存在, 适于结晶实验镍亲和柱纯化的蛋白 4 静置 48h 后, 在氧化状态条件下进行分子筛分析 ( 图 7), 二体比例明显提高但是取二体峰再次 4 静置 48h 后重复分子筛实验, 所得峰图与图 7 相似, 依然为二体峰与单体峰并存 SDS PAGE 结果显示以上三组实验所有峰的成分均为目的蛋白 NATIVE PAGE 分析氧化环境下分子筛两个峰的成分 ( 图 8), 单体峰成分在 native 条件下, 大部分单体转变成了二体, 这个现象有待进一步的研究图 6 Sf2523 蛋白在氧化环境 (a) 和还原环境 (b) 下的分子排阻色谱 Fig.6 SizeExclusiveChromatographyofSf2523underoxidativeandreductiveenvironment 2.6 Sf2523 蛋白晶体筛选结果取还原环境下的单体峰峰尖部分和氧化环境下的二体峰峰尖部分进行结晶筛选,16 静置 48h 观察结晶情况, 单体峰蛋白在 Index 的 78 号条件 [0.2mol/L Ammoniumacetate,0.1mol/LBis TrispH5.5,25% w/v Polyethyleneglycol3350]( 图 9a) 和 CrystalScreen36 号条件 [0.1mol/L TrishydrochloridepH8.5,8% w/v Polyethyleneglycol8000]( 图 9b) 中长出小的针状结晶, 经染色确认为蛋白晶体但是, 现有针状结晶由于体积和形状都不利于拿到好的衍射数据二体峰蛋白在 CrystalScreensIand I 和 IndexScreen 试剂盒的 198 个条件下未能筛选出晶体 2.7 Sf2523 蛋白晶体优化通过切除融合蛋白序列上的无关序列, 减小 N 端柔性, 在 CrystalScreen36 号条件 ( 图 10) 得到规则的单晶, 其三维生长比较均匀, 有助于克服晶体衍射的各向异性

28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No.82012 图 7 Sf2523 蛋白 4 静置 48h 后在氧化环境下的分子排阻色谱 Fig.7SizeExclusiveChromatographyofSf2523under oxidativeenvironmentafter48h 图 8 氧化环境下 Sf2523 蛋白分子排阻色谱各峰成分非变性胶分析 Fig.

9 Crystalpicturefrom Index 78(a)and CrystalScreen 36(b) 图 10 无标签 Sf2523 蛋白晶体图片 Fig.

(Sf2523) 蛋白, 纯化后对其进行了活性检测和晶体生长研究由于 Sf2523 蛋白在功能上是一种过氧化物酶, 所以设计了 Sf2523 蛋白还原 H 2 的实验, 结果显示酶蛋白在体外表达依然具备活性, 说明酶蛋白的核心结构未发生变化, 为下一步酶蛋白结晶实验铺平了道路由分子排阻色谱结果可以推断出,Sf2523 蛋白在体内和体外的聚集状态不同, 在工程菌中可能主要以单体存在,

5 28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No 图 7 Sf2523 蛋白 4 静置 48h 后在氧化环境下的分子排阻色谱 Fig.7SizeExclusiveChromatographyofSf2523under oxidativeenvironmentafter48h 图 8 氧化环境下 Sf2523 蛋白分子排阻色谱各峰成分非变性胶分析 Fig.8 Native PAGEanalysisofSf2523after SECunderoxidativesurrounding ThenumberabovecorespondingtotheelutionvolumeofSEC 图 9 Index 78(a) 和 CrystalScreen 36(b) 条件的晶体筛选照片 Fig.9 Crystalpicturefrom Index 78(a)and CrystalScreen 36(b) 图 10 无标签 Sf2523 蛋白晶体图片 Fig.10 CrystalpictureofSf2523proteinafter cutingtagsirrelevanttothewildsequence 3 讨论由于 Sf2523 蛋白在痢疾杆菌有氧代谢途径中起到重要作用, 所以研究其结构与功能有助于揭示痢疾杆菌在有氧环境中的抗氧化机制, 同时也为研发治疗痢疾的新型药物提供新的靶标位点本文基于此成功克隆表达了福氏志贺氏菌的硫氧还过氧化物酶 (Sf2523) 蛋白, 纯化后对其进行了活性检测和晶体生长研究由于 Sf2523 蛋白在功能上是一种过氧化物酶, 所以设计了 Sf2523 蛋白还原 H 2 的实验, 结果显示酶蛋白在体外表达依然具备活性, 说明酶蛋白的核心结构未发生变化, 为下一步酶蛋白结晶实验铺平了道路由分子排阻色谱结果可以推断出,Sf2523 蛋白在体内和体外的聚集状态不同, 在工程菌中可能主要以单体存在, 在体外趋于二体化, 解释了在破菌收集蛋白后即时进行分子排阻色谱以单体峰为主 ( 图 6a), 而 4 静置 48h 后再进行分子排阻色谱, 二体峰比例大大提高 ( 图 7) 的现象但是取二体峰 4 静置 48h 再次进行分子排阻色谱, 单体峰重新出现的现象揭示了 Sf2523 蛋白聚集状态不稳定的性质, 蛋白内部半胱氨酸残基的相互作用可能是动态的, 其机制有待进一步研究非变性胶的电泳结果表明, 非变性条件以及电流温度等因素大大加剧了离体蛋白由单体向二体转化的效率由晶体生长来看, 单体形式存在的蛋白比二体形式存在的蛋白容易长晶体影响生物大分子结晶的因素很多, 主要包括蛋白质的相对柔性 ; 纯度 ; 过饱和度 ; 温度 ;ph 值等其中蛋白质的相对柔性包括连接刚性二级结构的无序的 loop 区, 它们通常都暴露于溶剂区, 不仅自身具有较大的活动潜力, 它的活动还可能会导致毗邻的有序二级结构的偏离 ; 孤立的肽段如蛋白质的 N 末端和 C 末

6 2012,32(8) 冯舵等 : 福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达纯化活性检测及晶体生长的初步研究 29 端, 它们常常具有较大的柔性和活动性 ; 酶的活性部位常常具有很大的柔性 ; 在糖蛋白中的糖基一般都存在显著的柔性这些柔性区域都会影响到蛋白质的结晶用 pet 28b 载体表达的蛋白会比切掉 N 端 His 标签的蛋白 N 端多 17 个氨基酸 MGSSHHHHHHSSGLVPR, 这些氨基酸可能会在蛋白的 N 端形成具有较大柔性和活动性的肽段, 进而影响了蛋白的堆积, 从而只在一个维度上形成结晶, 而切除掉 N 端 tag 等无关氨基酸残基序列后, 蛋白在三维层次的堆积上有了很大改观, 得到了利于衍射的三维单晶参考文献 [1]DanilaL,EmiliaP,LlariaG,etal.Peroxiredoxinsascelular guardiansinsulfolobussolfataricus characterizationofbcp1, Bcp3andBcp4.FEBSJournal,2008,275(9): [2] DietzK J, Jacob S, Oelze M L, etal. The function of peroxiredoxinsinplantorganeleredoxmetabolism.jexpbot, 2006,57(8): [3]WoodZA,SchroderE,RobinHJ,etal.Structure,mechanism andregulationofperoxiredoxins.trendsbiochem Sci,2003,28 (1): [4]DanilaL,KatiaD A,EmmaL,etal.Exploringthecatalytic mechanism ofthe?rstdimericbcp:functional,structuraland dockinganalysesofbcp4from Sulfolobussolfataricus.Biochimie, 2010,92(10): [5]DavidJC,XimenaPO,MackayCL,etal.Subdivisionofthe bacterioferitin comigratory protein family of bacterial peroxiredoxinsbasedoncatalyticactivity.biochemistry,2010,49 (6): [6]WangXY,TaoFB,XiaoDL,etal.Trendanddiseaseburden ofbacilarydysenteryinchina.bulofworldhealthorganization, 2006,84(7): [7]Lim Y S,ChaM K,Kim H K,etal.Removalsofhydrogen peroxideandhydroxylradicalbythiol specificantioxidantprotein asaposibleroleinvivo.biochembiophysrescommun,1993, 192(1): Expresion,Purification,ActivityDetectionandCrystalGrowthStudieson Sf2523Proteinfrom Shigelaflexneri2aStrain301 FENGDuo 1 ZHANGKuo 2 LIQian qian 1 HANCui xiao 1 GAOWei 1 (1NationalEngineeringLaboratoryforTreeBreeding/ColegeofScience,BeijingForestryUniversity,Beijing ,China) (2InstituteofBiophysics,ChineseAcademyofSciences,Beijing ,China) Abstract Sf2523proteinisamemberfrom thethioredoxinperoxidase(prx)family.peroxiredoxinsare ubiquitousproteinsthatcatalyzethereductionofhydroperoxides,thusconferingresistancetooxidativestres. Sf2523proteincanprotectthelargebiologicalmoleculesfrom reactiveoxygenspecie,playinganimportantrole duringaerobicmetabolism.aftertheconstructionofprokaryoticexpresionsystem,thesf2523proteinwas expresedinsolublestate,andpurifiedbyniafinitychromatographyandsizeexclusivechromatography.the peroxidaseactivityexperimentprovedthatitstilhasanaturalenzymeactivityandthecorestructurehasnot changed.enzymeproteininvivoandinvitrohasdiferentstateofaggregation.thepurifiedmonomericproteinof crystalizationexperiments,screeningouttheneedle likecrystals.throughfurtherresectionoflabelproteinto optimizetheprocesing,finaly,ahomogeneousthree dimensionalcrystalwasgot. Keywords Peroxiredoxin Purificationofprotein Enzymeactivity Crystalgrowth Shigelaflexneri

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽