临床与实验病理学杂志. 个月左右体重 3 由江苏大学医学院实验动物中心提供室温 G 湿度 1 左右交替照明大鼠普食喂养自由饮水饲养环境每笼只保持垫料干燥适应性喂养一周剪尾采血查血糖留尿测尿蛋白剔除不合格大鼠随机血糖! $)4 尿蛋白定性阳性主要试剂和仪器链脲佐菌素 0>

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充俞
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1 临床与实验病理学杂志. 糖尿病大鼠肾脏 % % 表达的动态观察柳迎昭吴晨光宋丽敏沈莉敏姚翡摘要目的从不同时间点动态观察足细胞相关分子 % % 在糖尿病大鼠肾组织中的表达探讨 % % 在.8 蛋白尿发生发展中的改变及意义方法将. 大鼠分为健康对照组 / 组糖尿病组.5 组. 大鼠腹腔注射链脲佐菌素制成糖尿病模型正常对照组注射等量枸橼酸缓冲液分别于周动态检测尿白蛋白 6 血糖 2 及肾功能取肾组织行常规病理检查免疫组化 & % )$ 分析技术检测肾脏 % % 的表达结果与 8/ 组相比.5 组随着病程的延长尿白蛋白 268/ 均逐渐出现明显的变化而白蛋白尿早于 268/ 异常的出现与 8/ 组相比.5 组足细胞相关分子 % % 蛋白于第周出现表达下调随着时间的进展 % % 蛋白的表达进一步减少直至第周各周间比较差异有显著性, 相关分析显示尿白蛋白排泄与足细胞相关分子 % % 呈负相关结论糖尿病大鼠早期周出现足细胞相关分子 % % 表达下调是糖尿病肾病早期损伤指标 % % 参与了糖尿病肾病大鼠蛋白尿的发生及发展关键词糖尿病肾病足细胞 % % 尿白蛋白中图分类号文献标识码文章编号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糖尿病肾病 # &% $.8 是糖尿病微血管病变之一是终末期肾衰的重要原因蛋白尿是糖尿病肾病的主要临床表现蛋白尿的发生与肾小球的滤过屏障有关由足细胞表达分布于足细胞上或裂孔隔膜的蛋白分子如 $#$ ) A' % /E 0% % $#$ % 等也称足细胞相收稿日期基金项目镇江市社会发展项目 * 作者单位江苏大学附属人民医院内分泌科镇江作者简介柳迎昭女硕士副主任医师 0 ) "' ); ) %3; $B $ 吴晨光男硕士生导师主任医师通讯作者 0 ) "' )@ 3; B $$ $ % 关分子对维系足细胞和. 的正常结构及滤过屏障的功能起关键作用在蛋白尿的发生中发挥了重要作用研究表明实验性糖尿病模型及人类蛋白尿相关的肾小球疾病均有 % % 表达的改变但是 % % 在糖尿病肾病早期有无改变在糖尿病肾病发展中的动态变化尚未见报道本研究从不同时间点动态观察 % % 在糖尿病大鼠肾组织中改变探讨 % % 在.8 蛋白尿发生发展中的变化及意义为.8 的发病机制提供理论依据材料与方法材料实验动物只健康雄性. 大鼠月龄

2 临床与实验病理学杂志. 个月左右体重 3 由江苏大学医学院实验动物中心提供室温 G 湿度 1 左右交替照明大鼠普食喂养自由饮水饲养环境每笼只保持垫料干燥适应性喂养一周剪尾采血查血糖留尿测尿蛋白剔除不合格大鼠随机血糖! $)4 尿蛋白定性阳性主要试剂和仪器链脲佐菌素 0> 34 支美国 3 公司兔抗鼠 % % 多克隆抗体美国 % / ;2 $ %$)$3 9% 0$ + 血糖仪及血糖试纸美国强生公司 6 全自动生化分析仪日本奥林巴斯 5 病理切片机德国莱卡蛋白垂直电泳仪及电转膜仪器 5 % $ %2 $' # 方法大鼠糖尿病模型的建立禁食后空腹状态下一次性腹腔注射链脲佐菌素 0> 34=3 溶于 $)4 枸橼酸缓冲液 * 临用前配制注射 0> 后大鼠血糖开始升高后剪尾采血测血糖试纸法检测尿糖血糖 $)4 尿糖即为糖尿病模型建立成功入选实验动物分组及给药大鼠随机分为正常对照组 8/ 组其中只作为周组正常对照其余大鼠注射相当体积的枸橼酸缓冲液模型组.5 组所有大鼠在实验期间均喂标准饮食自由饮水不应用胰岛素整个实验延续周标本的收集分别于周周周周周各周均指建模成功后的各周末以下同从.5 组 8/ 组随机取大鼠各只处死处死前称体重后置入代谢笼中收集尿液用二甲苯防腐计尿液总量后取尿液 ) 离心 4 % % 取上清液放入 G 冰箱中保存待测实验初取只作为周正常对照的大鼠以同样的方法留取尿标本留尿次日在 1 戊巴比妥钠 34=3 腹腔麻醉下剪尾测血糖腹部正中切口心脏采血 ) 全血静置 % 后离心分离血清于 G 冰箱中保存待测左心室插管注入 2 液灌洗肾脏至发白后取左肾分离包膜生理盐水冲洗滤纸吸干血迹后称重分离皮髓质后置 G 冰箱保存再继续以 1 的多聚甲醛灌注进行内固定后取右肾组织称重后纵切为两半置入 1 的多聚甲醛固定并计算肾脏肥大指数以肾重 4 体重表示血尿生化指标测定葡萄糖氧化酶法测定血糖美国强生血糖仪及试纸条采用日本奥林巴斯 6 全自动生化分析仪测定血尿素氮 268 血肌酐尿肌酐 6 并计算内生肌酐清除率 / / )4 %=3 6 34#) - 每分钟尿量 )4 % 4 34#) 4 体重 =3 免疫比浊法检测尿白蛋白肾脏病理检查大体标本观察光镜观察肾组织经 1 多聚甲醛固定梯度乙醇脱水二甲苯透明渗蜡包埋切片后 *" 染色观察肾脏免疫组化检查采用法厚肾组织石蜡切片梯度脱蜡水化后 1 过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性 2 缓冲液洗涤正常兔血清封闭依次加入兔抗鼠 % % 抗体以稀释生物素标记的抗.2 显色苏木精复染封固镜检采用 *5+ 高清晰度彩色图文分析系统在高倍镜下 - 每张切片随机选取个完整不重复的肾小球以胞质出现棕黄色颗粒为阳性信号分别测量出每个肾小球阳性区面积阳性区积分光密度二者相除后得阳性区平均积分光密度值 +9. 值再取 +9. 值均值进行免疫组化的半定量分析代表样本相对阳性表达量每组分析个标本切片肾脏 & % )$ 检测取 G 保存的肾皮质约 3 经冰冷的 $)4 2 充分洗涤后置入 G 预冷的蛋白裂解液 ) 匀浆 G 4 % 离心 % 取上清液 2 #:$ # 法测定蛋白浓度经. 聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭与抗体反应显色干燥扫描采用 0 $$% 多功能成像系统扫描经 + 3 D % 0 软件分析得到目的条带的灰度值以 '.* 作内参计算蛋白的相对表达量统计学分析实验数据以 F' 表示数据先行方差齐性检验采用软件两样本均数比较采用随机设计资料的检验各组间均数比较采用单因素方差分析指标之间的关系采用 ' &$% 直线相关分析结果大鼠一般指标的变化模型组.5 组大鼠周时虽出现短暂的体重增加但与实验前周及同期 8/ 组比较! 自周起.5 组大鼠体重持续减轻与同期 8/ 组大鼠比较其差异均有显著性, 与 8/ 组比较自第周起.5 组各周大鼠肾重 = 3 ( 肾重 4 体重指数 ( 42 增加, 大鼠

3 临床与实验病理学杂志. 表大鼠体重肾重肾重 4 体重的变化时间点 2 3 ( 3 ( 42 N 周 F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F 2 体重 ( 肾重 (+ 肾脏肥大指数与 8/ 组相比, 与前周组比较, 表各时间点血糖血尿素氮肌酐清除率的变化时间点 2 $)4 268$)4 / )4 %=3 周 F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F 与对照组相比, 不同时期体重肾重肾重 4 体重指数变化见表大鼠血糖肾功能的变化大鼠注射 0> 后血糖升高实验期间糖尿病组大鼠均表现出饮水量尿量明显增加生长迟缓精神差的症状实验期间监测血糖各组血糖均超过 $)4 与同期 8/ 组比较.5 组血糖明显升高, 提示糖尿病造模成功与 8/ 相比.5 组 268 渐增高周末明显高于对照组差异有统计学意义,/ 渐下降周末两组比较方有统计学差异, 而早期周时差异均无统计学意义表大鼠小时尿量和尿白蛋白排泄的变化由表看出与 8/ 组比较.5 组大鼠尿白蛋白逐渐增多周末两组比较差异无统计学意义实验周末尿白蛋白高达 F 34 并且自周起两组尿白蛋白同期比较分别, 相邻两周间也差异有显著性,.5 组尿量也明显高于 8/ 组, 表各时间点尿量尿白蛋白的的变化时间点尿量 )4 尿白蛋白 34 周 F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F 与对照组相比, 与前周组比较, 肾组织常规病理学观察光镜 *" 染色显示整个实验过程中正常组大鼠的肾脏组织均未见明显病理学改变与同期的 8/ 组相比周前.5 组大鼠肾脏在光镜下的变化不明显实验周末糖尿病大鼠肾小球体积略大于正常组系膜区轻度增宽实验第周末糖尿病肾小球体积增大肾小球系膜基质弥漫增多系膜细胞明显增多基膜弥漫增厚肾间质肾小管无明显病理形态学改变图肾皮质 " " 免疫组化的表达免疫组化染色显示 % % 在肾小球基膜外侧上皮细胞间表达可见棕黄色的 % % 沿基膜呈线形分布糖尿病大鼠模型组棕黄色线样沉积逐渐变细淡甚至消失图半定量分析阳性区平均积分光密度显示周末.5 组的表达较 8/ 组明显减少, 周后改变更为明显, 表图 $% "+!% 分析应用凝胶成像分析系统对 % % 蛋白进行定量分析与 8/ 组相比.5 组的表达减弱周就有统计学差异, 并随时间呈现逐渐下降的趋势, 或, 表图 & %' )$ 测定结果与免疫组化半定量分析结果一致尿白蛋白量与 % % 表达的相关性尿白蛋白排泄量与肾组织 % % 蛋白表达成负相关, 讨论近年来发现多种足细胞相关蛋白如 % %

4 ! "#-! 临床与实验病理学杂志&!"# $ % &' ()*+,# &,)() F< / "#&#-$ )' )P )G )F )4 )O *' *P *G *F *4 *O +' +P +G +F 图!"大鼠肾组织 B4染色&'%正常对照组"P2O%糖尿病组, 周(. 周(- 周(J 周((, 周图 #"大鼠肾小球 7< LK> = 7 蛋白表达 '%VG组"P2O%分别为 FS, 周(. 周(- 周(J 周((, 周图 $"大鼠肾小球 7< LK> = 7 蛋白表达 '%VG组"P2O%分别为 FS, 周(. 周(- 周(J 周((, 周 +4 +O 表 %"大鼠肾小球 40.</ 2 4蛋白免疫组化表达组别 )周,周.周 -周 J周 (, 周 VG组 #- p,% (. $$%,. p(% +- +" p,% )# $#% J- p(% J+ (, p,% )$ $#% +$ p(% J" FS组 #- p,% (. $)% )" p(% J# ) #J%.. p,%.- ),-% J" p(% +" ) (J% $- p,% )J ) &&与 VG组比较& ) )D)1 )$ +% +# p(% +$ )

5 临床与实验病理学杂志. 表各周大鼠肾组织 " " 蛋白 $% "+!% 分析组别周周周周周周 8/ 组 F F F F F F.5 组 F F F F F F 与 8/ 组比较,, 图各时间点肾组织 " "$% "+!% 分析结果 % %.* /E 0' 等它们与足细胞及基膜的结构和功能完整性滤过屏障的组成有密切关系 8 % 是一种跨膜糖蛋白是第一个被确定的肾小球滤过屏障结构蛋白分子特异性表达在裂孔膜上是裂孔膜复合体的主要成分也是裂孔隔膜上最关键的分子其分布和表达的异常已被证实与多种先天性及获得性蛋白尿相关其正常表达对维护足细胞功能结构的完整性及对维持裂孔膜结构和功能起重要作用近些年糖尿病肾病 % % 蛋白表达的研究结果不一致 % % 8 水平蛋白表达水平上升或下降均有报道 ) $% % 等研究发现 0> 诱导的.8 大鼠周出现 % % 8 表达升高高表达持续到周并伴随尿蛋白迅速升高晚期则出现下降且于第周时尿中出现 % ' % 蛋白 $ & 等也发现 0> 诱导的.5 高血压大鼠肾小球 % % 基因表达在早期第周短暂升高后期周及周则明显下降并且与蛋白尿的升高有关 ( ) 等研究却发现 0> 诱导的.8 大鼠在天时 % % 表达无改变而在个月时 % % 表达减少在人类中对足细胞特异蛋白分子与.8 的关系报道也存在不一致有人观察.8 肾活检标本 % % 的表达发现无论表现为肾病综合征还是微量蛋白尿的和型患者其 % ' % 表达显著下降并且与蛋白尿的程度无明显的相关性而有文献报道 % % 的表达量与蛋白尿程度成负相关可见特异性表达于. 上的 % % 表达改变可能参与了.8 的发生发展但是究竟是如何改变的尚无明确结论蛋白尿的出现与 % ' % 蛋白表达异常之间究竟是平行的临床表现还是存在因果关系还不明了实验中我们发现糖尿病组大鼠从实验周末尿白蛋白开始升高但与对照组比较差异无显著性以后呈现明显上升趋势实验周末则明显高于正常组水平, 周末血尿素氮周末肌酐清除率也相继出现升高及下降, 并且从实验周末起糖尿病大鼠肾脏体积较正常大鼠增大肾重 4 体重指数持续升高表明糖尿病大鼠周肾脏出现改变并逐步形成糖尿病肾病免疫组化及免疫印迹半定量分析均显示 % % 在正常大鼠肾小球阳性表达糖尿病大鼠肾小球 % % 表达低于正常对照组周就出现表达明显下调其差异出现早于尿白蛋白的出现表明糖尿病大鼠早期即发生 % % 的丢失是糖尿病肾病早期损伤指标随着糖尿病病程的发展 % % 的丢失进一步加重与尿白蛋白相关分析显示 % % 的表达与白蛋白尿呈负相关表明足细胞相关蛋白分子 % ' % 与糖尿病肾病大鼠蛋白尿的发生发展密切相关因此有理由相信 % % 参与了早期糖尿病肾病蛋白尿的形成我们通过观察不同时间点糖尿病大鼠肾组织 % % 的改变初步了解到足细胞相关分子 % % 是糖尿病肾病的早期损伤指标进一步证实了足细胞相关分子 % % 在糖尿病肾病发病中的作用为临床早期诊断和治疗提供新的靶点参考文献 5 %# ) %=) %#? $#$ $)$3 %# & $%& $ %?? $ 8 $)? : &$%? %=) %#? ) * $ % % # ' = #% # & & % & $ %? ( #% +% 7 33 % "0 %& $% ) 3 ) $% $: $#$ & : $% %# # : % $%? % / ). <2 $) $): / % > # 8 $ $: 3)$' ) ) $@ # % $:# & & $#$ % $ &$: 3 % # % $?. & ) $% % ) & $" / %3 & % A & $% $:% % 3 % %# $ % % A % )# % $? +%< & $ & ) % % %3 3 $<? 8 % && ' : ) )$ # &) # 3$:3)$ ) $#$ &? $ 8 # 6 *$); % 2?$% ($< + 8 % )$ ) ; & $

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第 5 期王国贤, 等.α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响 379 cantly,mesangialwideningthecapilarylumenpresure,glomerularbasementmembranethickening,renal

第 5 期王国贤, 等.α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响 379 cantly,mesangialwideningthecapilarylumenpresure,glomerularbasementmembranethickening,renal 第 22 卷第 5 期 2012 年 9 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.22 No.5 Sept.2012 α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响王国贤, 康雅萍, 李飞 ( 辽宁医学院药理学教研室, 辽宁锦州 121001) [ 摘要 ] 目的 : 通过