期 陈 玲 张小玲 郝 扬 等 抗氧化剂 $% 乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的保护作用 2 # +' ( " &++ /$- 0# " # + " # & # # # - " 2 # # #- "" + # + ## " + # -" # " ++##+ "& " + # ' ( -

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!" #$# # %&'& & 基础研究 抗氧化剂 乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的保护作用 陈 玲 张小玲 郝 扬 史 强 王 静 张富军 王宝英 西安交通大学第一附属医院眼科 陕西西安 西安市儿童医院眼科 陕西西安 西安交通大学医学部 陕西西安 摘要 目的 探讨抗氧化剂 $% 乙酰半胱氨酸 $%&# ' #!#$ 对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的保护作用 方法 选用健康成年 &("#%& '# 雄性大鼠 月龄 只 体质量 *( 随机分组为正常对照组 +$ 组 只 和糖尿病组, 组 只 采用腹腔注射 (- 的链脲佐菌素 #./..! 01 溶液 ( ( 建立糖尿病大鼠模型 血糖.'- 者视为糖尿病大鼠动物模型成功 只 +$ 组注射等量的柠檬酸 % 柠檬酸钠缓冲溶液 将糖尿病大鼠模型随机分为糖尿病 月组和糖尿病 月组 每组 只 每只糖尿病模型大鼠左眼设定为糖尿病对照组 组 右眼设定为 $ 治疗组 $ 组 糖尿病大鼠病程 周时 $ 组玻璃体腔注射 - ( -$ 其余糖尿病大鼠玻璃体腔注射 -.'- 的 染色观察视网膜外核层厚度变化 透射电镜观察视网膜神经节细胞的超微结构变化 免疫荧光法检测视网膜神经节细胞的数量 结果 在不同的时间点上 $ 组较 组视网膜外核层厚度增加 而 $ 组与 +$ 组视网膜外核层厚度没有明显差异 2 透射电镜下 $ 组较 组视网膜神经节细胞中细胞器多 细胞质电子密度高 线粒体肿胀较轻 而 $ 组与 +$ 组相比视网膜神经节细胞超微结构无明显差异 在不同的时间点上 $ 组较 组视网膜神经节细胞数量增加 而 $ 组与 +$ 组视网膜神经节细胞数量没有明显差异 2 结论 抗氧化剂 $ 对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织有保护作用 关键词 抗氧化剂 $% 乙酰半胱氨酸 糖尿病 视网膜神经组织 大鼠中图分类号 3 文献标志码 2!"!# $ " ##% "! & # $ -!( 1 $4 &.%'!( + 6&!( 78 &!( $4:!( 1 $4"% "! $4 &.%!( # & #!. + &'.'.( # ' &#. &'. &!: &..!(! # &! # & #!. + &'.'.( &! ' #!. &' &! &!: &..!(! # #&' #!# #!# &!!& ' ' # # " ' # # ' ( " # & *"+ " "" " $,- $, - -* " +# (.' "" #,! &/ 0# 1 # + +"" # - "& - # """ # - " #+ &++ & (.' - 0# " - ++ # ## """ +# & ##+" + " # -"+ " "" + " " + " - # & # + " # - " #,- - ' ( + ' (& - " & ' (- 0# " 收稿日期 2 * 修回日期 基金项目 陕西省科技计划项目资助 '&$$ 2 $ " $# #" # 0# $ #'&$$ 2 通讯作者 张小玲 & & 0 &"&# 优先出版 ---&# & #+" & & &2& && + 2

2 期 陈 玲 张小玲 郝 扬 等 抗氧化剂 $% 乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的保护作用 2 # +' ( " &++ /$- 0# " # + " # & # # # - " 2 # # #- "" + # + ## " + # -" # " ++##+ "& " + # ' ( - #, &&2- ' ( " (.' " " " &2& " + # + ## ' ( " + # # " # +" + "+ # " -, & ' ( " " " + (.' # #&' ( " #"+ # " + #+ "-, & ' ("(.' " " " + # &2& " ' # # # # " # & ( * " ' # # " 糖尿病视网膜病变 &# #!. & 3 是糖尿病最为常见和严重的并发症之一 已经成为全球性四大主要致盲原因之一 预计到 年全球约 有 亿 3 患者 长期以来 人们认为 3 的主要病理改变为微血管损害 并把糖尿病血管损害作为其 % 特征性表现 近年来 随着研究的进一步深入和技术水平的不断提高 发现除了微血管损害外 3 还是一种神经组织的慢性退行性病变 并且在糖尿病初期即可发生 早于视网膜微血管病变 糖尿病早期 视网膜神经组织的损害主要表现在视网膜神经元和神经胶质细胞的功能损害 当出现上述改变时 视网膜微血管超微结构无变化 提示视网膜神经损害发 %2 生在微血管损害之前 < 3$ 等认为糖尿病大鼠在发病 * 周时可以加速视网膜神经节细胞的减少 抗氧化剂 $% 乙酰半胱氨酸 $%&# ' #!#$ 具 有抑制糖尿病视网膜新生血管生成的作用 然而 $ 对糖尿病大鼠视网膜神经节组织的作用则鲜有报道 本实验通过建立糖尿病大鼠早期视网膜神经组织损伤的模型 探讨 $ 对糖尿病大鼠早期视神经组织的保护作用 + 材料与方法 + + 实验动物及分组 选用健康成年 &("#% & '# 雄性大鼠 月龄 只 体质量 * ( 购自西安交通大学医学部实验动物中心 根据随机分组的原则 分为正常对照组 +$ 组 只 和糖尿病组, 组 只, 组大鼠禁食 后 一次性左下腹腔注射 (- 的链脲佐菌素 #./.%.! 01 溶液 ( ( 建立糖尿病大鼠模型 后 断尾取血 检测血糖 血糖.'- 者视为糖尿病大鼠动物模型成功 成模率为 *= 只 +$ 组腹腔注射等量的柠檬酸 % 柠檬酸钠缓冲溶液 将糖尿病模型大鼠随机分为糖尿病 月组, 和 糖尿病 月组, 每组 只 将每一只糖尿病模型大鼠左眼设定为糖尿病对照组 组 右眼设定为 $ 治疗组 $ 组 糖尿病大鼠病程 周时 对 $ 组大鼠玻璃体腔注射 $ - ( - 组大鼠则给予玻璃体腔注射等量.'- 的 每周 次 连续注射 次 不限饮食 饮水 分组喂养 糖尿病病程 月及 月时 每组各取 * 只大鼠 * 只眼 以 (- 水合氯醛腹腔注射麻醉处死大鼠 摘除眼球 制备标本 +,- 样本处理和.( 染色 将眼球角膜距角巩缘 2 针刺定位 固定脱水后常规包埋 根据针刺定位点过视神经垂直于子午线平面切成 2 厚的切片 每只眼选择 2 张切片 进行形态学观察 同时每张切片分别于视盘上缘 2 个视盘直径处选取 个视野 随后每隔 选取一个视野 每张切片共选取 2 个视野 测量视网膜外核层厚度 取平均值 +,/ 透射电镜标本的制备 将摘取的标本置于预冷的 2(- 戊二醛固定液中 于 > 固定 后 沿角膜缘剪开眼球 去除眼前节及玻璃体 仅剩眼杯后复置于固定液中固定过夜 次日取出复置于 2(- 戊二醛固定液中.'- 磷酸缓冲液浸洗!(- 四氧化锇固定液 > 后固定.'- 磷酸缓冲液浸洗! 乙醇梯度脱水 环氧丙烷置换! 环氧树脂 +$* 浸透 包埋 聚合后作半超薄切片 日本日立 % 透射式电子显微镜下观察 拍照 +,0 视网膜组织 $!+,+ 表达的测定 采用免疫荧光法检测 按照说明书操作 兔抗大鼠 0 % 多克隆抗体购于北京博奥森 工作浓度 270 标记山羊抗兔 7(4 购于北京博奥森 工作浓度 + 1 统计学方法 数据采用 * 软件进行统计学处理 表示 方差齐性者组间比较采用重复测量设计的方差分析 两两比较采用 $<% 检验 以 2 为差异有统计学意义

3 2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 - 结 果 - + 大鼠体质量及血糖的变化 糖尿病病程 月时 分别测量大鼠体质量及血糖 与对照组相比 糖尿病病程 月时 糖尿病组体质量明显减轻 血糖明显升高 差异均有统计学意义 表 大鼠视网膜视杆细胞内外节排列也较规则 +$- 厚度分别为 2 2@ * *@ 2 月 月组大鼠视网膜视杆细胞内外节较同一时间点正常组 $ 组排列稍紊乱 +$- 排列稍紊乱且厚度变薄 分别为 2@ *2 *@ 差异具有统计学意义 图 图 表 + 各组大鼠体质量及血糖比较 0&. &.!. # # (&! '.. ('". #&.!( #(." 组别 体质量 ( 血糖.'- +$ * +$ * *@ 2 与同时间点对照组比较 +$ 对照组, 糖尿病组 分别为 月 月 - - 视网膜外核层的厚度 正常对照 月 月组大鼠视网膜视杆细胞内外节排列规则 视网膜外核层 #."#!"'#& '& #. #!&+$- 厚度分别为 2 细胞排列紧密 数目较多 内外核层界限清楚 $ 月 月组 图 + 各组不同时间点视网膜 平均厚度的比较 (. &.!. #&! +$-!# &.!( # (." 与同一时间点正常对照组比较 与同一时间点 组比较 图 - 各组不同时间点视网膜组织的形态学改变 (,..'.( &' &!(#. #!& "# & # #! #.!!#&(." A 正常对照 月组 $ 月组 糖尿病对照 月组 正常对照 月组 $ 月组 糖尿病对照 月组 4 - 神经节细胞层 7 - 内网层 7$- 内核层 + - 外网层 +$- 外核层 - / 视网膜神经节细胞超微结构的变化 正常对照 月组及 月组视网膜神经节细胞的超微结构类似

4 期 陈 玲 张小玲 郝 扬 等 抗氧化剂 $% 乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的保护作用 2 电镜下可见神经节细胞中正常的细胞质 线粒体 内质网 高尔基体 细胞器数量较多 胞质的电子密度高 线粒体结构正常 无肿胀 可见线粒体嵴 图 图 而糖尿病 月组电镜下可见神经节细胞中细胞质小片溶解区 胞质电子密度低 线粒体肿胀 线粒体嵴模糊不清 变短 图 糖尿病 月组电镜下可见神经节细胞胞质大片溶解区 空泡变 性 胞质纤维化 电子密度更低 细胞器减少明显 线粒体更加肿胀且肿胀的线粒体数目增多 线粒体嵴更加模糊不清 甚至消失 图 $ 月组电镜下结构与正常对照组相似 可看到正常的细胞器结构及大量的线粒体 内质网 高尔基体 线粒体无肿胀 线粒体嵴清晰可见 图 图 4 7 图 / 各组病程 + 月时视网膜神经节细胞的超微结构的变化 ( &!(#. #!&'(&!('.! #'"' & "" #! & &.!#.!. &## 4A2 A 7A 正常对照 月组 糖尿病 月组 4 7$ 月组 - 0 视网膜神经节细胞数量的变化 正常对照组 月 月大鼠视网膜神经节细胞排列规则 紧密 数量较多 分别为 2 2@ * 个 $ 组 月 月大鼠视网膜视杆细胞内外节排列也较规则 紧密 视网膜神经节细胞数量分别为 **@ 2 个 2@ * 个 组 月 月大鼠视网膜神经节细胞数量较同一时间点正常对照组 $ 组排列稍紊乱 数量减少 分别为 个 2@ 个 差异均有统计学意义 图 2 图 / 讨 论长期以来 人们认为糖尿病的主要病理改变为微血管损害 对糖尿病的病理损害的研究主要集中在视网膜血管内皮细胞和周细胞组成的微血管损害上 近年来研究发现 3 发生在糖尿病初期 主要表现为视网膜神经元和神经胶质细胞的功能损害 大量研究显示 $ 抗氧化应激对糖尿病大鼠视网膜血 管具有保护作用 然而 $ 对糖尿病大鼠视网膜神经组织的作用尚不清楚 本实验采用 01 诱导建立糖尿病大鼠模型 应用

5 2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 图 0 各组病程 - 月时视网膜神经节细胞的超微结构改变 ( &!(#. #!&'(&!('.! #'"' & "" #! & &..!. &## 4A2 A 7A 正常对照 月组 糖尿病 月组 4 7$ 月组 染色 透射电镜 免疫荧光的方法从形态学观察糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的变化 染色发现 糖尿病 月时 视网膜神经组织已经发生病理变化 主要表现为视网膜外核层变薄 排列疏松 而正常对照组与 $ 组视网膜外核层厚度无明显变化 提示 $ 对早期糖尿病大鼠视网膜神经组织有保护作用 透射电镜下观察到糖尿病病程 个月时 与正常对照组及 $ 组相比 视网膜神经节细胞超微结构发生了比较明显的变化 主要表现为视网膜神经节细胞胞质减少 胞质电子密度减低 细胞器减少 尤以线粒体减少明显 线粒体肿胀 线粒体嵴开始变短 模糊不清 糖尿病病程 个月时与正常对照组及 $ 组相比 视网膜神经节细胞超微结构的改变更加明显 在病程 个月的基础上又出现了视网膜神经节细胞胞质大片溶解区 胞质纤维化 细胞器大量减少 线粒体肿胀 线粒体嵴消失 上述变化与文献报 * 道一致,++3 等在研究糖尿病大鼠视网膜神经节细胞时 也发现在糖尿病 月时大鼠视网膜神 经节细胞已发生损伤 与本实验研究结果一致 $ 月组与正常对照 月组相比视网膜神经节细胞的超微结构无明显变化 提示 $ 对糖尿病大鼠早期视网膜神经节细胞具有保护作用 0 % 是存在于视网膜神经节细胞胞膜或胞体上的一种特异性的糖蛋 白 3$ 0 - 等研究发现 0 % 是啮齿动物视网膜神经节细胞的特异性标记物 本研究结果显示 糖尿病大鼠 月时 视网膜神经节细胞较正常对照组分别减少约 = *= 而 $ 月组 与正常对照组相比均没有差异 同样 -7 等在研究糖尿病大鼠视网膜神经节细胞中也得出相似的结果 提示 $ 的抗氧化应激对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织具有保护作用 糖尿病引起的视网膜神经组织的病变 除了高血糖的影响外 视神经周围血管的低灌注以及缺血缺氧引起的神经营养因子供给减少等原因可能是其发生发展的主要原因之一 在用高糖培养的视网膜细胞中及糖尿病动物模型 糖尿病患者的血液中均可检测

6 #期 陈 " 玲& 张小玲& 郝 " 扬& 等,抗氧化剂 6 7乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠早期视网膜神经组织的保护作用 到活性氧量的增多&而在正常情况下&体内的活性氧可 以被一些抗氧 化 的 防御 系统 所清除 ( &$ 7 &! '糖尿病 时& P$! 成&清除自由基&调节细胞代谢活性和细胞凋亡程序等 作用'体内实验发现 6<= 能提高红细胞*肝脏组织和 由于体内血糖的增高&这些抗氧化酶类活性减低*抗氧 肺组织中细胞内 的 谷 胱 甘 肽 水 平(&#'体 外 实 验 亦 发 化防御系统崩溃&加剧了氧化应激对机体组织的损伤' 现细胞 在 含 有 6<= 的 生 长 介 质 中 具 有 很 强 的 摄 取 ( 6<= 的能力&并可利用它进行谷胱甘肽合成 &P ' 6<= 是一 种 含 巯 基 的 抗 氧 化 剂&具 有 干 扰 自 由 基 生 图 I" 免疫荧光法检测各组大鼠视网膜神经节细胞 Y PH( F32 :J 8 :4.1/JJ43F Z 4F : 2 图中箭头所指为显色的视网膜神经节细胞的胞膜及树突'<* A#正常对照 &* $ 月组大鼠视 网 膜 神 经 节 细 胞 荧 光 强&且 排 列规则*紧密*整齐&数量多% M* O# 6<=& 月组大鼠视网膜神经节细胞荧光强度及细胞数量*排列 规 则 及 紧 密 程 度 与 正 常 对照组相似% =* Y#糖尿病 &* $ 月组视网膜神经节细胞荧 光 强 度 较 同 时 间 点 正 常 对 照 组 及 6<= 组 弱&且 细 胞 排 列 疏 松* 不规则*不紧密' "" 本研究结果显示糖尿病大鼠早期&视网膜神经节 细胞数量减少&视网 膜 外 核 层 厚 度 变 薄&外 核 层 细 胞 排列疏松且不规则&并随病程的延长呈现加剧的变化 趋势'给予 6<=&外 源 性 补 充 抗 氧 化 物 质 对 内 源 性 的视网膜抗氧化系统也有加强保护作用&使糖尿病引 起的视网膜神经组织氧化损伤减轻&视网膜神经节细 胞及视网膜外核层细胞丢失减少&从而对视网膜神经 组织起到保护的作用'其作用机制可能是#% 具有清 除视网膜 组 织 中 活 性 氧 并 且 抵 御 氧 化 应 激 的 作 用% 图 K" 各组大鼠视网膜神经节细胞" L>J#数量的比较 & 降低血管内皮生长 因 子 等 在 视 网 膜 组 织 中 过 量 的 表达%' 提高机体内 谷 胱 甘 肽 的 含 量&有 效 地 清 除 体 Y ' =FJ*8 : F3F Z (2 F43 :F Z F32 内多余的活性氧&对 视 网 膜 神 经 节 细 胞 起 保 护 作 用% 8JF3@ (@ F4*: (6<= 通过调节凋亡相关基因的变化达到 抑 制细 胞 凋亡的 目 的&从 而 对 视 网 膜 神 经 组 织 起 到 保 护 作 与同时间点正常对 照 组 比 较&'! $%, %&%与 同 时 间 点 A 组 比 较& $!$%, %&' 用 (&''当然& 6<= 除 了 具 有 清 除 活 性 氧 自 由 基*抵 $$+++, $$/001, (./01, 23%( 0 4,.4, 23 *# *# -

7 2 西安交通大学学报 医学版 第 卷 抗氧化应激外 还有广泛的生物学作用 因此 $ 发挥视网膜神经组织的保护作用可能还涉及其他相关机制 有待进一步深入研究 参考文献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刘晶晶 刘丹 &' 乙酰半胱氨酸对大鼠挫伤性视网膜病变的保护作用 & 国际眼科杂志 * & 编辑 邱 芬 上接第 2 页 & 2$4( 7! 7 '4 ( & + '4$243., 3 / (24$ & $ "# (,2" + "# # # +# " " +&4.#* & # # # " " +& 戴淼 黄芸 &(,2 在动脉粥样硬化血管新生中的研究进展 & " " $ *2 * & 中华老年多器官疾病杂志 ** *& '4(2. $$ $!/ % %%& " " " ( (! 4 $3,! 4, & +# + "- " "#" ",7 (% 7 (,2"24 # *" +" "24 " + +&' &4++(/ *** *& 2& 4,, 3 *, * & " + # * 邱亚双 周慧芳 &24 和 % 7 在喉癌中的表达及其与血管 #+ " - # 生成的关系 & 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 * "# # 24 # * & # # " - # $2 $234! (2 &4#" % 7 &/ ( +* 2 & #" - # " "# # 3*.'$$.'7 &$ - - # ## &( "# # " # - / # & 2 " + " # +! 3. 2 '7($(2 ' * &7# " ( # ####&( (#2 * # "- #" - # & #" - # # - 编辑 邱 芬 +### + - &$ *2

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