第 3 期赵清风等 :AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制 53 近年来抗生素杀虫剂和灭菌剂等化学药物被大量使用, 使得微生物耐药性增强, 人类健康和生存环

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妊焱罗
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1 第 9 卷第 3 期 2011 年 5 月生物加工过程 ChineseJournalofBioprocesEngineering Vol.9No.3 May2011 doi: /j.isn AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制赵清风 1,2, 陈介南 1, 张林 1, 张伟涛 1 1,2, 何刚 (1. 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所, 长沙 ; 2. 中南林业科技大学生命科学与技术学院, 长沙 ) 摘要 : 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌, 对 AgNO 3 的抗菌效果进行研究, 并对其抗菌机制作初步探讨 AgNO 3 对大肠杆菌的抑制生长曲线表明 :2 891mg/L 的 AgNO 3 能够完全抑制 10 6 个 /ml 的大肠杆菌细胞生长, AgNO 3 使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的延滞期加长, 并且浓度越高, 延滞期越长另外,AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶的活性有明显影响, 随着 AgNO 3 浓度的提高, 脱氢酶的活性逐渐降低 AgNO 3 溶液作用于细菌后, 细菌表面疏水性均有不同程度地下降, 且浓度越大对其影响也越明显, 大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡萄球菌关键词 :AgNO 3 ; 大肠杆菌 ; 金黄色葡萄球菌中图分类号 :Q599 文献标志码 :A 文章编号 : (2011) Antimicrobialactivityandmechanism ofsilvernitrateon EscherichiacoliandStaphylococcusaureus ZHAOQingfeng 1,2,CHENJienan 1,ZHANGLin 1,ZHANGWeitao 1,HEGang 1,2 (1.InstituteofBiologicalandEnviromentalScienceandTechnology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha ,China;2.ColegeofLifeScienceandTechnology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China) Abstract:UsingEscherichiacoliandStaphylococusaureusasmodelstrains,theantibacterialefectand themechanismofsilvernitratewereinvestigated.experimentalresultsindicatedthatthesilvernitrateof 2 891mg/mLcouldinhibitcompletelythegrowthof10 6 cfu/mlcelsinliquidlbmedium,andthatsil vernitrateprolongedthelagphaseofe.coliands.aureus,thehighertheconcentration,thelongerthe lagphase.inaddition,silvernitratehadamarkedefectonthedehydrogenaseactivityofe.coliands. aureus,thedehydrogenaseactivitydecreasedastheconcentrationincreased.thesurfacehydrophobicity ofbacterialcelsalhadadeclinetosomeextentfolowedthesolutionofsilvernitrateworkedonthebac teria,andthehighertheconcentration,themoreitsefect.thedescendingdegreeine.coliwaslarger thanthatins.aureus. Keywords:silvernitrate;Escherichiacoli;Staphylococusaureus 收稿日期 : 基金项目 : 十一五国家科技支撑计划资助项目 (2006BAD07A07-08) 作者简介 : 赵清风 (1986 ), 男, 山东临朐人, 硕士研究生, 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; 陈介男 ( 联系人 ), 教授, 博士生导师,E mail: chenjnx@gmail.com

中南林业科技大学生命科学与技术学院, 长沙 410004) 摘要 : 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌, 对 AgNO 3 的抗菌效果进行研究, 并对其抗菌机制作初步探讨 AgNO 3 对大肠杆菌的抑制生长曲线表明 :2 891mg/L 的 AgNO 3 能够

2 第 3 期赵清风等 :AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制 53 近年来抗生素杀虫剂和灭菌剂等化学药物被大量使用, 使得微生物耐药性增强, 人类健康和生存环境受到很大的威胁研发新型抗菌材料已成为防止微生物灾害事件发生的一种趋势无机抗菌材料具有很多优点, 如安全性高持久性好耐热性强不易产生抗药性等, 从 20 世纪 80 年代开始被陆续开发与应用 [1-2] 其中, 载银无机抗菌材料由于具有抗菌活性高抗菌谱广毒性低等特点已成为应用最广泛的无机抗菌材料 Ag + 可以强烈地吸引细菌体中蛋白酶上的巯基 ( SH), 迅速与其结合, 使蛋白酶丧失活性, 导致细菌死亡当细菌被 Ag + 杀死后,Ag + 又从细菌中游离出来, 再与其他菌落接触, 不断地进行上述过程, 这也是 Ag + 能持续杀菌的原因 [3-4] 但是, 在长期的环境适应条件下, 很多细菌产生了对 Ag + 的抗性, 这种抗性与细菌对 Ag + 的有效外排作用以及周质空间对 Ag + 的吸收和外膜缺失孔道等机制有关 [3] 对无机载银抗菌材料的抗菌机制以及细菌的抗银机制进行深入的研究, 将为开发更加广谱高效的抗菌材料提供理论基础无机载银抗菌材料主要是通过释放 Ag + 来发挥其抗菌活性的, 因此其抗菌机制通常以 Ag + 作为实验材料进行研究笔者以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌, 研究 AgNO 3 对它们的抗菌作用, 以期为无机载银抗菌材料的广泛应用奠定科学基础 1 材料与方法 1 1 实验材料 0 37mg/mLAgNO 3 溶液, 自配 ; 大肠杆菌 (Esche richiacoli)atcc8739 购自美国菌种保藏中心 ; 金黄色葡萄球菌 (Staphylococusaureus)CICC20235 购自中国工业微生物菌种保藏中心 ;LB 培养基, 自配 1 2 实验方法 AgNO 3 的最小抑菌浓度实验配制质量浓度为 370mg/L 的 AgNO 3 溶液, 然后按对倍稀释的方法将其依次稀释至初始浓度的 1/ 512 配备双倍浓度的 LB 培养基灭菌处理在试管中分别加入 2 5mL 不同浓度的抗菌液 2 5mL 培养基 0 1mL 菌液, 置于 (37±2) 的恒温培养箱培养 48h, 观察结果 AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响取 6 个三角瓶分别加入 25mL 灭菌的双倍 LB 培养基 25mLAgNO 3 溶液和大肠杆菌菌液,AgNO 3 质量浓度分别取和 mg/l5 个梯度大肠杆菌密度约为 10 6 个 /ml; 再取 6 个三角瓶, 分别加入 25mL 灭菌的双倍 LB 培养基 25mLAgNO 3 溶液和金黄色葡萄球菌菌液, AgNO 3 质量浓度分别取和 46 25mg/L5 个梯度金黄色葡萄球菌浓度约 10 6 个 /ml 放入 (37±2) 摇床中恒温振荡培养每隔一段时间取样, 用 UV 5420 型分光光度计 ( 日本岛津 ) 测定 OD 600, 以培养时间为横坐标,OD 600 为纵坐标, 绘制生长曲线 AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响取 0 02gAgNO 3 溶于 50mL 灭菌蒸馏水中, 将其对倍稀释至原浓度的 1/16 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接入培养基过夜活化 ; 在具塞试管中加入 1mL 菌液然后依次加入 2mL0 05mol/L 的 Tris HCl 缓冲液 2mL0 1mol/L 的葡萄糖溶液 2mL1mg/mL 的氯化三苯基四氮唑 (TTC) 溶液 ; 在各个试管中分别加入质量浓度为和 25mg/L 的 AgNO 3 溶液, 将其充分混匀后放入 37 恒温箱静置 30min 加入 2 滴浓 H 2 SO 4 终止反应, 分别加入 5mL 甲苯振荡萃取产物 ; 取上层有机物 4000r/min 离心 5min, 以甲苯为参比,490nm 处比色 AgNO 3 对细菌细胞表面疏水性的影响称取 AgNO g 溶于 50mL 灭菌蒸馏水中, 将其稀释至初始浓度的 1/64 1/128 1/256 配制双倍浓度的牛肉膏蛋白胨培养基灭菌处理, 取 25 ml 培养基分别与 25mL 不同浓度的 AgNO 3 溶液混合然后接入 1mL 菌液将其放入恒温摇床培养 16 h, 用 0 1mol/LKNO 3 (ph6 2) 将静止生长期的细菌清洗 2 次,5000r/min 离心 10min, 将沉淀重新悬于 0 1mol/LKNO 3 (ph 6 2), 使 OD 400 =0 4 (A 0 ) 用 ph 7 4 的 10mmol/L 磷酸钠缓冲液 (NAPB) 作为对照取 4mL 细菌悬浮液加入 0 2 ml 十六烷, 室温下静置 10min, 然后在旋涡振荡器振荡混合 2min 待混合物完全两相分离后移出水相并测其 OD 400 (A 1 ) 细菌吸附百分率以下式计算 :(1-A 1 /A 0 ) 100%, 作为细菌细胞表面疏水性指标 [5] 实验重复 2 次

用最广泛的无机抗菌材料 Ag + 可以强烈地吸引细菌体中蛋白酶上的巯基 ( SH), 迅速与其结合, 使蛋白酶丧失活性, 导致细菌死亡当细菌被 Ag + 杀死后,Ag + 又从细菌中游离出来, 再与其他菌落接触, 不断地进行上述过程, 这也是 Ag

3 54 生物加工过程第 9 卷 2 结果与讨论 2 1 AgNO 3 对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌效果 AgNO 3 抗菌实验结果如表 1 所示从表 1 可以看出 :AgNO 3 对大肠杆菌的最小抑菌浓度为 2 891mg/L, 对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为 5 781mg/L 表 1 AgNO 3 最低抑菌浓度实验 Table1 Minimum inhibitoryconcentrationofsilvernitrate ρ(agno 3 )/ (mg L -1 ) 大肠杆菌金黄色葡萄球菌 1 # 2 # 1 # 2 # 注 :+ 表示有菌体生长 ;- 表示无菌体生长 2 2 AgNO 3 对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制生长曲线, 如图 1 和图 2 所示图 2 AgNO 3 对金黄色葡萄球菌的抑制生长曲线 Fig.2 GrowthcurvesofStaphylococcusaureuson diferentconcentrationsofsilvernitrate AgNO 3 能够使这 2 种菌的延滞期延长, 且 AgNO 3 浓度越高延滞期越长当 AgNO 3 质量浓度达到 mg/L 时, 大肠杆菌的生长被完全抑制当 AgNO 3 质量浓度达到 mg/L 时, 金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制培养至 48h 后取样进行平皿培养, 均没有长出菌落因为 OD 600 测得的是活菌和死菌的总数, 所以衰亡期不明显 2 3 AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响结果脱氢酶是细菌呼吸代谢过程中所必需的酶, 以脱氢酶催化氯化三苯基四氮唑 (TCC) 生成三苯基甲脂 (TF) 的量即可衡量脱氢酶的活性, 从而反映细菌细胞被破坏的程度 [6] 图 3 为不同浓度的 AgNO 3 对大肠杆菌脱氢酶活性的影响曲线图 4 为不同质量浓度的 AgNO 3 对金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响曲线从图 3 和图 4 中可以看出 :2 种菌在加入低浓度的 AgNO 3 溶液时仍然有部分 TTC 转化为 TF, 这说明低浓度的 AgNO 3 并没有使细菌脱氢酶活性完全丧失, 或者说不是所有细菌的活性都受到了抑制 [7], 随着 AgNO 3 浓度的增加, 脱氢酶的活性逐渐图 1 AgNO 3 对大肠杆菌的抑制生长曲线 Fig.1 GrowthcurvesofEscherichiacoliondiferent concentrationsofsilvernitrate 从图 1 和图 2 可以看出 :AgNO 3 质量浓度为和 1 445mg/L 时,2 种菌的生长均为典型的生长曲线与对照组 (0mg/L) 相比较, 可以看出图 3 AgNO 3 对大肠杆菌脱氢酶活性的影响 Fig.3 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase activityofescherichiacoli

23 130 - - - - 11 560 - - - - 5 781 - - - - 2 891 - - + + 1 445 + + + + 0 723 + + + + 注 :+ 表示有菌体生长 ;- 表示无菌体生长 2 2 AgNO 3 对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡

4 第 3 期赵清风等 :AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用及机制 55 减弱, 由此可知, 低浓度的 AgNO 3 溶液能够影响细菌脱氢酶的活性从而影响细菌的正常生命代谢, 当 AgNO 3 达到一定浓度时, 可完全抑制细菌的活性, 使其新陈代谢过程终止从而死亡萄球菌的下降程度图 4 AgNO 3 对金黄色葡萄球菌脱氢酶活性的影响 Fig.4 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase activityofstaphylococcusaureus 图 5 AgNO 3 对大肠杆菌细胞表面疏水性的影响 Fig.5 Efectsofsilvernitrateonthebacterialcel surfacechargeofescherichiacoli 2 4 AgNO 3 对细菌细胞疏水性的影响细菌细胞表面同时存在有亲水性位点和疏水性位点亲水性位点主要是磷酸基团羧基胍基以及氨基等带电荷的基团, 也包括不带电荷的二羟基基团等 ; 疏水性位点主要是脂多糖脂类蛋白质影响细胞表面疏水性的因素主要有蛋白多糖的比例, 细胞外层中碳水化合物与多糖的类型排列方向 [8] [9] Im 等以重组型乳酸菌与野生型乳酸菌为模式菌研究发现, 细菌的表层蛋白影响细菌表面的疏水性, 通过疏水相互作用增强了细菌对十六烷的吸附笔者同样利用十六烷的疏水性以及对细菌的吸附性来检验 AgNO 3 对细菌细胞表面疏水性的影响图 5 和图 6 分别为不同浓度的 AgNO 3 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞表面疏水性的影响 AgNO 3 作用于细菌的第一步是与细菌表面相接触, 带正电荷的银离子与带负电荷的细菌表面脂多糖相结合, 从而影响细菌的表面特性, 细菌的表面特性主要包括表面电荷与表面疏水性 [9] 由图 5 和图 6 可知 : 经 AgNO 3 处理后 2 种细菌细胞表面疏水性均有不同程度的下降这可能是因为 Ag + 带正电荷, 吸引细菌表面带负电荷的基团趋向表面分布进行重排, 从而导致细菌表面疏水性下降从图 5 和图 6 可以看出 :AgNO 3 溶液作用于细菌后, 细菌细胞表面疏水性均有不同程度的下降, 且浓度越大影响也越明显大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡图 6 AgNO 3 对金黄色葡萄球菌细胞表面疏水性的影响 Fig.6 Efectsofsilvernitrateonthebacterialcel surfacechargeofstaphylococcusaureus 3 结论 AgNO 3 溶液能在较低的浓度下抑制细菌生长 AgNO 3 使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长延滞期加长, 并且 AgNO 3 浓度越高, 生长延滞期越长较低浓度的 AgNO 3 溶液并不能使大肠杆菌悬液金黄色葡萄球菌细菌脱氢酶的活性完全丧失, 但随着 AgNO 3 浓度的增加, 脱氢酶的活性逐渐减弱直至完全失活由此可知 : 低浓度的 AgNO 3 溶液能够影响细菌的正常生命代谢活动, 当达到一定浓度时, 即可完全抑制细菌的活性, 使其新陈代谢过程终止 AgNO 3 溶液作用于细菌后, 细菌细胞表面疏水性均有不同程下降, 且浓度越大, 对其影响也越明显大肠杆菌的下降程度要大于金黄色葡萄球菌的下降程度

4 Efectsofsilvernitrateonthedehydrogenase activityofstaphylococcusaureus 图 5 AgNO 3 对大肠杆菌细胞表面疏水性的影响 Fig.

5 56 生物加工过程第 9 卷参考文献 : [1] 夏金兰, 王春, 刘新星. 抗菌剂及其抗菌机理 [J]. 中南大学学报 : 自然科学版,2004,35(1): [2] 谢小保, 李文茹, 曾海燕, 等.AgNO 3 对大肠杆菌的抗菌作用及其机制 [J]. 材料工程,2008(10): [3] SlawsonRM,LeeH,TrevorsJT.Bacterialinteractionswithsilver [J].BiolMetals,1990,34(3): [4] 魏秋华. 抗菌剂的研究进展 [J]. 中国消毒学杂志,2003,20 (1): [5] vandermelhc,vandebelt GriterB,PouwelsPH,etal.Cel surfacehydrophobicityisconveyedbys layerproteins:astudyin recombinantlactobacili[j].coloidsandsurfacesb:biointerfac es,2003,28(2/3): [6] 朱南文, 闵航, 陈美慈, 等.TTC: 脱氢酶测定方法的探讨 [J]. 中国沼气,1996,16(2):3 5. [7] SlawsonRM,LeeH,TrevorsJT.Bacterialinteractionswithsilver [J].BiolMetals,1990,3(3/4): [8] 侯利霞, 翟培, 施用晖, 等. 家蝇抗菌肽对细菌细胞表面特性影响及其作用机理的研究 [J]. 微生物学通报,2007,34(3): [9] ImKC,TakasakiY,EndoA,etal.Antibacterialactivityofα typezeolitesupportingsilverionsindeionizeddistiledwater[j]. AntibactJAntifungAgents,1996,24(4): 櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒国外动态日本开发出高效培养心肌细胞的方法日本一个研究小组开发出了利用诱导多功能干细胞 (ips 细胞 ) 高效培养心肌细胞的方法, 今后如果能够利用这一方法大量培养心肌细胞, 将可用于恢复因心肌梗死而受损的心脏功能京都大学 ips 细胞研究所副教授山下润率领的研究小组向实验鼠的 ips 细胞加入一种免疫抑制剂环孢菌素 A 后进行培养, 发现发育成的心肌细胞数量是不加入环孢菌素 A 时的 12 倍左右 ; 而利用人类 ips 细胞进行培养时, 在培养到第 12 天的时候, 确认生成的心肌细胞数量, 是不加入环孢菌素 A 时的 4 倍以上研究小组认为, 这表明环孢菌素 A 在诱导实验鼠和人类 ips 细胞发育成心肌细胞过程中发挥了重要作用研究小组确认, 利用人类 ips 细胞培养的心肌细胞与人类心脏心室细胞拥有同样的性质和结构相关论文已刊登在美国科学杂志公共科学图书馆综合网络版上新技术用干细胞培育人体肾脏,10 年左右将应用于人体英国爱丁堡大学的科学家在实验室中利用人的羊水和动物的胚胎细胞培育出了人体肾脏, 其长度同未出生婴儿肾脏的长度相当这一最新突破有望让需要接受器官移植的病人按需培育出自己的器官, 在移植手术中规避发生排斥反应的风险该肾脏长 0 5cm 科学家希望这种人造器官移植入人体后能成长为全尺寸的器官该研究的领导者之一爱丁堡大学实验解剖学教授生理学家吉美戴维斯表示 : 科学家一直希望能用人体干细胞培育出功能性的器官, 现在, 我们制造出了和正常的胎儿肾脏一样复杂的事物戴维斯表示, 新技术将于 10 年左右应用于人体 ( 胡晓丽 )

[5] vandermelhc,vandebelt GriterB,PouwelsPH,etal.Cel surfacehydrophobicityisconveyedbys layerproteins:astudyin recombinantlactobacili[j].coloidsandsurfacesb:biointerfac es,2003,28(2/3):127 136.

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