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稼郑
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1 江苏农业学报 (Jiangsu J. of Agr. Sci. ),2010,26(1):91 ~ 逯晓敏, 冯志新, 刘茂军, 等. 猪肺炎支原体套式 PCR 检测方法的建立及应用 [J]. 江苏农业学报,2010,26(1):91 鄄 95. 猪肺炎支原体套式 PCR 检测方法的建立及应用逯晓敏 1,2, 摇冯志新 1, 摇刘茂军 1, 摇吴叙苏 1, 摇甘摇源 1, 摇张摇映 2 1, 摇邵国青 (1. 江苏省农业科学院兽医研究所, 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室, 国家兽用生物制品工程技术研究中心, 江苏南京 ; 2. 山西农业大学动物科技学院, 山西太谷 ) 摇摇摘要 : 摇根据 GenBank 中登录的猪肺炎支原体 P36(L 鄄乳酸脱氢酶 ) 全基因序列, 设计合成了 2 对引物, 建立套式 PCR 方法运用该方法对猪肺炎支原体不同菌株培养物进行了扩增, 并对经肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后支气管肺泡灌洗液进行了检测结果表明, 不同菌种均能扩增出 427 bp 的目的条带, 而其他病原菌未出现特异性扩增条带建立的套式 PCR 方法检测猪肺炎支原体的最低检测限度为 10 个 CCU( 颜色变化单位 ) 支气管肺泡灌洗液检测结果表明, 经肺内免疫的猪支气管肺泡灌洗液扩增结果均为阳性关键词 : 摇猪肺炎支原体 ; P36; 套式 PCR 中图分类号 : 摇 S 摇摇摇文献标识码 : 摇 A 摇摇摇文章编号 : 摇 1000 鄄 4440(2010)01 鄄 0091 鄄 05 Establishment of A Nested PCR Assay for Detection of Mycoplasma hyo 鄄 pneumoniae LU Xiao 鄄 min 1,2, 摇 FENG Zhi 鄄 xin 1, 摇 LIU Mao 鄄 jun 1, 摇 WU Xu 鄄 su 1, 摇 GAN Yuan 1, 摇 ZHANG Ying 2, 摇 SHAO Guo 鄄 qing 1 (1. Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Animal Diseases Diagnostic and Immunology,Ministry of Agriculture,National Center for Engineering Research of Veterinary Bio 鄄 products,nanjing ,China; 2. College of Animal Science and Technology, Shanxi Agricultural University,Taigu ,China) 摇摇 Abstract: 摇 Two pairs of primers were designed according to the sequence of P36 (L 鄄 lactate dehydrogenase) gene of Mycoplasma hyopneumoniae published in GenBank,and a nested PCR assay was established for the detection of M. hyopneu 鄄 moniae. Different M. hyopneumoniae strains and the bronchoalveolar lavage fluid of intrapulmonic immunization with attenua 鄄 ted M. hyopneumoniae vaccine were detected with nested PCR. A specific 427 bp fragment was amplified from different M. hyopneumoniae strains by the developed nested PCR. Non 鄄 M. hyopneumoniae did not show specific amplified fragment. The nested PCR had high sensitivity to for detection of 10 CCU M. hyopneumoniae. The results of the bronchoalveolar lavage fluid detected by nested PCR showed that the amplified results was positive by intrapulmonic immunization. Key words: 摇 Mycoplasma hyopneumoniae; P36; nested PCR 摇摇猪支原体肺炎 ( Mycoplasma pneumoniae of swine,mps) 又称猪气喘病地方流行性肺炎, 是由猪肺炎支原体 ( Mycoplasma hyopneumoniae) 引起的收稿日期 :2009 鄄 09 鄄 18 基金项目 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ); 中国博士后基金项目 ( ); 江苏省农业科技自主创新基金项目 [CX(08)608] 作者简介 : 逯晓敏 (1982 鄄 ), 女, 山西大同人, 硕士研究生, 研究方向为病原微生物分子生物学 (E 鄄 mail)luxiaomin405@126. com 通讯作者 : 邵国青,(Tel)025 鄄 ;(E 鄄 mail) @ 163. com 一种以慢性的接触性传染病 [1] MPS 在世界各地广泛分布, 发病率高, 主要引起猪的生长受阻和饲料转换率的大幅下降, 是造成养猪业经济损失的最重要疾病之一 [2] M. hyopneumoniae 感染的病猪易遭受其他病原体的侵袭, 常因坏死性化脓性细菌的继发感染而死亡 [3] 因此, 对猪支原体肺炎正确诊断检测和及早防治非常重要摇摇目前 M. hyopneumoniae 的诊断主要方法有分离培养法免疫荧光法核酸探针法以及聚合酶链式反应 (PCR) 等 [4] 这些方法虽然可以对病原做出诊

2 92 江苏农业学报摇 2010 年第 26 卷第 1 期断, 但存在费时费力代价高敏感性和特异性不够理想等缺点本试验选取 M. hyopneumoniae 保守且特异性高的 P36(L 鄄乳酸脱氢酶 ) 基因, 建立 M. hyo 鄄 pneumoniae 检测的套式 PCR 方法以提高 M. hyo 鄄 pneumoniae 检测的特异性和敏感性 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇菌株及对照 DNA 材料摇摇 M. hyopneumoniae 168 株 M. hyopneumoniae J 株 M. hyopneumoniae 232 株 M. hyopneumoniae Z 株鸡毒支原体猪絮状支原体猪鼻支原体猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 ( APP) DNA 副猪嗜血杆菌 (HPs)DNA 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ( PRRSV) cdna 猪流感病毒 ( SIV ) 猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 猪伪狂犬病毒 ( PRV ) 猪链球菌 2 型 (SS 鄄 2) 的 DNA 或 cdna 均由江苏省农业科学院兽医研究所提供 1 郾 2 摇主要试剂与仪器摇摇 Taq DNA 聚合酶 (5 U / 滋 l) DL5000 marker 购自上海生兴生物技术有限公司 ;dntps(2 郾 5 mmol / L) 购自大连宝生物工程有限公司 ;Gold viewer 购自上海赛百盛基因技术有限公司 ; 琼脂糖为 Biowest 公司原装 ; 其他常规试剂均为分析纯产品 QB 鄄 96 型梯度 PCR 仪 ( 英国 Quanta Biotech 公司产品 );JS 鄄 380A 自动凝胶图像分析仪 ( 上海培清科技公司产品 );3K15 高速冷冻离心机 ( 德国 Sigma 公司产品 ) 1 郾 3 摇引物设计与合成摇摇根据 GenBank 登录的 M. hyopneumoniae P36(L 鄄乳酸脱氢酶 ) 全基因序列 ( AY312243), 利用 Primer 5 郾 0 软件设计合成了 2 对特异性引物, 其中外套引物 P1 P2 的扩增长度为 621 bp( 第 176 ~ 796 位 ), 内套引物 P3 P4 的扩增长度为 427 bp( 第 230 ~ 656 位 ) 引物序列如下 : P1: 5 忆鄄 TTAGTGTCTCCCGT 鄄 TATG 鄄 3 忆,P2:5 忆鄄 GAAATCCGTATTCTCCTC 鄄 3 忆,P3:5 忆鄄 TTACAGCGGGAAGACC 鄄 3 忆, P4: 5 忆鄄 CGGCGAGAAACT 鄄 GGATA 鄄 3 忆, 以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 1 郾 4 摇猪肺炎支原体的培养摇摇取 M. hyopneumonia 168 株菌种接种于 KM 2 液体培养基中, 按照 1 颐 10 接种,37 益培养至 ph 值降至 6 郾 6 ~ 6 郾 8, 即菌液颜色由红色变为黄色, 无沉淀即可收获培养物经镜检呈多形态, 无杂菌 1 郾 5 摇 PCR 模板制备摇摇取 1 ml M. hyopneumoniae 菌液或待检支气管肺泡灌洗液于离心管中, r / min 离心 30 min, 弃上清, 沉淀用无菌去离子水重悬 ;100 益水浴 10 min 后 r / min 离心 10 min; 收集上清, 即为 PCR 模板,-20 益保存备用 1 郾 6 摇套式 PCR 方法的建立 1 郾 6 郾 1 摇第 1 次 PCR 扩增摇反应体系为 25 郾 0 滋 l, 包含 10 伊 PCR buffer 2 郾 5 滋 l MgCl 2 (25 mmol / L) 2 郾 0 滋 l dntps(2 郾 5 mmol / L) 2 郾 0 滋 l Taq DNA 聚合酶 (5 U / 滋 l) 0 郾 2 滋 l 上下游引物(20 pmol / 滋 l) 各 0 郾 2 滋 l 模板 5 郾 0 滋 l, 加水补齐至 25 郾 0 滋 l 反应程序为 95 益预变性 5 min;95 益变性 30 s,42 益退火 30 s,72 益延伸 1 min,34 个循环 ;72 益 8 min 1 郾 6 郾 2 摇套式 PCR 扩增摇反应体系为 25 郾 0 滋 l, 包含 10 伊 PCR buffer 2 郾 5 滋 l MgCl 2 (25 mmol / L) 2 郾 0 滋 l dntps (2 郾 5 mmol / L) 2 郾 0 滋 l Taq DNA 聚合酶 (5 U/ 滋 l) 0 郾 2 滋 l 上下游引物 (20 pmol / 滋 l) 各 0 郾 2 滋 l 模板为第 1 次 PCR 扩增产物 1 郾 0 滋 l, 加水补齐至 25 郾 0 滋 l 反应程序为 95 益预变性 5 min;95 益变性 30 s,51 益退火 30 s,72 益延伸 30 s,34 个循环 ; 最后 72 益 8 min 1 郾 6 郾 3 摇特异性试验摇以 M. hyopneumoniae 基因组 DNA 为试验样本, 鸡毒支原体猪絮状支原体猪鼻支原体猪传染性胸膜肺炎放线杆菌副猪嗜血杆菌猪流感病毒猪圆环病毒 2 型猪伪狂犬病毒猪链球菌 2 型猪繁殖与呼吸综合征病毒等基因组 DNA 或 cdna 为对照样本进行套式 PCR 扩增, 同时设超纯水阴性对照, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳来确定该套式 PCR 反应体系的特异性 1 郾 6 郾 4 摇敏感性检测摇将 1 ml 10 7 CCU(Color change unit, 颜色变化单位 ) 的 M. hyopneumoniae 培养物于 r / min 离心 30 min, 弃上清, 菌体沉淀用 50 滋 l PBS 悬浮, 将此悬浮菌液按 10 倍梯度倍比稀释, 制成 45 滋 l 含 10 7 CCU 10 6 CCU 10 5 CCU 10 4 CCU 10 3 CCU 10 2 CCU 10 CCU 的 M. hyopneumoniae 的悬浮菌液 ;100 益水浴煮沸 10 min,8 000 r / min 离心 10 min, 取上清液 5 滋 l 作为模板进行套式 PCR 扩增, 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳确定该套式 PCR 反应体系的敏感性 1 郾 7 摇套式 PCR 的应用 1 郾 7 郾 1 摇运用套式 PCR 对不同菌株的 M. hyopneu 鄄 moniae 进行扩增摇运用建立的套式 PCR 方法分别

3 逯晓敏等:猪肺炎支原体套式 PCR 检测方法的建立及应用 93 对 M. hyopneumoniae J 株 M. hyopneumoniae 232 株 168 株中扩增出 427 bp 的单一条带,而鸡毒支原体 1郾 7郾 2摇运用套式 PCR 对支气管肺泡灌洗液进行检杆菌副猪嗜血杆菌猪流感病毒猪圆环病毒 2 型 M. hyopneumoniae Z 株进行扩增测摇采集经肺内免疫 M. hyopneumoniae 168 株弱毒活疫苗后的猪支气管肺泡灌洗液, 用建立的套式猪絮状支原体猪鼻支原体猪传染性胸膜肺炎放线猪伪狂犬病毒猪链球菌 2 型猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增结果均为阴性( 图 1) PCR 方法进行检测以正常健康未做免疫的猪支 2郾 2摇套式 PCR 的敏感性测定培养物作为阳性对照 10 4 CCU 10 3 CCU 10 2 CCU 10 CCU 的 M. hyopneu鄄气管肺泡灌洗液作为阴性对照,以 M. hyopneumoniae 分别从 50 滋l 含 10 7 CCU 10 6 CCU 10 5 CCU moniae 悬浮菌液模板中取 5 滋l 作为敏感性模板进 2摇结果行套式 PCR 扩增结果显示,套式 PCR 扩增的敏 2郾 1摇套式 PCR 的特异性测定摇摇采用建立的套式 PCR 方法从 M. hyopneumoniae 感性为 10 CCU( 图 2) M:DL5000 DNA marker; 1:猪肺炎支原体; 2:阴性对照(超纯水); 3:空白对照; 4:鸡毒支原体; 5:猪絮状支原体; 6:猪鼻支原体; 7:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌; 8:副猪嗜血杆菌; 9:猪流感病毒; 10:猪圆环病毒 2 型; 11:猪伪狂犬病毒; 12:猪链球菌 2 型; 13:猪繁殖与呼吸综合征病毒图 1摇套式 PCR 方法的特异性分析 Fig. 1摇 Specificity analysis of the nested PCR 2郾 3摇套式 PCR 的应用 2郾 3郾 1摇不同菌株的 M. hyopneumoniae 扩增摇运用建立的套式 PCR 方法分别对 M. hyopneumoniae J 株 M. hyopneumoniae 232 株 M. hyopneumoniae Z 株进行扩增结果(图 3)显示,不同菌株与 M. hyopneumoniae 168 株一样均能扩增出 427 bp 的目的片段 2郾 3郾 2摇支气管肺泡灌洗液检测摇应用建立的套式 PCR 方法对经肺内免疫 M. hyopneumoniae168 株活疫苗的支气管肺泡灌洗液进行检测结果( 图 4) 显示,经肺内免疫后采集的 3 份灌洗液样品均能扩增 M:DL5000 DNA marker; 1:106 CCU; 2:105 CCU; 3:104 CCU; 4:103 CCU; 5:10 CCU; 6:10 CCU; 7:1 CCU 2 摇摇摇图 2摇套式 PCR 方法的敏感性测定摇摇摇 Fig. 2摇 Sensitivity analysis of the nested PCR 出 427 bp 的目的片段;而未免疫猪的肺脏灌洗液扩增结果均为阴性 3摇讨论摇摇猪肺炎支原体可引起猪支原体肺炎,也称猪气

4 94 江苏农业学报摇 2010 年第 26 卷第 1 期 M:DL5000 DNA marker; 1: 猪肺炎支原体 168 株 ; 2: 猪肺炎支原体 J 株 ; 3: 猪肺炎支原体 232 株 ; 4: 猪肺炎支原体 Z 株 ; 5: 空白对照图 3 摇猪肺炎支原体不同菌株套式 PCR 扩增 Fig. 3 摇 Nested PCR detection results for different M. hyopneu 鄄 moniae strains 喘病, 此病是长期以来在猪场中难以净化的一种疾病尤其近年来研究发现, 猪肺炎支原体可与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 ( PRRSV) 及其他病原体混合感染, 使其感染的严重程度进一步提高, 造成养猪业的重大经济损失 [6] 因此, 及时准确地检测猪群中猪肺炎支原体的感染情况变得尤为重要目前, 用于检测猪肺炎支原体的方法主要包括分离培养法免疫荧光法核酸探针法和 PCR 法等传统分离培养法费时, 操作复杂, 对技术要求高, 除非在条件具备的实验室作特殊的诊断外, 一般不将分离培养作为病原诊断方法 ; 免疫荧光法适用于 M. hyo 鄄 pneumoniae 急性感染期检测, 此时患病猪肺内存在大量的病原但患病猪在受到抗生素治疗后或转为慢性感染时, 血清阳性猪支原体数量不足以用免疫荧光技术检出而易出现假阴性 ; 核酸探针法虽然简单灵敏, 但各种类型支原体之间常有交叉反应, 易 M:DL5000 DNA marker; 1 2 3: 肺内免疫后采集 3 头猪的肺脏灌洗液样品 ; :5 头未免疫健康猪肺脏灌洗液样品 ; 9: 猪肺炎支原体培养物 ; 10: 空白对照图 4 摇肺内免疫猪肺炎支原体活疫苗后支气管肺泡灌洗液套式 PCR 检测 Fig. 4 摇 Nested PCR detection results for the bronchoalveolar lavage fluid of intrapulmonic immunization with attenuated M. hyopneumoniae vaccine 出现假阳性, 影响试验的准确性 PCR 技术不但可以克服支原体培养难易产生交叉反应的缺点, 还具有敏感性高特异性强的特点普通 PCR 方法虽然操作简便但由于其检测的灵敏度有限, 极易出现假阴性, 影响对猪群感染情况的客观判断近年来发展迅速的实时荧光定量 PCR 方法, 虽然其敏感性非常好且能有效避免污染, 但由于需要昂贵的试验器材及试剂, 且对实验室环境要求高以及在检测时易出现假阳性等缺点而难以推广应用套式 PCR 方法与其他 PCR 方法相比, 具有灵敏度高特异性好且经济易于推广等诸多优点因此, 套式 PCR 方法用于猪肺炎支原体检测具有非常高的应用价值 [7] 摇摇本研究基于猪肺炎支原体特异性 P36 基因建立套式 PCR 方法, 该方法能够特异性检测猪肺炎支原体, 扩增出 427 bp 的特异性片段, 而其他种类的支原体 ( 鸡毒支原体猪絮状支原体猪鼻支原体 )

5 逯晓敏等 : 猪肺炎支原体套式 PCR 检测方法的建立及应用 95 细菌 ( 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌副猪嗜血杆菌猪链球菌 2 型 ) 以及病毒 ( 猪流感病毒猪圆环病毒 2 型猪伪狂犬病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 ) 的扩增结果均为阴性, 表明该方法具有良好的特异性 [8] 摇摇贾丽艳等建立的兽用疫苗中检测猪肺炎支原体的套式 PCR 方法, 最低可检测到 0 郾 97 pg / ml 浓 [9] 度的 DNA;Maria 等建立的检测猪肺炎支原体的套式 PCR 方法, 最低大约能检测出 80 个猪肺炎支 [10 鄄 11] 原体 ;Verdin 等建立的检测猪支气管灌洗液中猪肺炎支原体的套式 PCR 方法, 最低能检测出 5 ~ 50 个猪肺炎支原体 ; 本研究建立的套式 PCR 方法对猪肺炎支原体检测的敏感性和特异性有了进一步提高, 最低可以检测出大约 10 CCU 猪肺炎支原体本研究设计的测定套式 PCR 敏感性方法是基于实际操作, 已经将提取 PCR 模板过程中的损耗计算在内, 因此本方法更具有实际意义, 更具有良好的临床应用价值 [12 鄄 14] 摇摇本研究用建立的套式 PCR 方法成功地对经肺内免疫猪肺炎支原体 (168 株 ) 活疫苗后支气管肺泡灌洗液中疫苗株进行检测, 表明该方法不仅可以用于猪肺炎支原体的临床诊断, 而且可用于监测疫苗免疫效果本研究只选择了肺脏灌洗液作为检测样品, 但我们正在研究将该方法运用于对肺组织或鼻拭子等其他样品的检测, 以提高本方法的检测范围和可行性参考文献 : [1] 摇张锋钢, 沈志强, 高云英, 等. 猪肺炎支原体的分离及 PCR 鉴定 [J]. 中国兽医杂志,2007,43(4):21 鄄 23. [2] 摇吴移谋, 叶元康. 支原体学 [ M]. 2 版. 北京 : 人民卫生出版社, 2008:203 鄄 208. [3] 摇辛九庆, 王摇亮, 乔祖建, 等. 猪呼吸系统综合征病原与免疫 [J]. 畜牧兽医科技信息,2007(2):8 鄄 12. [4] 摇刘茂军, 张摇映. 霉形体检测技术简介 [ J]. 中国兽医科技, 2002,32(3):41 鄄 43. [5] 摇刘茂军, 李冬梅, 邵国青, 等. 猪肺炎支原体 PCR 鉴定方法的建立 [J]. 金陵科技学院学报,2008,24(3):99 鄄 101. [6] 摇 DOMINIEK. Interaction of M. hyopneumoniae with other pathogen [J]. Pig Progress,2005,21(6):18 鄄 20. [7] 摇李彦明, 张摇映. 套式 PCR 在支原体检测中的应用 [ J]. 中国预防兽医学报,2005,27(3):237 鄄 241. [8] 摇贾丽艳, 李彦明, 张摇映. 兽用疫苗支原体污染的 PCR 检测技术的建立及应用 [J]. 动物医学进展,2005,26(6):55 鄄 58. [9] 摇 MARIA C,CARLOS P,ALICIA T. Application of a nested poly 鄄 merase chain reaction assay to detect Mycoplasma hyopneumoniae from nasal swabs[j]. Vet Diagn Invest,1999,11:246 鄄 251. [10] VERDIN E,KOBISCH M,BOVE J M,et al. Use of an internal con 鄄 trol in a nested 鄄 PCR assay for Mycoplasma hyopneumoniae detec 鄄 tion and quantification in tracheobronchiolar washings from pigs [J]. Molecular and Cellular Probes,2000,14:365 鄄 372. [11] VERDIN E,SAILLARD C,LABBE A,et al. A nested PCR assay for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in tracheobronchio 鄄 lar washings from pigs[ J]. Veterinary Microbiology,2000,76:31 鄄 40. [12] KATHARINA D C,NICOLET J FREY J. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae by air sampling with a nested PCR assay[ J]. Ap 鄄 plied and Environmental Microbiology,1998,2:543 鄄 548. [13] KATHY T K,TSUNGDA H,ERIC R S,et al. Use of a Mycoplasma hyopneumoniae nested polymerase chain reaction test to determine the optimal sampling sites in swine[ J]. Vet Diagn Invest,2002, 14:463 鄄 469. [14] YUKIKO O,TETSUO A,MUNENORI O,et al. Detection of Myco 鄄 plasma hyopneumoniae in lung and nasal swab samples from pigs by nested PCR and culture methods[ J]. J Vet Med Sci,2005,67 (8):801 鄄 805.

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,