2 仪器与耗材仪器 Thermo Scientific TM Dionex TM Chromeleon TM version 7.2 Thermo Scientific TM Trace 1310-ISQ, SSL 进样口 Thermo Scientific TM Triplus RSH 三合一自动

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1 Triplus-RSH-GC-ISQ 在线衍生法测定奶制品中的三聚氰胺三聚氰酸残留刘茜余天赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 Application Notes_C_GCMS-37 关键词饲料 ; 三聚氰胺 ; 三聚氰酸 ; 在线衍生 ;Triplus RSH ;GC-ISQ 目标采用 Triplus-RSH 在线衍生化法完成对三聚氰胺三聚氰酸的衍生,, 从而对奶制品中的三聚氰胺三聚氰酸进行分析, 本方法采用在线自动衍生法, 实验中衍生介质为吡啶, 其毒性大有恶臭味, 通过自动衍生可减少操作人员的接触, 提高工作效率, 同时仪器的操作可以更准确定量通过将三聚氰胺三聚氰酸衍生后采用 GCMS 法测定, 测定结果准确灵敏度高, 是一种高效的检测奶制品中三聚氰胺三聚氰酸的手段引言三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料, 常被用于生产塑料脱水阻燃剂等, 也有用于化肥中三聚氰酸, 与三聚氰胺一样, 同属于三嗪类含氮杂环有机化合物, 也是一种重要的化工原料, 用于有机合成氰尿酸 - 甲醛树脂涂料粘合剂除草剂高分子改性剂等研究表明二者的混合物是猫急性肾衰的发病原因, 二者可紧密结合形成不溶于水的三聚氰胺氰尿酸盐, 在肾细胞中沉淀从而形成肾结石, 最终造成肾衰竭 2007 年 3 月, 美国 FDA 因为部分宠物生病甚至死亡而下令回收近 100 个品牌的宠物食品,2008 年我国三聚氰胺奶粉事件爆发, 自此三聚氰胺进入一个高度受关注的食品安全问题, 美国法律禁止在食品中添加三聚氰胺, 中国政府近期也宣布禁止在食品中添加三聚氰胺三聚氰胺一般添加在对蛋白质含量要求比较高的产品中, 比如各种饲料蛋白粉或者称为高蛋白类食品中, 目的是提高产品的氮含量随着我国对食品安全卫生事件的重视, 对牛奶等食品的安全性进入到一个新的高度, 在这方面的国标也不断更新的同时提出了更低限量的要求目前我国国标 GB/T 中采用 GCMS 法对于三聚氰胺的仪器检出限为 0.05 μg/ml, 而采用 GCMSMS 的方法中仪器检出限为 μg/ml, 本方法中, 采用 Thermo Fisher Trace 1310-ISQ 单四级杆测得仪器检出限为 μg/ml, 仪器检出限更低对于 GCMS 测定三聚氰酸及三聚氰胺, 如果采用直接上样法, 目标物峰形成较大的馒头峰, 且灵敏度较差, 因此此物质在 GCMS 上分析要将其进行衍生化对于衍生化后的最佳溶剂介质为吡啶本方法采用 Triplus-RSH 自动前处理样品平台来实现三聚氰胺的整个衍生化过程, 可以减少实验人员在衍生化过程中和溶剂的接触, 衍生化完成后能够直接在该平台上实现自动化进样, 减少样品转移过程中潜在发生的误差是一种通量高, 节省人力的方法本文了利用 Triplus-RSH 自动前处理样品平台结合 GC-MS 对奶样品中三聚氰酸三聚氰胺的方法进行分析, 方法快速安全, 可完全满足奶制品安全检测的要求

2 2 仪器与耗材仪器 Thermo Scientific TM Dionex TM Chromeleon TM version 7.2 Thermo Scientific TM Trace 1310-ISQ, SSL 进样口 Thermo Scientific TM Triplus RSH 三合一自动样品前处理平台色谱柱 :TG-5 MS, 30 m, 0.25 mm, 0.25 μm P/N: ; S/N: 进样针 :10 μl,1000 μl 试剂与标准品耗材 Thermo scientific HyperSep Retain CX SPE 柱 (500mg,6mL), HPLC 级甲醇,BSTFA+1% 三甲基氯硅烷 (TMCS), 吡啶, 三氯乙酸, 乙酸铅, 乙腈, 无水硫酸钠, 氨水仪器方法进样口温度 :250 ; 进样模式 :splitless; 进样体积 :1 μl 柱温 :100 (1 min),10 /min 到 210 (3 min), 500 /min 到 300 (2 min) 离子源 : 温度 280,Transfer line : 280 扫描参数 : 1 全扫描(Scan): SIM 模式 :Time-SIM,9.69 处扫描离子 73,147,330, 345;12.65 处扫描离子 99,171,327,342. 方法原理奶制品中的三聚氰胺三聚氰酸采用三氯乙酸乙腈溶液提取, 经混合型阳离子交换固相萃取柱净化, 采用 BSTFA+1% 三甲基氯硅烷 (TMCS) 衍生, 以 GCMS 进行定性定量溶液配制标准溶液 : 取三聚氰胺三聚氰酸标准品 0.05 g 溶于 50 ml 甲醇溶液中, 配制成 1000 μg/ml 的标准储备液标准工作液 : 取以上两种标准储备液稀释至 μg/ml 0.01 μg/ml 0.05 μg/ml 0.1 μg/ml 0.5 μg/ml 1.0 μg/ml 样品的前处理提取 : 称取乳制品 5.0 g 于塑料离心管中, 准确加入 15mL 三氯乙酸 (10 g/l) 5 ml 乙腈, 再加入 2 ml 乙酸铅溶液 (22 g/l), 涡旋混匀, 充分振荡以 r/min 速度离心 15 min, 取上清液待用净化 : 分别用 3 ml 甲醇,3 ml 水和 3 ml 甲醇活化 Retain CX SPE 柱 (6 ml 500 mg) 固相萃取柱, 准确移取 10 ml 离心上清液依次上固相萃取小柱以 3 ml 水和 3 ml 甲醇洗涤, 抽近干后用氨化甲醇 (5 ml 氨水溶于 100 ml 甲醇 )3 ml 洗脱, 收集洗脱液, 洗脱液过无水硫酸钠备用洗脱液于 55 氮气吹至近干, 待衍生后进 GCMS 进行定性定量分析三聚氰胺三聚氰酸的衍生本实验采用 Triplus RSH 进行在线衍生, 所需配置见下表表 2. 所需配置 Automatic tool changer Syringe tool D8 (1000 μl used for dilutions) agitator (for vial mixing and incubation before injections) Standard washing station (2 10 ml)(for the derivatization reagent source location) Tray holder Vial tray VT54 (3 pcs, for 2 ml vials) Vial tray VT70 ( for 20 ml vials)(for the derivatization agent source location) Cooled tray recommended if the lab temperature above 25 自动衍生化本实验要求对标准品和样品中的三聚氰胺三聚氰酸进行衍生化再进 GCMS 进行分析, 本方案采用 Triplus RSH 进行自动衍生化衍生化步骤主要包含三步, 首先将衍生化试剂加入待衍生小瓶 ; 将衍生介质加入待衍生小瓶 ; 将小瓶放置于孵化炉进行衍生化, 时间 30 min; 最后取出小瓶冷却至室温 25 后进样分析如下为所需衍生实验的放置情况 : 1. 配有磁性盖的 2 ml 进样小瓶 ( 放置在进样盘处, 做为衍生化发生装置 ) 2. 衍生化试剂 (BSTFA+1%TMCS) 放置在标准洗针液处 ( 根据实验要求所需衍生化试剂量放置衍生化试剂位置, 因为衍生化试剂较昂贵, 本实验每次衍生化所需体积 200 μl, 标准品 + 样品共 12 个, 所需体积 2.4 ml, 因此置于标准洗针液处 ) 3. 衍生化介质 ( 吡啶 ) 放置在 VT70 样品盘中的 20 ml 顶空瓶中 ( 根据实验要求, 每次消耗衍生介质 600 μl, 12 样品共计 7.2 ml) 衍生过程 : 将以上处理氮吹近干的 2 ml 样品瓶放置在样品盘上, 以 D8 tool(1000 μl) 移取 200 μl 衍生化试剂至样品瓶, 再以 D8 tool 移取 600 μl 吡啶至样品瓶 Triplus RSH 将该小瓶转移至孵化炉 (70 ), 完成 30min 衍生化, 完成衍生后将样品瓶取出, 此时气相做一针虚拟进样, 根据需要可将该虚拟进样时间自己设置, 因本实验要求衍生化后冷却至室温 ( 如配有冷却装置可将该时间减至 1 min) 后再进样, 本实验选择将 GC 时间设置为 10 min

3 3 结果与讨论 1. 样品提取条件的选择本实验中的样品基质为牛奶, 牛奶样品的特点极易形成混浊液, 因此本方法采用三氟乙酸 - 乙腈来进行提取, 以达到沉淀蛋白的目的, 同时实验中考察了仅用乙腈和仅用三氟乙酸来提取, 实验效果表明当采用二者混合时提取效率最高, 另外其中加入乙酸铅也是有利于牛奶中蛋白的沉淀作用本方法采用 Retain CX 固相萃取小柱对牛奶样品进行净化, 采用阳离子交换固相萃取小柱可以达到最大程度的净化除杂, 净化后采用氨化甲醇洗脱, 洗脱体积 3 ml 可达到最佳的洗脱效果 2. 衍生条件的选择本实验中对待测物的衍生化需注意, 实验中采用 40 甲醇溶解三聚氰胺三聚氰酸, 因此在衍生前要求将溶解的甲醇全部吹干, 否则将影响三聚氰胺的衍生化产率另外, 注意实验用小瓶在使用前经烘箱烘烤 10 min 以保证其不含有水分, 水的存在对衍生的结果至关重要, 衍生化试剂遇水将导致其失去衍生化功能实验考察了衍生化温度 , 实验结果表明, 当选择温度为 70 时, 此时的衍生化效果最好, 另外温度过高, 易有部分溶剂汽化, 因此本方法采用衍生化温度标准品色谱图及样品加标色谱图其中图 1 为标准品直接衍生后的 TIC 色谱图, 图 2 为衍生后的质谱图图 4 为标准品样品加标及样品的 T-SIM 谱图, 图 5- 图 12 为标品样品加标中三聚氰酸三聚氰胺的提取定性定量离子比较谱图图 μg/ml 三聚氰胺三聚氰酸标准品的 TIC 色谱图, 其中处为三聚氰酸处为三聚氰胺图处三聚氰胺标准品质谱图图处三聚氰酸标准品质谱图

4 4 图 4. 标准样品加标样品 Time-SIM 谱图 ; 其中 9.68 处为三聚氰酸处为三聚氰胺图 5. 标品样品加标提取定量离子 73 的对比图图 6. 标品样品加标提取定性离子 330 的对比图图 7. 标品样品加标提取定性离子 147 的对比图图 8. 标品样品加标提取定性离子 345 的对比图以上四图为标品样品加标中三聚氰酸的定性定量离子比较图

5 5 图 9. 标品样品加标提取定量离子 327 的对比图图 10. 标品样品加标提取定性离子 342 的对比图图 11. 标品样品加标提取定性离子 171 的对比图图 12. 标品样品加标提取定性离子 99 的对比图以上四图为标品样品加标中三聚氰胺的定性定量离子比较图 4. 线性检出限及 RSD 配制浓度分别为 : μg/ml 的校准溶液, 采用上述方法分别进样分析, 考察各组分在 μg/ml 浓度范围内的线性实验结果表明三聚氰胺三聚氰酸在 μg/ml 线性关系良好, 线性相关系数大于 0.999( 见图 13) 对某牛奶样品添加标准溶液 ( 加标浓度为 8.0 μg/kg 80.0 g/kg), 考察三聚氰酸三聚氰胺的加标回收情况实验结果表明加标回收率在 68%-85%, 符合日常分析检测的要求对 μg/kg 加标水平平行测定 5 次, 平均 RSD 值为 4.9% 8.3%, 符合稳定性要求同时以三倍信噪比计算检出限, 仪器检出限在 μg/ml( 见表 3 )

6 Application Notes_C_GCMS-37 图 13. 三聚氰酸三聚氰胺衍生后产物的标准曲线表 3. 线性检出限及 RSD 数据 (n=3) 化合物线性方程 R 2 /%0.02 加标 (μg/kg) 回收率 /% 仪器检出限 /μg/l 方法检出限 /μg/kg 三聚氰酸 Y= *X 三聚氰胺 Y= *X 总结本实验采用赛默飞世尔科技 Triplus RSH 三合一自动样品前处理平台结合 1310GC 配 ISQ 质谱检测器分析奶制品中的的三聚氰胺三聚氰酸, 样品通过 Triplus RSH 在线自动衍生通过气相色谱质谱进行定性定量分析, 方法准确, 灵敏度高, 满足检测要求实验中采用变色龙软件控制及数据处理, 可以完美完成衍生操作及后续对结果的处理, 方便简便, 易于操作参考文献 [1] 李爱军, 张代辉, 马书民等. 液相色谱 - 串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留分析化学,2008,36 (5): [3] S. Squadrone *, G.L. Ferro, D. Marchis etc. Determination of melamine in feed: Validation of a gas chromatography mass spectrometry method according to 2004/882/CE regulation. food control 2010, (21): [4] NY/T , 饲料中三聚氰胺的测定 [5] GB/T , 植物源产品中中三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的测定赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司免费服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN_C_GCMS-37

2 甲基氯硅烷 TMCS=99:1) 以及 8 种 β- 受体激动剂 ( 氯丙那林马布特罗齐帕特罗班布特罗盐酸克伦特罗沙丁胺醇莱克多巴胺特布他林 ) 购于上海安普科学仪器有限公司, 色谱纯甲苯甲醇由 ThermoFisher 提供反应试剂及 β- 受体激动剂标样的配制乙酸钠缓冲溶液

2 甲基氯硅烷 TMCS=99:1) 以及 8 种 β- 受体激动剂 ( 氯丙那林马布特罗齐帕特罗班布特罗盐酸克伦特罗沙丁胺醇莱克多巴胺特布他林 ) 购于上海安普科学仪器有限公司, 色谱纯甲苯甲醇由 ThermoFisher 提供反应试剂及 β- 受体激动剂标样的配制乙酸钠缓冲溶液 GC-MS 衍生化法测定饲料中 8 种 β- 受体激动剂张学彬胡学桥余翀天梁立娜赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司 Application Notes_C_GCMS-34 关键词饲料 ;β- 受体激动剂 ;GC-MS 摘要本文采用乙酸钠缓冲溶液提取硅烷化试剂衍生 GCMS 检测, 建立了饲料中 8 种 β- 受体激动剂的分析方法考察了在该方法下, 仪器对 8 种 β- 受体激动剂检测的线性