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堂娠蒉
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1 962 中国人兽共患病学报 ChineseJournalofZoonoses 2017,33 (11) DOI: /j.issn 论著 1 株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定田瑞雨 1,4, 熊祺琰 1, 倪博 1, 王佳 1,2, 韦艳娜 1, 冯志新 1, 邵国青 1,3 摘要 : 目的制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体, 用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究. 方法将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠, 利用杂交瘤技术制备单克隆抗体. 鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价特异性进行鉴定. 将该单抗用于菌落免疫杂交试验间接免疫荧光试验. 结果获得了 1 株猪鼻支原体单抗, 命名为 MhrG08. 该单抗的亚型属于 IgG1, 轻链为 κ 型.ELISA 测定该纯化单抗效价为 ,WesternGblot 检测结果表明, 该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在 43kDa 处出现特异性反应条带, 与猪其他支原体大肠杆菌及 KM2 培养基无交叉反应 ; 该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体, 可成功应用于菌落免疫杂交试验 ; 将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体. 结论成功制备和鉴定出 1 株猪鼻支原体单克隆抗体, 该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断及致病机理的研究提供了工具. 关键词 : 猪鼻支原体 ; 单克隆抗体 ; 特异性中图分类号 :R375 文献标识码 :A 文章编号 : (2017) Preparationandidentificationofamonoclonalantibody againstmycoplasmahyorhinis TIAN RuiGyu 1,4,XIONG QiGyan 1,NIBo 1,WANGJia 1,2, WEIYanGna 1,FENGZhiGxin 1,SHAO GuoGqing 1,3 (1.InstituteofVeterinary Medicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/ KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnology,MinistryofAgriculture/National CenterforEngineeringResearchofVeterinaryBioGproducts,Nanjing210014,China; 2.KeyLaboratoryofFoodQualityandSafetyofJiangsuProvinceGStateKeyLaboratoryBreedingBase, Nanjing210014,China; 3.JiangsuColaborativeInnovationCenterforMeatProduction,ProcesingandQualityControl, Nanjing210095,China; 4.ColegeofVeterinary Medicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:Theaimofthisstudywastoproducea monoclonalantibodyagainstmycoplasmahyorhinis,which wouldbe usefulinthediagnosisandpathogenesisresearchesofm.hyorhinis.balb/cmicewereimmunizedwithwholecelproteinof M.hyorhinis,andthenthemonoclonalantibody(McAb)waspreparedbyhybridomatechnique.TheisotypeoftheMcAbwas identified,andthenthetiterandspecificitywereanalyzed.theprepared McAbwasusedtodetectM.hyorhinisinthecolony immunoboltingassayandindirectimmunofluorescenceassay.a hybridomacellinewasobtained,and wasnamed MhrG08. TheMcAbbelongedtoIgG1isotype,andthelightchainwasκtype.Thetiterwasdetectedtobe byELISA.The resultofwesterngblotindicatedthatthismcabstronglyreacg 国家重点研发计划 (No.2016YFD ) tedtoa43kdaproteinofm.hyorhinis,withoutcrossgreacg 通讯作者 : 邵国青, gqshaonj@163.com; tionwithotherswinemycoplasmas,escherichiacoliorkm2 熊祺琰, qiyanxiongnj@163.com medium.itrevealedthatthemcabrecognizedasurfacememg 作者单位 :1. 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品 braneproteinandwassuccessfulyappliedtodetectm.hyog 工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研 rhinis in colony immunobolting assay.the mycoplasmas 究中心, 南京 ; 2. 省部共建国家重点实验室培育基地 - 江苏省食品质量 boundtothetrachealepithelialcelswassuccessfulydetected 安全重点实验室, 南京 ; byusingthis McAbinindirectimmunofluorescenceassay.In 3. 江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心, 南 conclusion,a McAbagainst M.hyorhinis wassuccessfuly 京 ; prepared,whichprovidesasausefultoolforthediagnosisand 4. 南京农业大学动物医学院, 南京 pathogenesisresearches.

2 11 期田瑞雨等 :1 株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定 963 Keywords:Mycoplasmahyorhinis;monoclonalantibody;specificity SupportedbytheNationalKeyResearchandDevelopmentPlan(No.2016YFD ) 猪鼻支原体 (Mycoplasmahyorhinis) 是猪呼吸道中存在的一种常见病原菌 [1], 可引起猪的关节炎结膜炎中耳炎咽鼓管炎及肺炎等多种慢性炎症 [2G7], 通常由母猪或大猪经呼吸道传染给小猪, 进而从呼吸道侵染全身引发疾病的发生. 猪鼻支原体也是实验室细胞培养物的常见污染物 [8], 同时近年来研究者发现猪鼻支原体与人胃癌大肠癌有高度相关性, 并已经从胃癌组织中直接分离到了猪鼻支原体 [9], 而且 Namiki 等人发现猪鼻支原体可诱导肿瘤细胞恶性程度增加 [8],Duan 等人发现它还可以促进肿瘤细胞迁移 [10]. 高敏感及高特异性的诊断方法对疾病控制具有重要意义. 目前, 猪鼻支原体的实验室诊断方法主要包括病原的分离与鉴定双抗体夹心 ELISA 间接免疫荧光试验胶体金免疫层析法 PCR 方法等 [11G12], 其中免疫学试验中所用抗体的质量直接影响检测效果. 猪的不同支原体之间存在许多交叉抗原, 针对猪鼻支原体特异性单克隆抗体可为该病诊断方法的建立提供重要工具. 因此, 本研究制备获得 1 株特异性单抗, 可为猪鼻支原体特异性检测方法的建立提供工具, 同时也为猪鼻支原体致病机理的研究提供重要材料. 1 材料与方法 1.1 主要材料和试剂猪鼻支原体由本实验室分 [13] 离,PCR 鉴定并保存 ; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司 ; 弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂聚乙二醇 (PEG4000) 购自 Sigma 公司 ;HRP FITC 标记的羊抗鼠二抗均购自武汉博士德生物工程公司 ; 亚型鉴定试剂盒购自 proteintech 公司 ; 其他试剂均为分析纯等级. 1.2 猪鼻支原体全菌抗原的制备猪鼻支原体在 KM2 无细胞培养基中生长至对数期, 将培养物于 12000r/min 离心 30 min 收集菌体. 用无菌 PBS 缓冲溶液洗涤 3 次后, 将菌体重悬于 PBS 缓冲液中, 以 55% 功率, 超声 3s, 暂停 5s, 超声破碎 5 min 即为免疫用抗原,BCA 试剂盒测定蛋白浓度, 分装, -20 保存备用. 1.3 BALB/c 小鼠的免疫将猪鼻支原体全菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混合, 并充分乳化, 皮下多点注射接种 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠 10 只 ( 每只接种量 25μg).4 周后皮下注射弗氏不完全佐剂处理的抗原 ( 佐剂与抗原 1 1 乳化 ),25μg/ 只接种.4 周后腹腔注射等量生理盐水混合的抗原, 细胞融合前 3d, 用等量不加佐剂的抗原直接加强免疫 1 次, 即可进行细胞融合. 1.4 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立按常规方法, 将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合, 于 96 孔细胞板中进行培养. 细胞融合后第 7d, 培养板孔底长出肉眼可见的克隆, 吸取上清液, 经间接 ELISA 方法 ( 见 1.7) 筛选只与猪鼻支原体反应而不与猪肺炎支原体猪滑液支原体絮状支原体反应的阳性杂交瘤细胞. 采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞, 转移至 96 孔板培养, 经过数次克隆化操作, 直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为 100% 时, 即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株. 将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养, 冻存. 1.5 腹水的制备及单克隆抗体的纯化取 6 周龄健康雌性小鼠, 腹腔注射 0.5 ml 液体石蜡致敏, 一到两周后, 每只小鼠腹腔注射 1~ 个杂交瘤细胞, 观察小鼠状态.7~10d 后待小鼠腹腔明显膨大后收集腹水, 离心取上清液即为腹水. 以饱和硫酸铵法纯化单克隆抗体. 1.6 单抗类型及亚型鉴定应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行测定. 1.7 间接 ELISA 测定纯化抗体效价将猪鼻支原体全菌蛋白以 10μg/mL 包被于 ELISA 反应板, 用含 5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 PBS 封闭, 将该单克隆抗体及鼠阴性血清对照用封闭液从开始做 2 倍递增稀释,37 作用 1h, 洗涤后加入稀释的 HRPG 羊抗鼠 IgG, 作用 30 min 后洗涤 3 次,TMB 显色 10min, 酶标仪测定 OD nm 值. 1.8 单抗特异性鉴定利用 WesternGblot 方法对该单抗的特异性进行鉴定, 按照常规方法进行. 将猪鼻支原体猪肺炎支原体絮状支原体猪滑液支原体及大肠杆菌全菌蛋白每种 15μg 进行 SDSG PAGE 电泳分离, 经半干式电转印装置恒压 15V 转印 20min 电转移至硝酸纤维素膜 (PVDF 膜 ), 用含 3% BSA 的 PBS37 封闭 2h,TBST 洗涤后, 以该

3 964 中国人兽共患病学报 2017,33(11) 纯化单抗 ( 稀释 )4 过夜孵育. 洗涤后加入稀释的 HRP- 羊抗鼠 IgG, 作用 1h 后洗涤 3 次,ECL 显色拍照. 1.9 单抗与膜蛋白的反应性鉴定支原体膜蛋白的提取将猪鼻支原体菌液 300mL12000r/min,4, 离心 30 min, 收集菌体沉淀. 菌体沉淀用无菌 PBS 反复洗涤 3 次, 离心弃上清. 向沉淀内加入 3 mlpbs 混匀, 重悬液放置 -70 冻存. 取冻存的猪鼻支原体重悬液测定蛋白浓度, 将蛋白浓度调整至 2 mg/ml, 加入等体积含 2% 的吐温的 PBS, 混匀后,37 孵育 90 min, 超速离心机 50000g 离心 1h, 取上清 0.22μm 滤器过滤即猪鼻支原体膜蛋白, 分装 -70 保存备用 WesternGblot 检测纯化单抗与膜蛋白反应性按照 1.8 方法, 将猪鼻支原体全菌蛋白及膜蛋白同时进行 WesternGblot 鉴定, 确定该单抗的目的蛋白是否属于膜蛋白菌落免疫杂交试验将猪鼻支原体菌液以 KM2 培养基稀释 1000 倍, 取 100μL 稀释后菌液涂布固体平板, 大约 1 周后支原体在平板上长出单菌落, 将 PVDF 膜放在菌落上, 稍用力按压 5 min, 然后将膜取下晾干, 以 3% BSA 的 PBS37 封闭 2 h.tst 洗涤 3 次后加入猪鼻支原体单抗 (1 200 稀释 ),4 过夜 ; 洗涤后加入 HRP 标记的羊抗鼠二抗 ( 稀释 ),37 作用 1h, 洗涤后,ECL 显色间接免疫荧光鉴定试验将猪鼻支原体按照 10 7 CCU/mL 接种于猪气管上皮细胞,1 ml/ 孔,37 粘附 6h,PBS 洗涤 3 次后, 以 4% 多聚甲醛固定 15min; 洗涤 3 次后加入含 0.2% TritonXG100 的 PBS 透化处理 3 min, 洗涤后以 5% BSA 封闭 30 min, 加入待鉴定的单抗,4 过夜 ; 洗涤后加入 FITC 标记的羊抗小鼠二抗,37 作用 1h, 洗涤后于荧光显微镜下观察. 2 结果 2.1 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立以洗涤的猪鼻支原体全菌抗原为免疫原免疫小鼠, 融合的杂交瘤细胞经间接 ELISA 筛选阳性克隆, 对阳性孔进行 3 次亚克隆, 最终获得 1 株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株, 命名为 MhrG 亚型鉴定该特异性单抗在酶标板的 G1 和 κ 孔呈阳性,OD450 值最高, 其余孔不显色, 表明该单抗的亚型属于 IgG1, 轻链为 κ 型 ( 见表 1) 表 1 纯化的 MhrG08 单抗亚型鉴定结果 Tab.1 Subtypeidentificationofthepurifiedmonoclonalantibody IgA IgM IgG1 IgG2aIgG2b IgG3 κ λ OD 纯化抗体效价测定经 ELISA 检测方法检测, 选择 P/N 值 2 的最大稀释度为该单抗 ELISA 的效价, 因此判定该单抗效价为 ( 见表 2). 表 2 纯化的 MhrG08 单抗 ELISA 效价 Tab.2 TheELISAtiterofthepurifiedmonoclonalantibody 抗体稀释度 (Dilutionmultiple oftheantibody) 猪鼻支原体单抗 (Monoclonal antibodyagainst M.hyorhinis) 鼠阴性血清 (Micenegative serum) 抗体稀释度 (Dilutionmultiple oftheantibody) 猪鼻支原体单抗 (Monoclonal antibodyagainst M.hyorhinis) 鼠阴性血清 (Micenegative serum) OD nm OD nm 单抗特异性鉴定将猪鼻支原体猪肺炎支原体絮状支原体猪滑液支原体及大肠杆菌全菌蛋白及 KM2 培养基分别进行 SDSGPAGE( 图 1A), 并用该猪鼻支原体单抗做 WesternGblot 鉴定, 得出该单

11 期田瑞雨等 :1 株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定 965 抗与猪鼻支原体全菌蛋白在 43kDa 左右有特异性条带, 且与其他支原体无交叉反应 ( 图 1B). M:Proteinmolecularweightstandard;1:M.hyorhinis;2:M. hyopneumoiae;3:m.flocculare;4:m.

1 SpecificityidentificationofM.hyorhinis monog clonalantibody 2.5 单抗与猪鼻支原体膜蛋白反应将猪鼻支原体全菌蛋白及膜蛋白同时进行 SDSGPAGE 电泳, 转印后用该单抗孵育, 可以看到膜蛋白与全菌蛋白一样在 43kDa 处出现特异性条带. 说明该单抗目的蛋白为猪鼻支原体膜蛋白.

3 Colonyimmunobindingwiththeprepared monog clonalantibody(arowindicatesthepositivecolony) 上皮细胞孵育 6h, 洗去未结合支原体, 加入该单抗检测黏附细胞的猪鼻支原体, 结果显示出现特异性荧光, 未感染支原体的阴性对照细胞无荧光, 说明该单抗可特异性检测猪鼻支原体, 如图 4.

4 Indirectimmunofluorescencedetectionof MycoG plasmahyorhinisadhesiontoswinetrachealepig thelialcelswiththeprepared monoclonalantig body(400 )

4 11 期田瑞雨等 :1 株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定 965 抗与猪鼻支原体全菌蛋白在 43kDa 左右有特异性条带, 且与其他支原体无交叉反应 ( 图 1B). M:Proteinmolecularweightstandard;1:M.hyorhinis;2:M. hyopneumoiae;3:m.flocculare;4:m.hyosynoviae;5:e. coli;6:km2medium A:SDSGPAGEofthewholebacteriaprotein;B:WesternGblot identificationofspecificityofthepreparedmonoclonalantibody 图 1 猪鼻支原体单抗特异性鉴定 Fig.1 SpecificityidentificationofM.hyorhinis monog clonalantibody 2.5 单抗与猪鼻支原体膜蛋白反应将猪鼻支原体全菌蛋白及膜蛋白同时进行 SDSGPAGE 电泳, 转印后用该单抗孵育, 可以看到膜蛋白与全菌蛋白一样在 43kDa 处出现特异性条带. 说明该单抗目的蛋白为猪鼻支原体膜蛋白. 图 3 单抗用于菌落免疫杂交检测 ( 箭头表示阳性杂交菌落 ) Fig.3 Colonyimmunobindingwiththeprepared monog clonalantibody(arowindicatesthepositivecolony) 上皮细胞孵育 6h, 洗去未结合支原体, 加入该单抗检测黏附细胞的猪鼻支原体, 结果显示出现特异性荧光, 未感染支原体的阴性对照细胞无荧光, 说明该单抗可特异性检测猪鼻支原体, 如图 4. A:Negativecontrol;B:CytoadhesionofMycoplasmahyorhiG nis 图 4 单抗用于间接免疫荧光检测猪鼻支原体黏附猪气管上皮细胞 (400 ) Fig.4 Indirectimmunofluorescencedetectionof MycoG plasmahyorhinisadhesiontoswinetrachealepig thelialcelswiththeprepared monoclonalantig body(400 ) M:Proteinmolecularweightstandard;1:thewholeM.hyorhinis protein;2:m.hyorhinis membraneprotein. 图 2 单抗与猪鼻支原体膜蛋白反应 Fig.2 Reactionoftheprepared monoclonalantibodyto Mycoplasmahyorhinis membraneprotein 2.6 菌落免疫杂交该单抗与转移到 PVDF 膜上的猪鼻支原体菌落出现特异性反应, 如图间接免疫荧光鉴定将猪鼻支原体与猪气管 3 讨论猪鼻支原体在猪场感染率极高, 常与猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒 2 型等病原混合感染, 造成严重的猪呼吸道综合征, 致使断奶仔猪的死亡率显著升高, 给我国养猪业的发展造成巨大的经济 [14G15] 损失. 此外, 猪鼻支原体还与多种人类肿瘤的发生有关, 属于人兽共患性病原体. 目前, 猪鼻支原体病的诊断技术尚不完善, 也没有商业化的试剂盒, 研制高特异性高灵敏度的抗体对诊断具有重要意义, 同时也是该病的致病机理研究的必要工具. 通过大肠杆菌原核表达系统表达蛋白免疫小鼠

5 966 中国人兽共患病学报 2017,33(11) 是制备单克隆抗体的常用方法, 但是由于对猪鼻支原体表面蛋白的了解十分有限, 本实验利用超声波裂解破碎的猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠制备单抗. 由于支原体体外培养对营养要求复杂, 需要在培养基中加入血清提供支原体生长所需要的营养成分, 为排除血清干扰, 本研究制备抗原时, 利用 PBS 将抗原离心洗涤 3 次, 将支原体充分洗涤干净, 避免产生针对血清的单抗. 猪的不同支原体之间存在许多交叉抗原, 比较基因组学分析发现猪肺炎支原体猪鼻支原体和絮状支原体之间共同编码序列占总数的 58.9% 以 [16] 上. 为获得只针对猪鼻支原体的特异性单抗, 在杂交瘤细胞株筛选的过程中, 以猪鼻支原体全菌蛋白为包被抗原, 同时将猪肺炎支原体絮状支原体猪滑液支原体的全菌蛋白作为对照, 筛选仅与猪鼻支原体反应的细胞. 最终制备的单抗纯化后再次经 WesternGblot 鉴定, 证明与猪其他支原体大肠杆菌及 KM2 培养基均无交叉反应, 为猪鼻支原体特异性单抗. 支原体缺乏细胞壁, 菌体外层由细胞膜构成, 细胞膜表面的膜脂蛋白是支原体与宿主互作的关键成份, 也是诊断技术和疫苗研制的重要靶标. 本试验获得的单克隆抗体可以有效地和猪鼻支原体表面膜蛋白结合, 菌落免疫杂交结果同样也证实其可以有效结合猪鼻支原体表面, 膜抗原单抗的获得对于猪鼻支原体致病机制和诊断技术研究而言有重要帮助. 本研究成功制备了 1 株针对猪鼻支原体的单克隆抗体,WesternGblot 证明, 该单抗特异性好, 仅与猪鼻支原体反应, 与猪其他支原体及培养基不反应, 且为猪鼻支原体的膜蛋白抗体, 成功应用于菌落免疫杂交间接免疫荧光等试验, 该单抗的获得为猪鼻支原体病原诊断致病机理的研究提供了实用工具. 参考文献 : [1]LuCP.Veterinarymicrobiology[M].Beijing:ChinaAgriculture Press,2013:236.(inChinese) 陆承平. 兽医微生物学 [M]. 北京 : 中国农业出版社,2013:236. [2]DuncanJR,RossRF.ExperimentalyinducedMycoplasmahyoG rhinisarthritisofswine:pathologicresponseto26thpostinocug lationweek[j].amjvetres,1973,34 (3):363G366. [3]FrisNF.AserologicvariantofMycoplasmahyorhinisrecovG eredfromtheconjunctivaofswine[j].actavetscand,1976, 17 (3):343G353. [4]GoisM,KuksaF.Intranasalinfectionofgnotobioticpigletswith Mycoplasmahyorhinis:diferencesinvirulenceofthestrains andinfluenceofageonthedevelopmentofinfection[j].zentralg blveterinarmedb,1974,21 (5):352G361. [5]LinJH,ChenSP,Yeh KS,etal.Mycoplasmahyorhinisin Taiwan:diagnosisandisolationofswinepneumoniapathogen [J].VetMicrobiol,2006,115 (1G3):111G116.DOI: /j. vetmic [6]MoritaT,FukudaH,AwakuraT,etal.DemonstrationofMyG coplasmahyorhinisasapossibleprimarypathogenforporcine otitismedia[j].vetpathol,1995,32 (2):107G111.DOI: / [7]MoritaT,OhiwaS,ShimadaA,etal.Intranasalyinoculated Mycoplasmahyorhinis causes eustachitis in pigs [J].Vet Pathol,1999,36 (2):174G178.DOI: /vp.36G2G174 [8]NamikiK,GoodisonS,PorvasnikS,etal.Persistentexposure to Mycoplasma induces malignanttransformation of human prostatecels[j].plosone,2009,4(9):e6872.doi: / journal.pone [9]MaHC,MaH,ZhangYL,etal.Detectionandconfirmationof MycoplasmahyorhinisingastriccarcinomaspecimensbyculG tureandpcr[j].chinjzoonoses,2003,19(2):31g33.(inchig nese) 马华崇, 马泓, 张艳丽, 等. 胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定 [J]. 中国人兽共患病杂志,2003,19(2):31G33. [10]Duan H,QuL,ShouC.PersistentexposuretoMycoplasma induces malignanttransformationofhumanprostatecels[j]. CancerCelInt,2014,14(1):135.DOI: /journal. pone [11]BaiFF,WuYZ,Jin MMetal.Establishmentandapplication ofnestedpcr assayfordetectionofmycoplasmahyorhinis [J].ChinJVetSci,2013,33(7):1007G1010.(inChinese) 白方方, 武昱孜, 靳蒙蒙, 等. 巢式 PCR 检测猪鼻支原体方法的建立及应用 [J]. 中国兽医学报,2013,33(7):1007G1010. [12]Wang T,Zhao ML,Sun WD.EstablishmentofindirectheG magglutinationandelisafordetectionofmycoplasmahyog rhinis[j].chinlivestockpoultbreed,2012,11:31g33.(inchig nese) 王涛, 赵满丽, 孙卫东. 猪鼻支原体间接血凝及 ELISA 检测方法的初步建立 [J]. 中国畜禽种业,2012,11:31G33. [13]MaingiJW,XiongQD,WeiYN,etal.Detectionofrespiratory pathogensmycoplasmahyorhinisand MycoplasmahyopneuG moniaefrom clinicalyinfectedporcineusing nested PCRin JiangsuProvince,China[J].ChinJZoonoses,2014,30(8). DOI: /cjz.j.issn.1002G [14]LeeJA,OhY,HwangMA,etal.Mycoplasmahyorhinisisa potentialpathogenofporcinerespiratorydiseasecomplexthat aggravatespneumoniacausedbyporcinereproductiveandreg spiratorysyndromevirus[j].vetimmunolimmunopathol, 2016,177:48G51.DOI: /j.vetimm [15]Chen DJ.StudiesonsynergeticpathogenicityofcoGinfection withporcinecircovirustype2andmycoplasmahyorhinis[d]. Beijing:ChinAcadem AgriculSci,2015.(inChinese) 陈冬杰. 猪圆环病毒 2 型与猪鼻支原体共感染协同致病性研究 [D]. 北京 : 中国农业科学院,2015. [16]SiqueiraFM,ThompsonCE,VirginioVG,etal.Newinsights onthebiologyofswinerespiratorytractmycoplasmasfrom a comparativegenomeanalysis[j].bmc Genomics,2013,14: 175.DOI: /1471G2164G14G175 收稿日期 :2017G04G17 编辑 : 王晓欢

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人