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让逄
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1 320 江苏农业学报 (Jiangsu J. of Agr. Sci. ),2010,26(2):320 ~ 324 冯志新, 迟灵芝, 刘茂军, 等. 猪肺炎支原体 P46 蛋白单克隆抗体制备 [J]. 江苏农业学报,2010,26(2):320 鄄 324. 猪肺炎支原体 P46 蛋白单克隆抗体制备冯志新 1, 摇迟灵芝 2, 摇刘茂军 1, 摇王海燕 1, 摇甘摇源 1, 摇吴叙苏 1 1, 摇邵国青 (1. 江苏省农业科学院兽医研究所, 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室, 国家兽用生物制品工程技术研究中心, 江苏南京 ; 2. 山东畜牧兽医职业学院, 山东潍坊 ) 摇摇摘要 : 摇 P46 蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白, 且与其他支原体无交叉反应, 常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白制备针对该蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源本研究取猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠, 用大肠杆菌表达的 P46 蛋白作为筛选抗原制备了 2 株特异性单克隆抗体 1A4 和 3C11 结果显示,2 株单抗 ELISA 效价最高可达 1 颐 Western 鄄 blot 结果表明,2 株单抗均能与原核表达的 P46 蛋白及猪肺炎支原体全菌蛋白中大小的蛋白发生特异性反应 ; 2 株杂交瘤细胞株经 3 个月冻存或连续传代 3 个月均能保持较高的滴度本研究成功制备了 2 株针对猪肺炎支原体 P46 蛋白的特异稳定且高滴度的单克隆抗体关键词 : 摇猪肺炎支原体 ; P46 蛋白 ; 单克隆抗体中图分类号 : 摇 S 摇摇摇文献标识码 : 摇 A 摇摇摇文章编号 : 摇 1000 鄄 4440(2010)02 鄄 0320 鄄 05 Preparation of Monoclonal Antibody against P46 Protein of Mycoplasma hyopneumoniae FENG Zhi 鄄 xin 1, 摇 CHI Ling 鄄 zhi 2, 摇 LIU Mao 鄄 jun 1, 摇 WANG Hai 鄄 yan 1, 摇 GAN Yuan 1, 摇 WU Xu 鄄 su 1, SHAO Guo 鄄 qing 1 (1. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Diseases Diagnostic and Immunology, Ministry of Agriculture,National Center for Engineering Research of Veterinary Bio 鄄 products, Nanjing , China; 2. Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College, Weifang , China) 摇摇 Abstract: 摇 P46 protein, the immunodominance protein of Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), with no cross reaction with other mycoplasmas, is used as the target protein or gene for Mhp detection. The monoclonal antibody of P46 is more important for detection and pathogenic mechanism research of Mhp. In this study, the whole Mycoplasma hyopneumoniae protein was used as immunogen to immunize BALB / c mice for the preparation of monoclonal antibody. The P46 fusion pro 鄄 tein expressed in E. coli was used to screen the monoclonal antibody against this specific antigen. Two strains of hybridoma cells, 1A4 and 3G11 against P46 protein, were obtained through parallel screening with ELISA and Western blotting. And the strain 1A4 produced high ELISA titer of 1 颐 Two hybridoma cell lines could secrete highly efficient anti 鄄 P46 fu 鄄 sion protein antibody even after serial transfers or freezing 收稿日期 :2009 鄄 06 鄄 10 for three months. 基金项目 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ); 中国博士后基摇 Key words: 摇 Mycoplasma hyopneumoniae; P46; 金项目 ( ); 江苏省农业科技自主创新基金项 monoclonal antibody 目 [CX(08)608] 作者简介 : 冯志新 (1979 鄄 ), 男, 江苏无锡人, 博士研究生, 主要从事动物传染病防治研究 (E 鄄 mail)zhixinf2000@ yahoo. com. cn 摇摇猪肺炎支原体 ( Mycoplasma hyopneumoniae, 通讯作者 : 邵国青,(Tel)025 鄄 ;(E 鄄 mail) @ 163. com Mhp) 是猪气喘病 (MPS) 的主要病原体该病分布

2 冯志新等 : 猪肺炎支原体 P46 蛋白单克隆抗体制备 321 广泛, 发病率高, 虽死亡率不高, 但由于 Mhp 能破坏呼吸道黏膜鄄纤毛屏障, 从而继发其他致病菌的感染, 提高致死率此病在世界范围内广泛存在, 已造成巨大的经济损失由于猪肺炎支原体与其他的猪源支原体如猪鼻支原体絮状支原体和滑液支原体等存在很高几率的抗原交叉性, 给猪肺炎支原体的病原学与血清学检测造成一定的困难猪肺炎支原体各结构与功能蛋白研究结果表明, P46 蛋白为 Mhp 的表面抗原, 是引起早期免疫反应的表面脂蛋白, 也是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白, 且与其他支原体无交叉反应 [1] 因此,P46 蛋白可以作为建立 MPS 抗原抗体诊断方法的优选抗原本研究以纯化的猪肺炎支原体全菌蛋白作为免疫原, 以大肠杆菌表达的 Mhp P46 融合蛋白作为筛选抗原制备猪肺炎支原体 P46 蛋白的特异性单抗, 为下一步的诊断检测及致病机制研究提供基础 1 摇材料与方法 1. 1 摇猪肺炎支原体全菌抗原的准备猪肺炎支原体 168 株在无细胞培养基中生长至滴度为 1 伊 10 8 CFU / ml 将 100 ml 猪肺炎支原体培养物于 r / min 离心 30 min, 收集菌体用无菌 PBS 缓冲溶液 (ph 7 郾 6) 洗涤 3 次, 菌体重悬于 5 ml 无菌 PBS 缓冲液 (ph 7 郾 6) 中, 超声破碎后离心, 取上清即为免疫用抗原, 并用紫外分光光度法测定全菌蛋白浓度, 分装,-20 益保存备用 1. 2 摇猪肺炎支原体 P46 蛋白的制备 [2] 按迟灵芝等建立的方法, 用大肠杆菌原核表达猪肺炎支原体 P46 蛋白表达蛋白经 His Tag 亲和柱 ( MERCK 公司 ) 纯化后测定其浓度, 分装, -20 益保存备用 1. 3 摇 BALB / c 小鼠的免疫将纯化后的猪肺炎支原体全菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混合, 并充分乳化, 腹腔接种 8 周龄 BALB / c 小鼠 5 只 ( 每只接种量 100 滋 g) 2 周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原, 以后每 2 周注射 1 次抗原, 重复 3 次细胞融合前 5 d, 用加倍量不加佐剂的抗原 ( 每只接种量 200 滋 g) 同途径加强免疫 1 次, 即可进行细胞融合 1. 4 摇单克隆抗体筛选方法的建立以猪肺炎支原体 P46 融合表达蛋白为包被抗原, 按常规方法建立间接 ELISA 方法, 首先通过方阵滴定确定包被抗原用碳酸盐包被缓冲液 ( ph 9 郾 6) 将融合蛋白分别稀释至 1 滋 g / ml 5 滋 g / ml 10 滋 g / ml 20 滋 g / ml 30 滋 g / ml, 每孔 100 滋 l 包被 96 孔酶标板,4 益过夜 PBS 充分洗涤, 用含 1% BSA 的 PBST(PBS ph 7 郾 2,0 郾 05% Tween 鄄 20)4 益封闭过夜 PBST 洗涤 3 次, 每次 10 min 加入杂交瘤细胞培养上清, 每孔 100 滋 l,37 益作用 2 h 同时分别以多抗阳性血清阴性血清以及 PBS 做阳性阴性空白对照反应结束后 PBST 同上洗涤每孔加入 100 滋 l HRP 标记的山羊抗鼠 IgG(1 颐 )37 益作用 1 h 同上洗涤加入新鲜配置的 TMB 显色液避光显色, 待阴性对照孔将要显色时, 用 2 mol / L H 2 SO 4 终止反应测定 OD 450 值, 以 P / N 逸 2 郾 1 判为阳性 1. 5 摇细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的建立 [3] 按刘秀梵的方法进行脾细胞与 SP 2 / 0 细胞融合, 于 96 孔培养板中 37 益 CO 2 培养箱中培养当杂交瘤细胞的培养液开始变黄, 或杂交瘤细胞长满至孔底面积的 1 / 10 时, 吸取上清液, 经间接 ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞用有限稀释法对阳性孔连续 3 次亚克隆, 至所有单克隆孔均为阳性为止将最终获得的单克隆扩大培养后建株, 冻存 1. 6 摇单抗腹水的制备及效价测定按 Golding [4] 报道的方法进行取 12 周龄 BALB / c 小鼠腹腔注射灭菌石蜡油 ( 每只注射 0 郾 5 ml),7 d 后将生长状态良好的杂交瘤细胞, 以每只约 5 伊 10 5 个细胞腹腔注射 BALB / c 小鼠 7 d 左右小鼠腹部开始明显膨大, 反复抽取腹水, 以 r / min 离心 10 min 除去细胞成分和其他沉淀, 收集上清加入等体积的甘油, 分装,-70 益保存将腹水用 PBS 做 10 倍递增稀释, 分别以猪肺炎支原体全菌抗原和 P46 蛋白为包被抗原测单抗的 ELISA 效价 1. 7 摇单抗的 Western 鄄 blot 分析采用蛋白质技术手册方法 [5] 纯化的 P46 融合蛋白 350 ng 猪肺炎支原体全菌蛋白 10 滋 g 及阴性对照大肠杆菌菌体蛋白 10 滋 g 经 SDS 鄄 PAGE 电泳分离, 经半干式电转印装置稳流 90 min, 电转移至硝酸纤维素膜 ( NC 膜 ),NC 膜用含 5% 脱脂奶粉的 PBST 缓冲液 4 益封闭过夜 NC 膜与 2 滋 g / ml 的单抗腹水作用 2 h, 洗涤 3 次, 加入 1 颐稀释的 IRDye800 标记的羊抗鼠 IgG( ROCKLAND), 作用 1 h, 洗涤 3 次, 经扫描成像

3 322 江苏农业学报摇 2010 年第 26 卷第 2 期 1. 8 摇亚型鉴定单抗亚型鉴定按照亚型鉴定试剂盒 ( HYCULT Bio Co. ) 操作说明, 对以上试验中得到的单克隆抗体进行亚型鉴定 1. 9 摇阳性杂交瘤细胞株分泌单抗稳定性的测定将冻存 3 个月的阳性杂交瘤细胞复苏,24 孔细胞板培养, 检测上清是否呈阳性以判定复苏的阳性细胞是否有分泌抗体的能力将经过 3 次亚克隆的阳性率达到 100% 的杂交瘤细胞进行体外连续传代培养 3 个月, 每隔 2 周检测 1 次细胞上清 2. 3 摇单抗的 Western 鄄 blot 分析 2 株单抗的 Western 鄄 blot 鉴定结果 ( 图 2) 表明, 单抗 1A4 和 3G11 不仅能与 P46 蛋白发生特异性反应, 还均能与猪肺炎支原体全菌蛋白中左右的一蛋白发生反应 ;2 株单抗均不与大肠杆菌反应 2 摇结果 2. 1 摇免疫抗原与筛选抗原的准备猪肺炎支原体全菌抗原经浓缩纯化后溶于无菌 PBS 缓冲溶液 ( ph 7 郾 6 ) 中, 最终浓度调整为 5 mg / ml, 分装后于 -20 益保存, 用于小鼠免疫猪肺炎支原体 P46 表达蛋白经 His Tag 亲和柱纯化后, 测定浓度为 3 mg / ml 从 SDS 鄄 PAGE 电泳图谱可见,P46 蛋白经 His Tag 柱纯化后在约处获得单一目的蛋白条带, 条带清晰无杂带, 纯化效果较好 ( 图 1), 该蛋白用于单抗筛选 A: 单抗 1A4 株 ;B: 单抗 3G11 株 ;M: 蛋白标准 ;P46:P46 蛋白 ;E. coli: 大肠杆菌菌体蛋白 ;Mhp: 猪肺炎支原体全菌蛋白图 2 摇单抗 1A4 株和 3G11 株 Western-blot 检测结果 Fig. 2 摇 The Western 鄄 blotting analysis of the MAbs strains 1A4 and 3G 摇单抗亚型鉴定及腹水效价测定单克隆抗体的亚型鉴定结果表明,2 株单抗亚型均为 IgG2a 型, 且轻链均为资链 2 株单抗腹水分别以 20 滋 g / ml 的猪肺炎支原体全菌抗原和 5 滋 g / ml 的 P46 表达蛋白为包被原测定其效价结果 ( 表 1) 表明, 单抗 1A4 针对 P46 蛋白和全菌抗原的滴度分别为 1 颐和 1 颐 ; 单抗 3G11 针对 P46 蛋白和全菌抗原的滴度分别为 1 颐和 1 颐 M: 蛋白质分子量标准 ; 1: 纯化后的猪肺炎支原体 P46 蛋白图 1 摇猪肺炎支原体 P46 原核表达蛋白纯化后 SDS 鄄 PAGE 分析 Fig. 1 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of purified P46 protein of Mycoplas 鄄 ma hyopneumoniae expressed in E. coli 表 1 摇 2 株单抗腹水 ELISA 效价测定 Table 1 摇 The ELISA titers of two purified MAbs 1 mg / ml 纯化抗体 (mg / ml) 稀释度摇摇 1A4 3G11 P46 Mhp 全菌 P46 Mhp 全菌 OD 摇单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立以纯化的猪肺炎支原体全菌抗原为免疫原免疫 BALB / c 鼠, 融合的杂交瘤细胞经间接 ELISA 筛选阳性克隆, 对阳性孔进行 3 次亚克隆, 最终获得 2 株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株, 命名为 1A4 和 3G11 1 颐颐颐颐颐颐颐空白对照

4 冯志新等 : 猪肺炎支原体 P46 蛋白单克隆抗体制备摇融合细胞株分泌单抗的稳定性测定将冻存细胞株复苏后于 24 孔培养板中培养, 间接 ELISA 检测细胞上清, 结果 OD 值仍很高将细胞传代 3 个月, 每隔 2 周检测 1 次上清,OD 值稳定 3 摇讨论猪肺炎支原体是引起猪气喘病的主要病原, 它广泛分布于猪群由于猪肺炎支原体的抗原与猪体内的其他支原体如猪絮状支原体猪鼻支原体滑液支原体存在交叉反应 [6 鄄 8], 因此利用全菌体作为 ELISA 的诊断抗原检测血清样品也会有交叉反应 [9] P46 基因是编码 Mhp 细胞表面蛋白抗原的基因, 其抗原可引起 Mhp 感染猪早期特异性免疫反应 [1] 该基因具有种属特异性, 与其他猪支原体无抗原交叉反应性另外,P46 基因变化小, 不同毒株编码的氨基酸二级结构, 亲水性几乎无差异, 说明该基因在猪肺炎支原体种内是相当保守的根据猪肺炎支原体 P46 基因的特异性设计的引物用于 PCR 检测 [10] [11], 具有良好的特异性肖国生等以 P46 为靶基因, 建立了猪肺炎支原体的检测芯片, 具 [12] 有很好的特异性和敏感性 Satoshi 等利用大肠杆菌表达的猪肺炎支原体表面膜蛋白 P46 作为抗原建立 ELISA 方法, 具有很好的特异性和敏感性 [13] Cheikh 等制备抗猪肺炎支原体 P46 和 P65 蛋白的单克隆抗体, 建立 ELISA, 能特异性地鉴别诊断猪肺炎支原体多项研究均表明,P46 蛋白及其抗体能用于猪肺炎支原体与其他支原体的鉴别诊 [13 鄄断 15] [16] 在国内, 最初由孟书霞等制备了抗猪支原体共同抗原的单克隆抗体, 能用来检测细胞培养中的猪源支原体的污染, 但不能用于猪场中猪肺炎支原体感染情况的调查后来本实验室又分别制备了猪肺炎支原体 P97 和 P36 的单抗 [17 鄄 18], 但对于 P46 单抗的制备一直未开展本研究用猪肺炎支原体全菌抗原免疫 BALB / c 小鼠, 以大肠杆菌表达的 P46 融合蛋白作为检测抗原, 通过细胞融合技术并经过 3 次亚克隆共获得 2 株能稳定分泌抗猪肺炎支原体 P46 蛋白的杂交瘤细胞,2 株单抗腹水 ELISA 效价分别可达 1 颐和 1 颐 Western 鄄 blot 试验结果也证实 2 株单抗均有很好的特异性 2 株单抗均能同时与 P46 表达蛋白和全菌抗原中大小的蛋白发生反应, 而与大肠杆菌无反应以前我们曾同时用 P46 蛋白作为免疫原与筛选原来制备猪肺炎支原体单抗, 由于表达蛋白中不可避免地存在少量的大肠杆菌成份, 对制备出单抗的特异性存在影响 ; 另外由于原核表达可能会使表位构象发生改变, 用以前的方法制备的单抗可能不会与天然猪肺炎支原体蛋白发生特异性反应本研究中用全菌抗原作免疫原, 用纯化的 P46 蛋白作为筛选抗原, 不仅避免了大肠杆菌成份的干扰, 也保证了制备出的单抗能同时与猪肺炎支原体天然蛋白和 P46 表达蛋白发生特异性反应, 确保了单抗的实用性参考文献 : [1] 摇 FUTO S, SETO Y, MITSOSE S, et al. Molecular cloning of a 46 kd surface antigen ( P46) gene from Mycoplasma hyopneumoniae: direct evidence of CGG codon usage for argmine [J]. J Bacterial, 1995,177(7):1917 鄄 [2] 摇迟灵芝, 刘茂军, 冯志新, 等. 猪肺炎支原体 P46 基因的克隆及表达 [J]. 江苏农业学报,2008,24(3):288 鄄 292. [3] 摇刘秀梵. 单克隆抗体在农业上的应用 [ M]. 合肥 : 安徽科学技术出版社,1994:21 鄄 23,32 鄄 36. [4] 摇 GOLDING J W. Monoclonal antibodies: principles and practice [M]. London, New York: Academic Press, 1993:76 鄄 77. [5] 摇汪家政, 范摇明. 蛋白质技术手册 [ M]. 北京 : 科学出版社, 2002:166 鄄 184. [6] 摇 MEYLING A. Mycoplasma suipneumoniae and Mycoplasma hyorhi 鄄 nis denostrated in pneumoniae pig lungs by the fluorescent antibody technique [J]. Acta Vet Scan, 1971, 12:137 鄄 141. [7] 摇 ARMSTRONG C H, FREEMAN M I, SANDS 鄄 FREEMANN L, et al. Comparison of the enzyme linked immunosorbent assay and the indirect heamagylutionation and complement fixation tests for deter 鄄 ring antibodies to Mycoplasma hyopneumoniae [ J]. Can J Comp Med, 1983, 47: 464 鄄 470. [8] 摇 PIFER I A, YOUNG T F, PETENATE A, et al. Comparison of complement fixation test and enzyme linked immunosorbent assay for detection of early infection with Mycoplasma hyopneumoniae [J]. J Vet Res, 1984, 45:1122 鄄 [9] 摇 SHDDRAKE R F, GARDONER I A, SANNDERS M M, et al. Serum antibody response to Mycoplasma hyopnenmoniae measured by enzymed 鄄 linked immunosorbent assay for experimental and nat 鄄 ural fection of pigs [J]. Aust Vet J,1990,67:39 鄄 42. [10] CARON J, OUARDANI M, DEA M. Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopnenmoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes [ J]. Clin Microbiol, 2000,3(4):1390 鄄 [11] 肖国生, 曹三杰, 黄小波, 等. 猪肺炎支原体检测芯片的研制及初步应用 [J]. 中国预防兽医学报, 2008,30(1):57 鄄 63.

5 324 江苏农业学报摇 2010 年第 26 卷第 2 期 [12] SATOSHI F, YASULFIRO S, MUNEORI O, et al. Recombient 46 鄄 kilodalton surface antigen ( P46) of Mycoplasma hyopneumoni 鄄 ae expressed in Escherichia coli can be used for early specific diag 鄄 nosis of Mycoplasma pneumoniae of swine by enzyme 鄄 linked immu 鄄 nosorbent assay [J]. J Cline Micro, 1995, 33(3): 680 鄄 683. [13] CHEIKH S B K, SHAREEK F, DEA S. Monoclonal antibodies to Escherichia coli expressed P46 and P65 membranous proteins for specific imrnunodetection of Mycoplasma hyopneumoniae in lungs of infected pigs [ J]. Clin Diagn Lab Immuno1, 2003,10 (3 ): 459 鄄 468. [14] ASSUNC 魨 O P, DE LA F C, RAM 魱 REZ A S, et al. Protein and antigenic variability among Mycoplasma hyopneumoniae strains by SDS 鄄 PAGE and immunoblot [ J]. Vet Res Commun, 2005, 29 (7):563 鄄 574. [15] OKADA M, ASAI T, FUTO S, et al. Serological diagnosis of en 鄄 zootic pneumonia of swine by a double 鄄 sandwich enzyme 鄄 linked immunosorbent assay using a monoclonal antibody and recombinant antigen (P46) of Mycoplasma hyopneumoniae [ J]. Vet Microbi 鄄 ol, 2005, 105(3 鄄 4):251 鄄 259. [16] 孟书霞, 焦新安, 邵国青, 等. 抗猪支原体共同抗原单克隆抗体的制备与鉴定 [ J]. 中国预防兽医学报, 2003,25 ( 2 ): 127 鄄 131. [17] 苏摇锐, 邵国青, 张摇映. 猪肺炎支原体 P97 基因原核表达产物单抗的制备 [ J]. 中国人兽共患病杂志,2005, 21 (3 ): 202 鄄 205. [18] 胡茂志, 焦新安, 潘志明, 等. 抗猪肺炎支原体特异性 P36 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 [ J]. 中国兽医学报, 2006, 26 (6):619 鄄 621.