第 3 期袁芳, 等. 脂联素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其抗氧化机制探讨 427 态 ROS 可直接攻击体内的不饱和脂肪酸, 产生脂质过氧化产物丙二醛 (MDA) 及短链羟基, 使血管通透性增加, 肾组织细胞膜破坏 ; 红细胞膜脂质过氧化可降低膜的流动性, 增加其对内皮细胞的粘附性 ; 损伤 [2

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耄梅
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1 426 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%21;3(3) 脂联素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其抗氧化机制探讨袁芳, 刘映红, 田俊玮, 彭佑铭, 刘伏友 ( 中南大学湘雅二医院肾内科, 湖南长沙 4111) 摘要 : 目的研究脂联素 (ADPN) 对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其相关的抗氧化机制方法采用高糖高脂饮食配合腹腔注射链脲佐菌素 (STZ) 的方法复制 2 型糖尿病大鼠模型, 可表达球形脂联素的 pires2-egfp-gad 质粒用脂质体介导经腹腔转染糖尿病大鼠模型体内将 32 只 Wistar 大鼠随机分为正常对照组 (NC 组 ) 糖尿病模型组 (DM 组 ) ADPN% 干扰组 (DA 组 ) 和空载体转染组 (DP), 分别给予相应处理 8 周后, 观察血糖糖化血红蛋白 (HbA1c) 24%h 尿微量白蛋白排泄率 (UAER) 变化 ; 留取肾组织切片观察光镜下的病理改变并测定肾组织 ROS 释放量的变化 ; 免疫组化法和 Western%Blot 测定内皮型一氧化氮合酶 (enos) 和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (p-ampk) 蛋白的表达结果与正常对照组比较,DM 模型组大鼠 UAER 显著上升, 肾组织 ROS 释放量增加 (P<.5),DM DA DP 各组之间尿蛋白无明显差异 (P>.5) 与 DM 组相比,DA 组血糖和 HbA1c 有所下降,ROS 释放明显减少 (P<.5) 光镜下 DM 组大鼠大部分肾小球系膜区增宽, 基质大量增生, 节段性基底膜增厚部分肾小管上皮细胞空泡变性脱落, 肾小球内细胞数显著增多单个核细胞浸润明显, 与 DM 组相比, 脂联素干预组以上病变均有减轻与对照组相比 DM 组肾组织 enos 水平下降, p-ampk 蛋白表达下调 (P<.5), 脂联素干预组 enos 水平也有下降, 但较 DM 组升高,p-AMPK 蛋白表达亦高于 DM 组 (P<.5) 结论脂联素对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用, 其机制可能部分通过刺激 AMPK 磷酸化, 抑制 ROS 产生, 减轻氧化应激反应, 上调糖尿病大鼠肾组织中 enos 的表达实现的关键词 : 糖尿病肾病 ; 脂联素 ; 氧化应激 ;enos;p-ampk 中图分类号 :R587 文献标识码 :A 文章编号 : (21) Renoprotective effect of adiponectin through an antioxidant mechanism in streptozotocin-% induced diabetic rats YUAN%Fang,%LIU%Ying-hong,%TIAN%Jun-wei,%PENG%You-ming,%LIU%Fu-you Department%of%Nephrology,%Second%Xiangya%Hospital,%Central%South%University,%Changsha%4111,%China Abstract: Objective To%investigate%the%renoprotective%effect%of%adiponectin%in%streptozotocin%(STz)-induced%diabetic%rats%and% explore% its% association% with% oxidation% stress. % Methods Type% 2% diabetes% mellitus% was% induced% in% rats% by% high-lipids% and% high-sucrose% feeding% and% intraperitoneal% STZ% injection. % The% recombinant% plasmid% pires2-egfp-gad% expressing% globular% adiponectin%was%intraperitoneally%injected%in%the%rats%mediated%by%liposome. %Thirty-two%Wistar%rats%were%randomized%into%4% groups, %namely%the%normal%control%group% (NC), %diabetic%group%without%any%therapy% (DM), %diabetic%group%treated%with% pires2-egfp-gad% (DA) %and%diabetic%group%treated%with%pires2-egfp% (DP). %After%the%corresponding%treatments%for%8% weeks,%the%blood%glucose,%hba1c%and%urine%albumin%excretion%rate%(uaer)%were%measured,%and%the%kidneys%were%collected%to% determine%the%production%of%reactive%oxygen%species%(ros)%and%assess%renal%pathologies.%immunohistochemistry%and%western% blot% were% employed% to% determine% the% protein% levels% of% endothelial% nitric% oxide% synthesis% (enos) % and% phosphorylated% AMP-activated% protein% kinase% (pampk). %% Results UAER% and% ROS% production% increased% significantly% in% DM% group% as% compared%with%that%in%the%control%group%(p<.5),%while%no%significant%differences%were%found%in%uare%among%the%dm,%da,% and%dp%groups%(p>.5).%blood%glucose%level,%hba1c%and%ros%were%significantly%decreased%in%da%group%in%comparison%with% those% in% DM% group%(p<.5).% Glomerular% hypetrophy,% mesangial% expansion,% basal% membrane% thickening,% tubular% epithelial% cells%cavitation%and%exfoliation, %and%mononuclear%lymphocyte%infiltration%occurred%in%dm%group, %while%these%changes%were% ameliorated% in% gad% transfection% group. % The% renal% expression% levels% of% enos% and% p-ampk% proteins% in% DM% group% were% significantly% lower% than% those% in% the% control% group% (P<.5) % and% gad% transfection% group% (P<.5). %% Conclusions The% renoprotective%effect%of%adiponectin%may%be%at%least%partially%mediated%by%the%activation%of%the%ampk%signaling%passway,%ros% production%inhibition,%relief%of%the%oxidative%stress,%and%up-regulation%of%enos%expression%in%the%renal%tissue%of%diabetic%rats.% Key words: Diabetic%nephropathy;adiponectin;oxidative%stress;eNOS;%%p-AMPK 糖尿病肾病 (DN) 是导致终末肾病的主要原因, %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 收稿日期 : 基金项目 : 湖南省卫生厅基金 (B26-43) 作者简介 : 袁芳 (1974-), 女, 博士, 主治医师, 主要研究方向 : 肾小球疾病, %yuanfangcat@21cn.com 通讯作者 : 刘映红, %yuanfangcat@21cn.com [1] 也是糖尿病患者死亡最常见的病因之一其发病机制尚不十分明确, 除了代谢紊乱肾小球血流动力学异常和遗传易感性等方面, 氧化应激损伤已逐渐受到人们重视糖尿病时肾组织细胞内产生大量的活性氧 (ROS), 抗氧化物质减少, 造成肾组织的氧化应激状

2 第 3 期袁芳, 等. 脂联素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其抗氧化机制探讨 427 态 ROS 可直接攻击体内的不饱和脂肪酸, 产生脂质过氧化产物丙二醛 (MDA) 及短链羟基, 使血管通透性增加, 肾组织细胞膜破坏 ; 红细胞膜脂质过氧化可降低膜的流动性, 增加其对内皮细胞的粘附性 ; 损伤 [2] 肾细胞及线粒体 DNA 等, 与 DN 密切相关脂联素 (ADPN)% 是体内唯一与体脂含量呈负相关的脂肪因子, 与肥胖症胰岛素抵抗和 2% 型糖尿病之间存在显著相关性研究发现, 在肥胖 2% 型糖尿病患者中, 通常伴有胰岛素抵抗及高胰岛素血症, 其血 [3] 浆脂联素浓度下降用脂联素瘦素联合治疗可完全逆转缺乏过氧化物酶体增殖物激活受体的脂肪萎缩小鼠的胰岛素抵抗,% 但只用瘦素仅能部分改善胰岛素抵抗提示脂联素可能是治疗胰岛素抵抗和 2% 型糖 [4] 尿病的新靶点对早期糖尿病肾病的研究显示循环脂联素水平与尿蛋白呈负相关, 而且早期糖尿病肾病 [5] 内皮功能受损与低脂联素水平有关进展期糖尿病 [6-7] 肾病患者尿脂联素和血脂联素水平增加, 可能是通过抗炎抗动脉硬化等作用, 减轻肾脏损害, 阻止糖 [8] 尿病肾病进展的正反馈调节研究还发现脂联素与氧化应激相关, 它可以抑制 oxldl 诱导的内皮细胞 [9] ROS 的产生, 增加 enos 活性, 对抗 oxldl [9] 和 TNF-α [1] 对血管内皮的损伤本实验旨在研究脂联素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的肾脏保护作用及对大鼠肾组织 ROS 内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 产生的影响并探讨其抗氧化的可能机制 1%% 材料与方法 1.1%% 材料和试剂 pires2-egfp-gad% 荧光质粒, 含脂联素球形结构域的全长编码区, 可在体内共表达球形脂联素蛋白和 EGFP 绿色荧光, 由本研究室构建保存链脲佐菌素 (STZ,sigma 公司 );Lipofectamine( 阳离子脂质体, Invitrogen 公司 );Anti-eNOS 兔多克隆抗体 (Abcam 公司 );Phospho-AMPKα 兔多克隆抗体 (Cell% Signaling 公司 );ECL 试剂盒 (Amersham 公司 ); 免疫组化 Elivision TM %plus 试剂盒 ( 福建迈新公司 ); 活性氧试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所 ) 1.2%% 方法 1.2.1%% 糖尿病大鼠模型的建立和实验分组健康雄性 Wistar 大鼠 32 只 ( 中南大学实验动物中心提供 ),2 月龄, 体质量 (2±2)%g, 实验前测鼠尾外周血糖均正常给予高糖高脂饲料 ( 猪油 1%, 蔗糖 2%, 胆固醇 2.5%, 胆酸盐 1%, 常规饲料 66.5%)1 个月, 诱导胰岛素抵抗后, 给予亚致病剂量 (3%mg/kg)1%STZ 腹腔注 [11] 射 72%h% 后剪尾用血糖仪及试纸测大鼠血糖 (BG), BG 高于 16.7%mmol/L 并出现多饮多尿多食体重减轻为糖尿病模型成功 1 周后将动物分为 (1) 正常对照组 (NC 组 ): 喂以常规饲料 ;(2) 糖尿病无干预组 (DM 组 );(3)pIRES2-EGFP-gAd 转染组 (DA 组 ): 将配置好的脂质体 /pires2-egfp-gad 转染复合物腹腔注入已成模的糖尿病大鼠体内, 每周注射 2 次 ;(4)% 空载体 pires2-egfp 转染组 (DP 组 ): 将配置好的脂质体 /pires2-egfp 转染复合物腹腔注入已成模的糖尿病大鼠体内, 每周注射 2 次每组 8 只大鼠, 质粒 [12] 转染组参照 Lipofectamine 的说明书和文献, 质粒与 Lipofectamine 的配比为 ( 滋 g/ 滋 l)1.5, 质粒 pires2-egfp-gad 或 pires2-egfp 用量根据大鼠体质量按 2% 滋 g/kg 1.2.2%% 标本收集及测定注射 STZ 的 4 周以后, 每周一次将大鼠置于金属代谢笼中, 留取 24%h 尿标本, 记录尿量后采用竞争放射免疫分析法测 24%h 尿微量白蛋白排泄率 (UAER), 于实验第 8 周末处死大鼠, 股动脉取血, 分离血清, 测定血糖和糖化血红蛋白 (HbA1c) 取部分肾皮质置于 4% 多聚甲醛固定, 用于免疫组织化学检测 ; 部分肾组织用.9% 生理盐水制成 1% 匀浆液, 按试剂盒方法测组织内 ROS 量 ; 取部分肾皮质提取蛋白, 进行 Western% 印迹分析 1.2.3%% 肾脏病理学观察切片厚 4% 滋 m, 常规脱蜡入水, HE Masson% 染色, 光镜观察, 并采用 MIAS 医学图象分析系统 ( 北航公司 ) 对肾小球形态进行定量分析 1.2.4%% 免疫组织化学染色切片厚 4% 滋 m, 常规脱蜡入水, 一抗为兔抗 enos 或 p-ampk 多克隆抗体, 二抗为 HRP 标记的山羊抗兔 IgG, 以 PBS% 代替一抗作阴性对照,DAB% 显色, 光镜观察阳性染色颗粒 1.2.5%%Western% 印迹取肾组织, 加入 RIPA% 裂解缓冲液, 冰浴 1%h,4% 14%%r/%min% 离心,Lowry% 法测定上清液蛋白浓度参照分子克隆操作, 取 4%μg 总蛋白点样于 8%%SDS-PAGE% 胶电泳分离, 电转至硝酸纤维素膜再用 enos 或 p-ampk% 抗体杂交, 检测 enos 和 p-ampk 蛋白质表达,ECL% 法显示免疫复合物用 Bio-Rad 公司凝胶成像分析仪对条带进行定量分析 1.2.6%% 统计学处理实验数据用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 采用 SPSS%11.% 统计软件进行统计, 组间比较采用 t 检验,P<.5 时认为差异有统计学意义 2%% 结果 2.1%% 各组大鼠一般情况和血糖尿微量白蛋白排泄率比较实验期间, 糖尿病模型组和质粒转染组大鼠均表现出多饮多尿多食行动迟缓等症状, 有 5 只在造

428 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 3 卷模期间死亡, 存活大鼠空腹血糖均在 13.

5);pIRES2-% EGFP-gAd 转染组与 DM DP 组大鼠比较, 血糖和 HbA1c 有所降低 (P<.5),UAER 与 DM 模型组相比有下降趋势, 但无统计学差别 (P>.

5 表 1%% 各组大鼠第 8 周实验结果和形态学指标比较 (x±s) 组别 n BG(mmol/L) HbA1c(%) 尿白蛋白 (mg/24%h) 肾小球细胞数 (n/ 肾小球 ) 肾小球截面积 (μm 2 ) ROS(nmol/L) NC 组 8 5.71±1.5 5.66±1.86 1.47±2.67 41.2±2.3 37571.5±232.58 15.67±4.

56* DP 组 6 25.26±2.69* %%9.6±2.33* %%45.12±6.62* %%84.2±2.5* %%44981.36±229.74* %%28.76±3.14* 与 NC 组比较,*P<.5; 与 DM 组比较, P<.5 2.

空质粒转染组与 DM 组比光镜下无明显变化形态学定量分析见表 1 图 2%% 各组大鼠肾脏 Masson 染色结果比较 ( 原放大倍数 : 2) A:%NC 组 ;%B:%DM 组 ;%C:%DA 组 ;%D:%DP 组 2.3%% 大鼠肾组织 ROS 生成量 DM DA DP 组大鼠在 8 周末 ROS 产生量均较对照组明显升高 (P<.

3 428 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 3 卷模期间死亡, 存活大鼠空腹血糖均在 13.9%mmol/L% 以上 DM 模型组大鼠 UAER 从第 4 周开始有所上升, 从第 6 周起与正常组比较明显升高 (P<.5) 随时间进展, 模型组大鼠 UAER 呈升高趋势 ( 图 1) 到第 8 周试验结束时, 与 NC 组比较,DM DA DP 组大鼠血糖 HbA1c UAER 均明显升高 (P<.5);pIRES2-% EGFP-gAd 转染组与 DM DP 组大鼠比较, 血糖和 HbA1c 有所降低 (P<.5),UAER 与 DM 模型组相比有下降趋势, 但无统计学差别 (P>.5); 空载体转染组 (DP 组 ) 与 DM 模型组相比无显著差别 ( 表 1) UAER(mg/24%h) 正常组 3 模型组 2 1 4%%%%%%%%%%%%%%5%%%%%%%%%%%%%6%%%%%%%%%%%%%7%%%%%%%%%%%%%8%%%% t/week 图 1%%NC 组与 DM 组大鼠尿蛋白 (mg/24%h) 变化与 NC 组比较,*P<.5 表 1%% 各组大鼠第 8 周实验结果和形态学指标比较 (x±s) 组别 n BG(mmol/L) HbA1c(%) 尿白蛋白 (mg/24%h) 肾小球细胞数 (n/ 肾小球 ) 肾小球截面积 (μm 2 ) ROS(nmol/L) NC 组 ± ± ± ± ± ±4.13 DM 组 ±3.19* 1.26±1.88* %%%%49.86±21.37* %%85.7±3.1* %% ±5132.5* %%29.12±2.21* DA 组 7 %%19.5±4.71* %%%%8.52±.65* %%%%37.29±1.6* %%%%61.8±1.7* %%%%422.77± * %%%%2.13±1.56* DP 组 ±2.69* %%9.6±2.33* %%45.12±6.62* %%84.2±2.5* %% ±229.74* %%28.76±3.14* 与 NC 组比较,*P<.5; 与 DM 组比较, P<.5 2.2%% 肾脏病理学改变光镜下肾组织染色可见, 对照组大鼠肾组织结构正常,DM 组大鼠肾小球细胞数增多, 直径明显增大, 系膜基质增多, 肾小球基底膜及囊壁增厚, 部分肾小管上皮细胞空泡变性脱落, 间质区可见少量单核及淋巴细胞浸润, 符合糖尿病肾病病理改变与 DM 组相比脂联素转染组肾小球直径减小, 系膜细胞和系膜基质轻度增生, 肾小球基底膜增厚减轻, 小管病变也有不同程度减轻 ( 图 2) 空质粒转染组与 DM 组比光镜下无明显变化形态学定量分析见表 1 图 2%% 各组大鼠肾脏 Masson 染色结果比较 ( 原放大倍数 : 2) A:%NC 组 ;%B:%DM 组 ;%C:%DA 组 ;%D:%DP 组 2.3%% 大鼠肾组织 ROS 生成量 DM DA DP 组大鼠在 8 周末 ROS 产生量均较对照组明显升高 (P<.5); 与 DM 组相比 DA 组大鼠肾组织 ROS 产生量减少 (P<.5), 空载体转染组与之相比无明显变化 ( 表 1) 证明脂联素可减少糖尿病大鼠肾组织活性氧的产生 2.4%%eNOS 蛋白在大鼠肾组织的表达在正常对照组大鼠的肾脏即有 enos 蛋白表达, 免疫组化呈现为棕黄色颗粒,DM 组的 enos 表达较正常对照组明显下调 (P<.5),DA 组的 enos 表达虽仍低于对照组, 但与 DM 和 DP 组相比其表达显著增高 (P<.5), 主要见于肾小球系膜区, 基底膜, 肾小管上皮细胞胞浆肾间质 ( 图 3) Western%blot 结果 ( 图 4) 亦证明糖尿病组大鼠肾组织内 enos 的蛋白水平较对照组下降 2.85 倍 (P<.5), 脂联素干预组 enos 的表达量较糖尿病模型组上升了 2.21 倍 (P<.5), 结果显示脂联素能够上调糖尿病大鼠肾组织 enos 的表达 2.5%% 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 (p-ampk) 在大鼠肾组织的表达免疫组化 ( 图 5) 与 Western%blot( 图 6) 均证明, 正常对照组大鼠肾脏有 p-ampk 的表达, 主要在胞浆与对照组和糖尿病模型组相比脂联素干扰组的 p-ampk 表达明显增高 (P<.5),DM 模型组和空质粒转染组的 p-ampk 表达与对照组相比下降 (P<.5) 说明脂联素可激活肾脏 AMPK 信号通道

42% 6 5 Ratio 4 3 2 1 NC%%%%%%%%%DM%%%%%%%%DA%%%%%%%%%%DP 图 4%%

5 3%% 讨论对于糖尿病及其并发症的动物模型的建立方法 [13] 有多种, 到目前为止,

STZ% 配合高糖高脂饲料, 应用高糖高脂饲料的目的就是抑制葡萄糖向 6%-% 磷酸葡萄糖的分解转化而加重糖代谢的紊乱,

只要胰腺能维持足够高的胰岛素分泌来克服胰岛素抵抗, 那么糖耐量将保持正常或轻度受损, 而注射 STZ% 后 β

UAER 明显增高至实验结束时, 与图 5%% 大鼠肾组织 p-ampk 表达的免疫组化结果 ( p-ampk 茁

NC%%%%%%%%%%%%%DM%%%%%%%%%%%%DA%%%%%%%%%%%%%DP

p-ampk 蛋白表达的 Western%blot 结果与 NC 组比较,*P<.5; 与 DM 组比较, P<.

可见肾小球毛细血管闭塞和明显增厚的肾小球基底膜脂联素转染 8 周后, 肾组织形态学损害明显改善包括肾小球内细胞数明显减少

4 第 3 期袁芳, 等. 脂联素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其抗氧化机制探讨 429 图 3%% 各组大鼠肾组织 enos 蛋白表达的免疫组化结果 ( 原放大倍数 : 2) A:%NC;%B:%DM;%C:%DA;%D:%DP NC%%%%%%%%%%%%DM%%%%%%%%%%%%DA%%%%%%%%%%DP% enos 14% 茁鄄 actin 42% 6 5 Ratio NC%%%%%%%%%DM%%%%%%%%DA%%%%%%%%%%DP 图 4%% 各组大鼠肾组织 enos% 蛋白表达的 Western%blot 结果与 NC 组比较,*P<.5; 与 DM 组比较, P<.5 3%% 讨论对于糖尿病及其并发症的动物模型的建立方法 [13] 有多种, 到目前为止, 大部分对糖尿病肾组织病理变化的研究通常使用 STZ 诱导的动物模型我们采用传统 2% 型糖尿病的建模方法, 小剂量注射 STZ% 配合高糖高脂饲料, 应用高糖高脂饲料的目的就是抑制葡萄糖向 6%-% 磷酸葡萄糖的分解转化而加重糖代谢的紊乱, 其中血脂升高是此类模型的特征, 与临床 2% 型糖尿病比较符合胰岛素抵抗发生后, 只要胰腺能维持足够高的胰岛素分泌来克服胰岛素抵抗, 那么糖耐量将保持正常或轻度受损, 而注射 STZ% 后 β 细胞功能开始衰竭, 糖耐量将迅速恶化本研究观察到采用该方法简单, 成模率高且稳定, 多数大鼠在血糖升高后 4~6 周出现 UAER 明显增高至实验结束时, 与图 5%% 大鼠肾组织 p-ampk 表达的免疫组化结果 ( 原放大倍数 : 2) A:%NC;%B:%DM;%C:%DA;%D:%DP p-ampk 茁 -actin Ratio NC%%%%%%%%%%%%%DM%%%%%%%%%%%%DA%%%%%%%%%%%%%DP NC%%%%%%%%%%%%DM%%%%%%%%%%%DA%%%%%%%%%%%%DP %% 图 6%% 各组大鼠肾组织 p-ampk 蛋白表达的 Western%blot 结果与 NC 组比较,*P<.5; 与 DM 组比较, P<.5 62% 42% 正常组大鼠比较, 糖尿病组大鼠肾小球体积明显增大系膜细胞和内皮细胞数量均明显增高可见肾小球毛细血管闭塞和明显增厚的肾小球基底膜脂联素转染 8 周后, 肾组织形态学损害明显改善包括肾小球内细胞数明显减少平均肾小球体积增加程度减轻, 毛细血管腔开放炎症细胞浸润明显改善肾小球基底膜增厚及系膜细胞增生明显减轻血糖和糖化血红蛋白下降, 增加的尿蛋白有减少趋势但无统计学意义, 考虑与观察时间较短有关以上结果表明脂联素能够阻止或延缓糖尿病大鼠肾脏的病理损害关于 DN% 发病机制, 目前认为是在遗传背景基础上多因素综合作用的结果, 无论是临床研究还是动物 [14] 实验均发现, 在糖尿病情况下常伴有 ROS 产生增多或存在着抗氧化酶系统 SOD 过氧化氢酶谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH)% 等的功能降低, 致使肾组织中局

5 43 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 南方医科大学学报 (J%South%Med%Univ)%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 第 3 卷部活性氧生成和清除之间的平衡被打破蓄积体内过量的 ROS 能够激活信号转导级联途径及转录因子, 导致胞内蛋白膜脂质核酸的损害, 引起细胞死亡及包括 DN 在内的组织损伤本实验结果发现糖尿病组大鼠肾组织中 ROS 含量高于正常组,eNOS 表达低于正常组 enos 是 NO 生成的主要限速酶之一, 其活性与 NO 生成量呈正相关,eNOS 持续少量产生的 NO% 可松弛平滑肌, 抑制内皮细胞增殖血小板聚集及活性氧产生而降低内皮细胞的氧化应激脂联素腹腔转染组大鼠肾组织中 ROS 含量虽仍高于正常组, 但较糖尿病组明显降低,eNOS 蛋白表达亦较糖尿病组上调本研究结果提示氧化应激参与了糖尿病肾病的发病机制而且脂联素对肾脏的保护作用与其抑制氧化应激反应有关有的学者认为脂联素是通过其特异性受体及不同信号传递通路发挥作用的, 但是目前对这方面的研 [15] 究尚少 Yamauchi 等用脂联素或 gacrp3 作用 C2C12 肌细胞后, 发现 AMP 激酶 (AMPK) 及乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACC) 增加, 在 C2C12 肌细胞表达脂联素受体 1(AdipoR1) 后, 上述效应更为明显, 说明脂联素通过与 AdipoR1 结合, 活化 AMPK 进而发挥生物学作用 AMPK 是存在于大多数哺乳动物组织中的一种蛋白激酶,AMPK 的激活有助于增加葡萄糖输 [15] 入, 脂肪酸氧化和胰岛素敏感性 Yamauchi 等研究认为脂联素的信号转导机制是通过激活 AMPK 起作用脂联素作为 AMPK 激活剂, 在骨骼肌细胞和肝细胞可激活 AMPK, 从而降低血糖 Philippe [16] 最新研究亦发现脂联素可通过与 AdipoR1 结合, 刺激肾小球固有细胞 ( 内皮细胞系膜细胞足突细胞 )AMPK 磷酸化, 认为可能与抗氧化和维持细胞生存有关本研究进一步观察到 DM 组大鼠 p-ampk 表达较对照组下调, 脂联素转染后 p-ampk 蛋白水平明显增加, AMPK 磷酸化增强, 证明脂联素在体内刺激 AMPK 磷酸化而进一步激活 enos, 抑制 ROS 产生发挥其肾保护作用而 DM 组大鼠 p-ampk 表达较对照组下调亦可部分解释进展期糖尿病肾病患者存在脂联素抵抗的原因本研究结果发现, 脂联素能减轻糖尿病大鼠肾脏损害的进展, 其机制可能与脂联素促进 AMPK 磷酸化, 抑制糖尿病大鼠氧化应激反应, 降低 ROS 生成和促进具有内皮保护作用的 enos 表达有关, 从而为 DN 的研究提供了另一途径参考文献 : [1] USRD%Report-incidence%and%prevalence%of%ESRD[J].%Am%J%Kidney% Dis,%23,%41(1):% [2] Suzuki% S, % Hinokio% Y, % Komauo, % et% al. % Oxidative% damage% to% mitochondrial%dna%and%its%relationship%to%diabetic%nephropathy[j].% Diabetes%Res%Clin%Pract,%1999,%45(223):%161. [3] Weyer%C,%Funahashi%T,%Tanaka%S,%et%al.%Hypoadiponectinemia% in% obesity%and%type%2%diabetes:%close%association%with%insulin%resistance% and%hyperinsulinemia [J]. %J%Clin%Endocrinol%Metab, %21, %86:% [4] Holst%JJ,%Binderup%M.%Fatty%tissue%and%insulin%resistance:%resistin%and% adiponectin[j].%ugeskr%laeger,%22,%164%(16):%2173. [5] Yilmaz%MI,%Saglam%M,%Qureshi%AR,%et%al.%Endothelial%dysfunction%in% type-2% diabetics% with% early% diabetic% nephropathy% is% associated% with% low%circulating%adiponectin[j].%nephrol%dial%%transplant,%28,%23 (5):% [6] Saraheimo% M, % Forsblom% C, % Fagerudd% J. % Serum% adiponectin% is% increased%in%type%1%diabetic%patients%with%nephropathy[j].%diabetes% Care,%25,%28(6):%141-%4. [7] Schalkwijk% CG, % Chaturvedi% N, % Schram% MT, % et% al. % Adiponectin% is% inversely% associated% with% renal% function% in% type% 1% diabetic% patients [J].%J%Clin%Endocrinol%Metab,%26,%91(1):% [8] Fujita%H,%Morii%T,%Koshimura%J,%et%al.%Possible%relationship%between% adiponectin% and% renal% tubular% injury% in% diabetic% nephropathy [J]. % Endocrine,%26,%53(6):% [9] Motoshima%H,%Wu%X,%Mahadev% K, % et% al. % Adiponectin% suppresses% proliferation%an%superoxide%generation%and%enhances%enos%activity% in%endothelial%cells%treated%with%oxidized%ldl[j].%biochem%biophys% Res%Commun,%24,%315:% [1] 葛倩, 邓华聪,% 刘金波.% 脂联素对血管内皮功能的影响 [J].% 中华内分泌代谢杂志,%26,%22(1):%15-8. [11] 郭啸华,% 刘志红,% 李恒,% 等.% 实验性 2 型糖尿病大鼠模型的建立 [J].% 肾脏病与透析肾移植杂志,%2,%9:% [12] 李青,% 刘殿武,% 肖永红,% 等.% 不同剂量不同载体不同途径的肝再生增强因子重组质粒抗大鼠肝纤维化疗效比较 [J].% 第三军医大学学报,%26,%28(18):% [13] Gross%ML,%Ritz%E,%Schoof%A,%et%al.%Comparison%of%renal%morphology% in%the%streptozotocin%and%the%shr/n-cp%models%of%diabetes[j].%lab% Invest,%24,%84(4):% [14] Hweta% B, % Rimi% S, % Sri% VM, % et% al. % Antioxidant% status, % lipid% peroxidation% and% nitric% oxide% end% product% s% in% patients% of% type% 2% diabetes%mellitus%with%nephropathy[j].%clin%biochem,%23,%36(7):% 557. [15] Yamauchi% T, % Kamom% J, % Ito% Y, % et% al. % Cloning% of% adiponectin % receptors%that%mediate%antidiabetic%metabolic%effects [J]. %Nature,% 23,%423:% [16] Cammisotto%PG,%Bendayan%M.%Adiponectin%stimulates%phosphoryl-% ation%of%amp-activated%protein%kinase%a%in%renal%glomeruli [J]. %J% Mol%Hist,%28,%39(6):%

中草药

中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (