第 5 期 王国贤, 等.α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响 379 cantly,mesangialwideningthecapilarylumenpresure,glomerularbasementmembranethickening,renal
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1 第 22 卷第 5 期 2012 年 9 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.22 No.5 Sept.2012 α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响 王国贤, 康雅萍, 李飞 ( 辽宁医学院药理学教研室, 辽宁锦州 ) [ 摘要 ] 目的 : 通过 α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1(transforminggrowthfactor β1,tgf β1) 结缔组织生长因子 (connectivetisuegrowthfactor,ctgf) 表达的影响, 研究其延缓肾脏纤维化的作用及机制, 为临床防治糖尿病肾病提供实验依据 方法 : 将 50 只健康 SD 大鼠随机分为正常对照组, 糖尿病模型组和 α 硫辛酸低 中 高剂量组 采用链脲佐菌素 (streptozocin,stz) 以 60mg/kg 于左下腹腔一次性注射建立大鼠糖尿病模型 α 硫辛酸低 中 高剂量组分别按 mg/(kg d) 灌胃 12 周 检测各组大鼠的血糖 肾重指数, 制备肾脏石蜡切片, 测定肾小球平均截面积 (MGA) 并计算肾小球平均体积 (MGV) 用 SureStepPlus 型血糖仪于实验结束前检测空腹血糖 ; 经 HE 染色, 光镜下观察肾小球体积, 肾小球基底膜变化, 用免疫组化法检测肾组织 TGF β1 CTGF 的表达 结果 : 与正常组相比, 模型组大鼠血糖明显升高 ; 与模型组相比,α 硫辛酸各剂量组大鼠血糖显著降低 ; 糖尿病模型组大鼠肾重指数明显增加, 光镜显示糖尿病模型组大鼠的肾小球体积明显增大, 系膜区增宽, 毛细血管管腔受压, 肾小球基底膜增厚, 肾组织 TGF β1 CTGF 蛋白表达明显降低 ; 糖尿病模型组 MGA 和 MGV 明显扩大, 与其相比,α 硫辛酸各剂量组有不同程度的缩小 结论 :α 硫辛酸通过抑制肾组织 TGF β1 CTGF 的表达而发挥其抗纤维化的作用, 从而延缓 STZ 糖尿病大鼠肾脏纤维化的发展 [ 关键词 ] α 硫辛酸 ; 糖尿病肾病 ; 转化生长因子 ; 结缔组织生长因子 [ 中图分类号 ] R587.1 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2012) Efectofα lipoicacidonexpresionoftransforminggrowthfactorβ1and connectivetisuegrowthfactorindiabeticnephropathyofrats WANGGuo xian,kangya ping,lifei (DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalColege,JinzhouLiaoning121001,China) [Abstract] Objective:Transforminggrowthfactor(TGF β1)indiabeticnephropathyrenaltisueofrats byα lipoicacidonexpresionofconnectivetisuegrowthfactor(ctgf),tostudythedelayoftheroleand mechanismsofrenalfibrosis,toprovideexperimentalbasisforthepreventionandtreatmentofdiabeticne phropathy.methods:fiftyhealthysd ratsweredividedrandomlyinto5groups:normalcontrolgroup, modelofdiabetesgroup,α lipoicacid15,30,60mg/(kg d)dosegroup.stzsingleinjectionof60mg/ kginthelowerleftabdominalratmodelofdiabetes.α lipoicacidislow,mediumandhighdosegroups, respectively,15,30,60mg/(kg d)oralyfor12weeks.detectedineachgroupofbloodglucose,kidney weightindex,andhadthepreparationofkidneyparafinsections,todeterminateglomerularvolume(mga) andcalculatetheaverageglomerularvolume(mgv).fastingbloodglucosewasdetectedbeforetheendof theexperimentwithsurestepplus;hestainingunderthelightmicroscopewasperformedtoobservethe changesinglomerularvolume,glomerularbasementmembrane;renaltisuetgf β1andctgfexpresion wasdetectedbyimmunohistochemicalmethod.results:comparedwithnormalgroup,bloodglucoseindi abeticratswassignificantlyincreased;bloodglucoseinα lipoicacidtreatmentgroupwassignificantlyre ducedcomparedwiththediabeticgroup;indiabeticmodelrats,kidneyweightindexwassignificantlyin creased,lightmicroscopyshowedthatglomerularvolumeofratsindiabeticmodelgroupincreasedsignifi [ 作者简介 ] 王国贤 (1962 ), 女, 辽宁北票人, 教授, 硕士生导师, 主要从事心血管药理学研究
2 第 5 期 王国贤, 等.α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响 379 cantly,mesangialwideningthecapilarylumenpresure,glomerularbasementmembranethickening,renal tisuetgf β1andctgfproteinexpresionwasdecreased;diabeticmodelgroupmgaandmgvexpanded significantly,comparedwiththetreatmentgrouptherewerevaryingdegreesofnarowing.conclusion:α lipoicacidtoplayitsanti fibrosisbyinhibitingtherenaltisueoftgf β1andctgfexpresion,anddela yingthedevelopmentofdiabeticratkidneyfibrosis. [Keywords] α lipoicacid;diabeticnephropathy;transforminggrowthfactor;connectivetisuegrowth factor 糖尿病肾病 (diabeticnephropathy,dn) 危害性极大, 在西方国家已成为终末期肾病的首要原因, 为 Ⅰ 型糖尿病患者的主要死因, 在 Ⅱ 型糖尿病其严重性仅次于冠状动脉和脑血管动脉粥样硬化病变, 国内外学者对糖尿病肾病病变进行了大量的研究 探讨糖尿病肾病的发病机制, 争取有效地控制其发生发展, 对降低糖尿病患者的临床死亡率具有重要意义 很多细胞因子在糖尿病肾病中发挥重要作用, 其中转化生长因子 β1(transforminggrowthfactor β1,tgf β1) 被认为是致纤维化因子中最重要的一个, 而新近研究发现的结缔组织生长因子 (connec tivetisuegrowthfactor,ctgf) 是 TGF β1 发挥作用的下游信号介质, 是导致组织间质纤维化的重要因素, 在糖尿病肾病的发生过程中发挥重要作用 α 硫辛酸是一种含硫的抗氧化剂, 清除活性氧和自由基, 对氧化应激引起的组织损伤有治疗作用 本文研究 α 硫辛酸是否通过其高效抗氧化应激效应, 改善葡萄糖代谢及细胞内外环境, 调节脂代谢等多种调控作用, 改变 TGF β1 CTGF 的表达, 从而延缓糖尿病肾病肾脏纤维化的进程, 改善糖尿病肾病 1 材料和方法 1.1 试剂与仪器 α 硫辛酸购于美国 Sigma 公司, 实验时将其溶于生理盐水中配成所需浓度分别为 15,30,60mg/kg 链脲佐菌素 (streptozocin,stz) 购于美国 Sigma 公司 SureStepPlus 血糖检测仪由美国强生公司提供 兔抗鼠 TGF β1 CTGF 抗体均购自北京博奥森公司 1.2 动物分组及模型制备健康雄性 SD 大鼠 50 只, 体质量 250~300g, 由辽宁医学院实验动物中心提供 (scxk 辽 ) 空腹 12h 后 40 只大鼠以 60mg/kg 剂量 STZ 于左下腹腔一次性注射, 另 10 只注射枸橼酸缓冲液当做正常对照组 72h 后尾静脉取血测定血糖, 将血糖浓度 16.7mmol/L 定为糖尿病造模成功, 低于此值者弃去 将造模成功 36 只大鼠随机分 为糖尿病模型组和 α 硫辛酸低 中 高剂量组 模型组给予生理盐水灌胃作为对照,α 硫辛酸 3 个剂量组分别应用 α 硫辛酸 mg/(kg d) 灌胃 12 周 各组均予普通饲料喂养 12 周, 观察一般状态 1.3 血糖测定用 SureStepPlus 血糖仪于实验结束前检测空腹血糖 1.4 肾组织固定与切片 10% 甲醛固定后的肾组织, 脱水透明, 石蜡包埋, 常规切片 苏木精 - 伊红染色 (HE) 法染色 光镜下观察各组形态学改变 1.5 免疫组化检测采用 SP 免疫组化法检测 TGF β1 和 CTGF 蛋白表达, 以 PBS 替代一抗为阴性对照 具体方法按试剂盒说明书进行操作 采用 CM 2000B 生物医学图像分析系统测量切片 TGF β1 CTGF 的平均灰度值 1.6 肾重指数 肾小球平均截面积 (MGA) 及肾小球平均体积 (MGV) 的测定肾重指数 (mg/g)= 右侧肾重 / 体质量 应用 CIAS 1000 型细胞图像分析系统对病理染色切片 ( 400) 进行图像分析 每个切片随机选择 8 个正切的肾小球, 测定截面积, 取其平均值作为每个标本的 MGA, 并根据公式 MGV=1.25 (MGA) 3/2 计算 MGV 比较 MGA MGV 变化 1.7 统计学处理所有数据均采用 () 表示, 统计学处理采用单因素方差分析及 LSD t 检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 α 硫辛酸对糖尿病大鼠血糖的影响大鼠注射 STZ 后血糖水平显著升高, 模型组大鼠呈明显的多饮 多食 多尿症状, 并伴不同程度的精神萎靡 α 硫辛酸各剂量组的大鼠一般情况较好, 三多一少 症状较模型组明显减轻 给 STZ 后 12 周糖尿病组大鼠血糖明显高于正常对照
3 380 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷 组 α 硫辛酸各剂量组血糖均显著低于糖尿病模型组, 尤以中剂量组改善最为明显 见表 1 表 1 各组大鼠血糖值和肾重指数比较 Tab1 Efectsofα lipoicacidonbloodglucoseandkidneyweightindexindiabeticrats 组别 n 剂量 (mg/kg d) 肾重指数 (mg/g) 血糖 (mmol/l) 正常对照组 ± ±0.90 模型组 ±1.25 a 25.22±2.19 a α 硫辛酸低剂量组 ±1.22 b,d 22.19±1.78 b,c α 硫辛酸中剂量组 ±0.34 b,d 14.42±1.95 b α 硫辛酸高剂量组 ±0.34 b 20.39±1.18 b,c F 值 a:p<0.01, 与正常组比较 ;b:p<0.01, 与模型组比较 ;c:p<0.01, 与中剂量组比较 ;d:p<0.01, 与高剂量组比较 2.2 α 硫辛酸对糖尿病大鼠肾重指数的影响与正常组相比, 模型组肾重指数明显升高 (P< 0.01); 与模型组相比, 不同浓度 α 硫辛酸给药组的肾重指数有不同程度的降低 (P<0.01), 低 中剂量组明显高于高剂量组 (P<0.01) 见表 α 硫辛酸对糖尿病大鼠 MGA 和 MGV 的影响与对照组比较, 模型组 MGA MGV 明显增大, 差异有统计学意义 (P<0.01); 而与模型组比较, α 硫辛酸 3 个剂量组均有不同程度缩小, 差异有统计学意义 (P<0.01) 见表 2 表 2 α 硫辛酸对 STZ 糖尿病大鼠肾小球平均截面积及肾小球平均体积的影响 Tab2 Efectsofα lipoicacidonmgaandmgvindiabeticrats 组别 n 剂量 (mg/kg d) MGA( 10 2 μm 2 ) MGV( 10 6 μm 3 ) 正常对照组 ± ±0.49 模型组 ±56.32 a 12.96±1.61 a α 硫辛酸低剂量组 ±36.68 b,c 8.18±0.87 b,c α 硫辛酸中剂量组 ±24.29 b,c 6.54±0.56 b,c α 硫辛酸高剂量组 ±16.07 b 5.49±0.45 b F 值 a:p<0.01, 与正常组比较 ;b:p<0.01, 与模型组比较 ;c:p<0.01, 与高剂量组比较 2.4 α 硫辛酸对糖尿病大鼠肾组织 TGF β1 CTGF 表达的影响 TGF β1 在正常组肾组织中显示为少量棕黄色染色 ; 模型组 TGF β1 表达即明显增多, 在肾小球 肾小管 肾小球系膜细胞中均显示为明显棕 黄色染色 ;α 硫辛酸各剂量组染色逐渐变浅趋向正常组 CTGF 在正常组肾组织中显示为少量棕黄色染色 ; 模型组 CTGF 表达即明显增多, 在肾小球 肾小管 肾小球系膜细胞中均可见明显棕黄色染色, 见图 1 图 1 各组肾组织 TGF β1 CTGF 的表达 (SABC 400) Fig1 ExpresionofTGF β1andctgfinthefivegroups(sabc 400)
4 第 5 期 王国贤, 等.α 硫辛酸对糖尿病肾病模型大鼠肾组织转化生长因子 β1 和结缔组织生长因子表达的影响 381 免疫组织化学染色结果显示, 与正常对照组相比, 模型组中 TGF β1 CTGF 灰度值显著降低 (P< 0.01); 而与模型组相比,α 硫辛酸各剂量组 TGF β1 CTGF 灰度值显著升高 (P<0.01), 以高剂量组效果最明显 灰度值越低, 则蛋白表达越高 见表 肾组织染色分析 HE 染色结果显示, 细胞核呈蓝紫色, 细胞质呈粉红色, 基底膜 胶原纤维和肌纤维呈红色, 见图 2 肾脏组织病理学变化显示, 石蜡切片经 HE 染色与正常组比较, 模型组大鼠肾小球体积明显增大, 系膜区增宽, 毛细血管管腔受压, 肾小球基底膜增厚,α 硫辛酸低 中 高剂组上述异常情况有所改善 ; 尤以中剂组效果最明显, 但是未恢复至正常状态 表 3 α 硫辛酸对糖尿病大鼠肾组织 TGF β1 CTGF 灰度值的影响 Tab3 Efectofα lipoicacidontgf β1andctgf expresioninthekidneyofdiabeticrats 组别 n CTGF TGF β1 正常对照组 ± ±13.62 模型组 ±6.43 a 29.43±7.59 a α 硫辛酸低剂量组 ±7.82 b,c 51.06±8.86 b,c α 硫辛酸中剂量组 ±6.77 b,c 67.85±7.22 b,c α 硫辛酸高剂量组 ±14.58 b 86.72±7.75 b F 值 a:p<0.01, 与正常组比较 ;b:p<0.01, 与模型组比较 ;c:p< 0.01, 与高剂量组比较 图 2 各组肾组织病理改变 (HE 400) Fig2 Pathologicalchangeinthefivegroups(HE 400) 3 讨论糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一, 已经成为终末期肾病的首要病因 其主要病理改变特点为系膜基质增多和肾小球毛细血管基底膜的增厚, 表现为 TGF β1 CTGF 升高 α 硫辛酸治疗 12 周后肾脏纤维化得到明显改善,TGF β1 CTGF 均有所降低 [2] 近年来临床和动物实验证明细胞因子和糖尿病肾病的病理改变及临床表现密切相关 其中 CTGF 具有促进细胞增殖分化 血管生成 基质合成积聚等作用 在糖尿病肾病导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化的过程中,CTGF 是关键性细胞因子之一, 可能作为 TGF β1 的下游调节因子, 参与纤维化过程 [4-5] 本实验中,α 硫辛酸可降低 CTGF 的表达, 且随着药物浓度增高 CTGF 含量降低越明显, 呈剂量依赖性 在健康人肾脏中, 肾小球壁层上皮细胞 脏层上皮细胞 肾间质成纤维细胞 肾小球和肾小管周围毛细血管内皮细胞均可产生少量 CTGF, 在伴有细胞增生及细胞外基质沉积的各种炎症性的肾小球和肾小管间质病变, 如糖尿病肾病 IgA 肾病 膜增生性 肾小球肾炎 局灶性肾小球硬化 新月体性肾小球肾炎,CTGF 的表达明显增多 CTGF 的阳性细胞数与肾间质纤维化的严重程度呈显著正相关 CTGF 的表达增加是增生性或纤维化性肾脏疾病中的普遍现象 α 硫辛酸可明显降低肾脏组织 CTGF TGF β1 表达, 改善 CTGF TGF β1 失衡, 致使胶原合成减少, 纤维化程度减轻, 对肾脏组织起到了保护作用 [ 参考文献 ] [1]GrosO,Schulze LohofE,KoepkeML,etal.Antifibrot ic,nephroprotectivepotentialofaceinhibitorvsat1an tagonistinamurinemodelofrenalfibrosis[j].nephrol DialTransplant,2004,19(7): [2] 刘娜, 严海东. 肾间质纤维化的发生机制及防治新进展 [J]. 国际泌尿系统杂志,2009,29(1): [3]BrigstockDR.TheCCNfamily:anewstimuluspackage [J].JEndocrinol,2003,178(2): [4]GaoR, Brigstock DR.Connectivetisuegrowth factor (CCN2)inducesadhesionofratactivatedhepaticstelate celsbybindingofitsc terminaldomaintointegrinalpha (v)beta(3)andheparansulfateproteoglycan[j].jbiol Chem,2004,279(10): ( 下转第 386 页 )
5 386 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷 [ 参考文献 ] [1]PhanishMK,WinnSK,DockrelME.Connectivetisue growthfactor (CCN2):amarker,mediatorandtherapeu tictargetforrenalfibrosis[j].nephronexpnephrol, 2010,114(3):e [2]DharA,RayA.TheCCNfamilyproteinsincarcinogene sis[j].exponcol,2010,32(1):2-9. [3]KwonS,MunroeX,CrawleySC,etal.Expresionof connectivetisuegrowthfactorinpancreaticcancercel lines[j].intjoncol,2007,31(4): [4] 许斌, 陈寅, 戴桂红, 等. 转染 CTGF 基因对乳腺癌细胞 MMP 2 及 TIMP 2 表达的影响 [J]. 江苏大学学报 : 医学版,2012,22(2): [5] 于鸿, 黄俊星, 王朝夫, 等.Smad7 反义寡核苷酸对胰腺癌 SW1990 细胞 MMP 2 和 TIMP 2 表达及细胞增殖的影响 [J]. 中华胰腺病杂志,2012,12(1): [6]YuH,ZhaoG,LIH,etal.Candesartanantagonizes presure overload evoked cardiac remodeling through Smad7gene dependentmmp 9suppresion[J].Gene, 2012,497(2): [7]BennewithKL,HuangX,Ham CM,etal.Theroleof ( 上接第 381 页 ) [5]GaoR,BrigstockDR.Lowdensitylipoproteinreceptor re latedprotein(lrp)isaheparin dependentadhesionre ceptorforconnectivetisuegrowthfactor(ctgf)inrat activatedhepaticstelatecels[j].hepatolres,2003,27 (3): [6]LamS,vanderGeestRN,VerhagenNA,etal.Connec tivetisuegrowthfactorandigf Iareproducedbyhuman renalfibroblastsandcooperateintheinductionofcolagen tumorcel derivedconnectivetisuegrowthfactor(ctgf/ CCN2) in pancreatictumorgrowth[j].cancerres, 2009,69(3): [8]AikawaT,GunnJ,SpongSM,etal.Connectivetisue growthfactor specificantibodyatenuatestumorgrowth, metastasis,andangiogenesisinanorthotopicmouseof pancreaticcancer[j].molcancerther,2006,5(5): [9]SungHJ,Kim Y,KangH,etal.Inhibitoryefectof Troloxonthemigrationandinvasionofhumanlungand cervicalcels[j].intjmolmed,2012,29(2): [10]WuYC,WangPH,TsaiA,etal.Semi quantitativeex presionoftisueinhibitorofmatrixmetaloproteinase 2in cancerofuterinecervix[j].jsurgoncol,2011,104 (2): [11]PicklesM,LeaskA.AnalysisofCCN2promoteractivity inpanc 1cels:regulationbyras/MEK/ERK[J].JCel CommunSignal,2007,1(2): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 陈海林 productionbyhighglucose[j].diabetes,2003,52(12): [7]AbreuJG,KetpuraNI,ReversadeB,etal.Connective tis suegrowthfactor(ctgf) modulatescelsignalingby BMPandTGF beta[j].natcelbiol,2002,4(8): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 郭欣
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