宋锦叶等黄芪当归合剂对 - 肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用 ; 慢性肾衰竭是各种肾疾病持续进展的最终结局其主要的病生理过程表现为肾组织炎症细胞浸润肾固有细胞出现活化增殖凋亡或转分化多种细胞因子的异常表达在细胞间形成相互作用的复杂调控网络导致细胞外基质?

Size: px

Start display at page:

Download "宋锦叶等黄芪当归合剂对 - 肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用 ; 慢性肾衰竭是各种肾疾病持续进展的最终结局其主要的病生理过程表现为肾组织炎症细胞浸润肾固有细胞出现活化增殖凋亡或转分化多种细胞因子的异常表达在细胞间形成相互作用的复杂调控网络导致细胞外基质?"

铨昶靳
5 years ago
Views:

1 北京大学学报医学版 ; 黄芪当归合剂对! 肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用宋锦叶李深孟立强屈磊李晓玫北京大学第一医院肾内科北京大学肾脏疾病研究所卫生部肾脏疾病重点实验室北京论著摘要目的探讨复方中药黄芪当归合剂 N 对残余肾慢性肾衰竭大鼠的抗肾纤维化疗效方法采用 - 肾切除制备残余肾慢性肾衰竭大鼠模型以血管紧张素转换酶抑制剂类药物依那普利 5 作为阳性对照药物将大鼠随机分为假手术组组 - 肾切除术模型组组 N 治疗组 N 组给予生药每天每千克体重各和 5 治疗组 5 组给予 5 每天每千克体重于造模后第周分析各组动物尿蛋白血清肌酐及尿素含量光镜下观察肾组织病理改变并测定肾小球面积免疫组化检测肾皮质纤维连接蛋白 3 型胶原在肾小球和肾间质的表达情况结果与组相比造模后组肌酐及尿素增高每日尿蛋白量持续增多肾病理显示肾小球增大渐进性肾小球系膜细胞及系膜基质增多及肾小球硬化造模后第和周肾小球内 3 及积聚显著增加与组相比 N 组在第和周具有降低尿蛋白的作用均 N 治疗后第周时肾小球系膜细胞增生和系膜基质积聚明显减少肾组织中 3 和均第周时硬化肾小球数目显著减少肾间质纤维化病变明显减轻肾组织中 3 和均但 N 并未能改善肾功能 N 疗效与 5 基本相同结论在残余肾慢性肾衰竭大鼠模型中 N 具有减少细胞外基质成分沉积减轻肾小球硬化和肾间质纤维化病变的肾保护作用其疗效可能是通过其早期开始并持续降低尿蛋白的肾损伤作用而实现的关键词黄芪当归肾功能衰竭肾小球硬化症病灶性中图分类号文献标识码文章编号 ! - 03; 84 53;8 < B = -? 55 5? N - N 5?? 3 -?? 3 @ N - N?? 基金项目国家自然科学基金重点项目资助 3?!

2 宋锦叶等黄芪当归合剂对 - 肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用 ; 慢性肾衰竭是各种肾疾病持续进展的最终结局其主要的病生理过程表现为肾组织炎症细胞浸润肾固有细胞出现活化增殖凋亡或转分化多种细胞因子的异常表达在细胞间形成相互作用的复杂调控网络导致细胞外基质??5 过度沉积最终导致肾小球硬化和 - 或肾间质纤维化 > 由于全身及肾局部多种因素参与了肾疾病的慢性进展过程尽管已有循证医学证据提示抑制肾素血管紧张素系统的药物能够延缓疾病进展但仍难以阻断的发生 > 在慢性肾病的防治方面祖国传统医学积累了许多宝贵经验 > 包括黄芪当归大黄淫羊藿人参虫草等在内的多味中药或组方对降低尿蛋白减轻肾病理损害改善患者氮质血症等具有较好疗效深入研究中药的作用机制有助于充分发挥中医药在防治肾疾病进展中的作用在以往治疗肾病的中药组方中黄芪 55; 和当归 5 是常用的两味中药本研究所在中医治疗慢性肾炎益气活血化瘀治疗原则以及传统中药当归补血汤基础上将该两味中药制成黄芪当归合剂 55 5 N 经系列临床和实验研究证实 N 能够减轻肾病综合征蛋白质及脂质代谢紊乱且在不影响系统活性的情况下能减少肾内 5 聚积减轻肾小球硬化和肾间质纤维化程度 > 但 N 是否在阶段仍可起到肾保护作用尚有待证实本研究利用 - 肾切除所致的大鼠模型动态观察 N 在病变进展过程中对肾功能及肾 5 积聚的影响及其可能机制以期明确 N 在防治中的保护作用为今后的临床应用提供理论依据材料与方法药品称取等量黄芪 = 购自山西浑源干燥根和当归 5 04 购自甘肃岷县干燥根按本研究所以往方法制备成含黄芪当归生药各 -8 的 N 水煎液药物的购买和质检由北京大学药学院天然药物与仿生药物学系蔡少青教授课题组协助完成杭州默沙东制药有限公司生产的血管紧张素转换酶抑制剂依那普利批号作为阳性对照动物模型制备与标本收集雄性 9 级大鼠只体重 A 购自北京维通利华实验动物技术有限公司动物合格证京实验前测定两次尿蛋白定性均阴性 9 级动物饲养室内恒温 F 条件下饲养给予鼠用全价营养颗粒饲料过柱水自由饮用每天照明按随机数字表随机分为假手术组组模型组组 N 治疗组 N 组和 5 治疗组 5 组组质量分数戊巴比妥钠 - 腹腔注射麻醉大鼠距左脊肋骨处斜向外方切口暴露左侧肾分离肾周围脂肪囊用丝线离断结扎上下极肾组织约 - 周后再次手术切除整个右肾两次手术共切除 - 肾组大鼠两次手术时仅暴露肾剥离肾周脂肪组织自第次手术大鼠清醒后即开始灌胃给药 N 组给予相当于黄芪当归生药每天每千克各 5 组给予 5 每天每千克组和组则给予 8 水实验过程中动物自由饮食模型制备后的第和周随机选取各组中 A 只动物置入代谢笼收集尿液测定尿蛋白量经腹主动脉留全血测定血生化指标切除残余肾或同侧肾体积分数中性甲醛溶液固定以备病理学指标检测剩余肾组织迅速置液氮保存主要试剂及仪器小鼠抗人型胶原抗体购自 0 公司小鼠抗人纤维连接蛋白 3 抗体购自美国公司生物素标记的马抗小鼠 4 ; 辣根过氧化物酶偶联链霉卵白素显色底物 = 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司实验所用主要仪器包括医学彩色图像分析系统 4 9 美国公司型紫外分光光度仪型自动生化分析仪美国 =5 3 公司 5 型透射电镜日本电子公司血清生化指标及尿蛋白定量测定由北京大学第一医院检验科生化室专人测定血清

3 北京大学学报医学版 ; 肌酐和尿素尿蛋白排泄率? 由作者应用 = 法测定病理学观察肾组织标本行 5 和 9 染色在光学显微镜下单盲法观察分析肾病理变化应用计算机图像分析系统对肾小球面积进行半定量分析即在低倍视野下每张切片随机选取个横切面含血管极和尿极的肾小球测量其面积后取均值为肾小球平均面积! 免疫组化 9 法 A 体积分数 0 甲醇灭活内源性过氧化物酶质量分数小牛血清白蛋白封闭加抗抗体体积比 H 或抗 3 抗体体积比 H F 过夜生物素标记二抗体积比 H F 辣根酶标卵白素体积比 H F = 显色苏木素复染中性树脂封片每组均以 9= 代替一抗作为阴性对照每张切片随机选取个含肾小球的高倍视野应用图像分析系统计量 3 阳性表达面积占每个肾小球区域面积的百分比统计学分析计量资料结果用表示应用 9 统计软件进行分析多组间比较采用单因素方差分析及 3 检验为差异有统计学意义结果各组大鼠肾功能及尿蛋白量的变化在各个时间点组大鼠的血肌酐尿素水平及均相对稳定无明显变化与以往研究结果相近组在第周时与组相比血肌酐 -8-8 尿素 -8-8 即明显升高此后持续增高并维持在高水平但是与组相比无论 5 或 N 治疗后均未能降低血肌酐尿素水平具体数据未列出组在造模后第周始明显增多表达同期组的倍此后持续增多于第第周分别达到组的倍倍均与组相比 5 治疗第第均而 N 治疗后于第周即显著降低在第周时较均各组大鼠肾组织病理学的变化 5 染色和 9 染色后光镜下观察组在各时间点的肾小球和肾小管间质形态正常组在造模后第周时即可见肾小球体积增大肾小球系膜细胞和基质增生第周时出现肾小管局灶肥大扩张肾小管上皮细胞空泡变性第周时肾小球系膜细胞和基质增生更为显著部分小球出现局灶节段硬化肾间质出现小灶状炎细胞浸润纤维化及小动脉壁增厚第周时多数肾小球中到重度系膜细胞和基质增生可见球囊黏连及局灶节段硬化甚至球性硬化肾小管呈多灶状片状扩张可见管型及上皮细胞刷状缘脱落肾间质灶状或片状细胞浸润及灶状纤维化小动脉壁增厚 5 和 N 治疗后在第和第周时对肾病变的作用并不显著但第周时与组相比肾小球肥大及系膜细胞和基质增生情况略轻未出现肾小球硬化间质纤维化及小动脉壁增厚第周时两治疗组中肾小球系膜细胞和基质增生较组明显减轻多为中度系膜细胞和基质增生肾间质炎细胞浸润和间质纤维化明显减轻偶见小动脉壁增厚图进一步应用计算机图像定量分析方法对各组动物的肾小球面积进行测量发现组的肾小球面积在第周时增大至组的倍并维持其增大状态至本实验结束的第周为同期组的倍 5 和 N 治疗后均未发现能够改善肾小球肥大情况观察期间分别为同期组的 A 倍和 A 倍与组相比均各组大鼠肾组织 5 表达的变化在各时间点组的 3 仅在肾小球基底膜系膜区及肾小管基底膜轻微表达在肾间质偶见散在表达与组相比组肾小球中 3 弥漫表达系膜区显著增多肾间质中 3 表达灶状增多与组相比在第周时 5 组和 N 组的 3 表达明显降低第周时仍较显著均图各时间点组的仅在肾小球基底膜及部分肾小管基底膜轻微表达在肾间质偶见散在表达第周时可见组的在肾小球和肾间质中的表达已有增加但在第周更为显著此时与组相比 5 组和 N 组的在肾小球和肾间质中表达明显减少图像分析结果显示两治疗组均明显抑制在肾脏中的高表达与组相比第第均图

$宋锦叶等8黄芪当归合剂对 BE >肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用 9;; = 0a\!$ $图各组大鼠第 9A周时的肾组织病理学变化W=J染色 na W - -9 A] ^W=J na = 0a\!$

4 宋锦叶等8黄芪当归合剂对 BE >肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用 9;; = 0a\! K=x=\ BE > 0 =x=m K P- M= T R \ -] ] R =x= -] ] ] - 图各组大鼠第 9A周时的肾组织病理学变化W=J染色 na W - -9 A] ^W=J na = 0a\! K=x=\ BE > 0 =x=m K P - M= T R 0 TQ N TQ] \ R =x= TQ ] 0 ] 图造模后第 9A周时各组大鼠肾组织 TQ表达免疫组化 na N TQ -9 A] ^ 00 0 na

$周起肌酐和尿素显著增高并持续高水平达第 9A周自第 C周起其尿蛋白排量随时间延长呈进行性增加同时模型制备后第 A周起残余肾的肾小球平均面积明显增大第 M周时出现较明显的肾小球系膜细胞和基质增生系膜区增宽至第 9A周时多数肾小球呈中到重度系膜细胞及基质增生肾小球出现局灶节段性硬化并有球囊黏连现象同时可见 \ BE > 0 =x=m K P - M= N @ Y T!$

5 北 A 京大学学报医学版 U HP<Q=VHTWXR QYPQR Z<J R N[G=VNGJ!R Q!J8Z C 98Q A8= A ; 肾小管上皮细胞变性管腔扩张肾间质可见灶状讨论或片状单核淋巴细胞浸润及间质纤维化上述动态在!<T的发生和持续进展中肾小球内高滤变化过程符合以往文献报道的此类模型特征过高灌注造成的肾小球内高压是其重要因素之一 BE >肾切除后的残余肾是研究这一病生理过程的经典实验动物模型 9 在这一模型中肾的大部分切除促使残余肾出现进行性损伤最后出现节段性肾小球硬化和间质小管纤维化 9Cb9> 与以往文献 >肾切除术后第 A 相似本研究中模型组大鼠自 BE 周起肌酐和尿素显著增高并持续高水平达第 9A周自第 C周起其尿蛋白排量随时间延长呈进行性增加同时模型制备后第 A周起残余肾的肾小球平均面积明显增大第 M周时出现较明显的肾小球系膜细胞和基质增生系膜区增宽至第 9A周时多数肾小球呈中到重度系膜细胞及基质增生肾小球出现局灶节段性硬化并有球囊黏连现象同时可见 \ BE > 0 =x=m K P - M= Y T!k BA - 0 u!k BA -0 =jcbm 图各组大鼠肾组织 TQ表达的阳性面积 W TQ ^ -M 9 A] ^ 8 = 0a\! K=x=\ BE > 0 =x= R 0! N! ] 0 \ ] =x= 图 -造模后第 9A周时各组大鼠肾组织! 表达免疫组化 na -N! ^ -9A] ^ 00 0 na 88本课题组以往的研究表明 =x=具有明确的肾质的炎症细胞浸润减少促纤维化因子 NYT 的表保护作用在嘌呤霉素所致肾病综合征肾小球硬化达减轻肾小管上皮细胞转分化 9 在单侧输尿管 W=Q大鼠模型中=x=能够减少肾小球和肾间梗阻所致的肾间质纤维化模型中也曾观察到类似的

6 宋锦叶等黄芪当归合剂对 - 肾切除大鼠肾组织损伤的治疗作用结果然而 N 对于以高灌注高滤过启动肾小球硬化为特征的进展过程是否具有治疗作用尚缺乏实验证据 ; 表各组大鼠不同时间点的尿蛋白量的变化 -? - K K 5 N K N N 55 ; 5 K - 本研究动态观察了 N 治疗残余肾大鼠肾损伤和肾病理变化的特点发现 N 治疗后第周起可使尿蛋白持续下降第周时开始明显减轻系膜细胞增生和系膜基质积聚及肾小球硬化而且肾间质纤维化病变明显减轻同期肾小球内 3 和的表达也同样减少提示 N 在残余肾大鼠模型中的确实具有肾保护作用尤其是其减少尿蛋白的作用在病变早期就开始并可持续存在随着损伤时间的延长 N 还可减少 5 的沉积进而减轻肾小球硬化和肾间质纤维化但是本研究中未能观察到 N 改善肾功能也未能改善肾间质的炎症细胞浸润程度与以往在其他肾病实验模型中所观察到的现象不完全一致 > 此外 N 对肾间质炎症的抑制作用不明显因而仍有可能因炎症性细胞因子的持续作用导致肾小管上皮细胞转分化或肌成纤维细胞活化 > 进而使得肾间质纤维化未能完全阻断肾功能未能有所恢复造成这一结果的原因尚不完全清楚但可能与 N 的剂量较小有关本研究沿用了本课题组以往的 N 剂量在一系列动物实验中证实该剂量在肾病综合征和梗阻性肾病模型中能够减轻肾纤维化 > 而实验所用的 - 肾切除动物模型与以往动物模型不同其病变较重在目前的剂量条件下 N 的肾保护作用可能有限此外本研究观察时间仅为周延长研究时间是否能观察到 N 改善肾功能需进一步验证本研究发现 N 减少尿蛋白的作用出现早于其减轻 5 沉积的作用这一现象提示 N 对上述不同靶点的作用起效时间及机制可能有所不同以往对残余肾模型肾小球高灌注高滤过的病变发生机制的研究发现在 - 肾切除后 A 周即可发现高血压且蛋白尿的发生与高血压密切相关结合本课题组以往研究发现 N 具有改善内皮源性一氧化氮合酶活性进而增加扩血管物质一氧化氮作用的结果提示尽管 N 并不直接阻断系统的活化但其有可能通过拮抗系统的缩血管作用而减轻肾小球局部的高灌注高滤过进而减少蛋白尿改善残余肾的病生理过程此外 N 是否还具有改善肾小球滤过膜通透性的其他作用机制也值得进一步研究由于大量研究证实蛋白尿是一个导致肾病变进展的独立危险因素其持续存在既可以直接导致肾小球硬化也可以通过导致肾小管上皮和肾间质成纤维细胞转分化而分泌 5 增加因此在残余肾后期的 5 积聚和肾小球硬化 - 肾间质纤维化病变中 N 早期即开始的降低尿蛋白作用在后续的减轻肾脏纤维化病变中发挥了重要的启动和维持作用说明 N 在进展过程中同样能够发挥其肾保护作用 - 5 N 55 ; 5 K > 图各组大鼠肾组织表达变化 9?

7 北京大学学报医学版 ; 曾有国外学者观察到大剂量 5 每天每千克体重长期应用 A 周可以使残余肾大鼠模型的收缩期高血压降低尿蛋白排出减少并可使肾小球硬化和间质纤维化病变减轻小剂量 5 每天每千克体重也可减少 5 成分在肾小球和肾间质的积聚本研究应用小剂量 5 每天每千克体重治疗作为有效治疗的阳性对照结果发现其自造模后第周起具有持续的降尿蛋白作用在病变后期这一作用持续存在且较强而在第 A 周时可抑制 3 和的表达并可使肾小球硬化和间质纤维化病变减轻这些结果均与文献报告的结果相似然而本研究未能观察到 5 改善肾功能的作用这可能与所用药物剂量偏小有关基于上述研究结果提示在残余肾大鼠模型中 N 可以通过早期开始并持续降低蛋白尿减少 5 成分沉积而减轻肾小球硬化和肾间质纤维化病变尽管上述作用未能完全改善肾功能但无疑将有益于延缓慢性肾病的进展参考文献 9 4 > 4 35; 03 > == 54 4 > 99 8? 5 > =? 5 > 王荣李晓玫中药治疗慢性肾脏疾病及其抗纤维化作用的研究进展中国中西医结合肾病杂志 > 朱辟疆肾脏纤维化与抗纤维化治疗研究中国中西医结合肾病杂志 > 吴金玉康海艳覃柳菊中医药抗肾纤维化的研究进展辽宁中医杂志 > 王海燕李惊子潘缉圣等中药黄芪当归合剂对肾病综合征肾损伤的保护作用及对代谢紊乱的影响北京大学学报医学版 > > 孟立强屈磊李晓玫黄芪当归合剂对肾间质纤维化的多靶点抑制作用中国药理学通报 > 田辉樊柏林刘瑶等 9 级大鼠血液学及血生化指标正常值范围探讨实验动物科学 > =? 9 >? > = 5 ; 9 ;? 4 > 沈延春杨晓陈琼霞 - 肾切除大鼠肾脏病理学动态变化上海实验动物科学 > 赵建荣屈磊李晓玫黄芪当归合剂对梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化的防治作用北京大学学报医学版 > 3 4 > 8 = > 08 ; 9 > 8< B ; 5? 9 > > 9 3= ;8 > ; 8 3 > 阳晓魏毅叶任高等依那普利对大鼠残肾细胞外基质蓄积的作用观察中国危重病急救医学 > 收稿本文编辑王蕾

中草药

中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (