2014年第4期

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1 262 中华肾脏病杂志 214 年 4 月第 3 卷第 4 期 Chin J Nephrol, April 214, Vol. 3, No.4 临床研究 2 型糖尿病患者尿上清 microrna 29 水平与尿白蛋白水平的相关性钟美容彭晖赵文波王成张俊刘迅李远清 Sujay Dutta audel 王倩倩娄探奇摘要目的探讨 2 型糖尿病患者尿上清的 microrna 29(miR 29) 水平作为糖尿病肾病的生物标志物的可能性方法收集 61 例 2 型糖尿病患者的清晨首次中段尿, 根据尿白蛋白水平分为糖尿病无蛋白尿组 [n=25,(58.88±11.75) 岁 ] 和糖尿病有蛋白尿组 [n=36,(62.19± 13.11) 岁 ] 用实时荧光定量 CR 法检测尿上清 mir 29a mir 29b 和 mir 29c 的水平等量的外源性人工合成的 cel mir 39 加入等体积的尿上清中用于校正 mir 29 的水平同时收集尿白蛋白排泄率血肌酐尿素氮糖化血红蛋白 (HbA1c) 血脂等其他生化指标而眼底检查的结果则作为评估糖尿病小血管病变的指标结果 2 型糖尿病有无蛋白尿两组之间 HbA1c 水平及糖尿病病程差异无统计学意义, 而 2 型糖尿病有蛋白尿组估算肾小球滤过率 (egrf) 水平显著低于无蛋白尿组 (=.1),2 型糖尿病有蛋白尿组尿上清 mir 29a mir 29b 和 mir 29c 水平高于无蛋白尿组 (= ) 2 型糖尿病尿白蛋白排泄率与尿上清 mir 29a 及 mir 29b 水平相关 (r=.284,=.39;r=.275,=.46), 尿上清 mir 29b 水平与尿素氮水平相关 (r=.277,=.31), 而 mir 29 水平与上述其他各项临床指标无相关结论 2 型糖尿病患者尿上清 mir 29a 及 mir 29b 水平与尿白蛋白水平相关尿上清 mir 29 作为 2 型糖尿病患者糖尿病肾病的生物标志物的潜能有待进一步的探索和评估关键词微 RNAs; 糖尿病肾病 ; 生物学标记 ; microrna 29 Urinary microrna 29 correlates with urinary albumin in type 2 diabetes mellitus Zhong Meirong, eng Hui, Zhao Wenbo, Wang Cheng, Zhang Jun, Liu Xun, Li Yuanqing, Sujay Dutta audel, Wang Qianqian, LOU Tanqi. Department of Nephrology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat sen Univeity, Guangzhou 5163, China Corresponding author: eng Hui, elizapeng1@gmail.com Abstract Objective To investigate the possibility of urinary microrna 29 (mir 29) as biomarker for diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes. Methods Sixty one patients with type 2 diabetes were divided into 2 groups: diabetes with normoalbuminuria[n=25, (58.88±11.75) yea old] and diabetes with albuminuria[n=36, (62.19 ± 13.11) yea old]. There were no significant differences in age and gender between groups. The contents of mir 29a, mir 29b and mir 29c in urine supernatant were determined by real time quantitative CR, and a synthetic cel mir 39 was added to the urine as a spike in control before mirnas extraction. The laboratory paramete including urinary albumin excretion, serum creatinine, BUN, glycosylated hemoglobin, and blood lipids were collected, while retinopathy serves as non invasive method to assess vascular fibrosis. Results There was no significant difference in glycosylated hemoglobin levels and duration of diabetes between two DOI:1.376/cma.j.issn 基金项目 : 国家自然科学基金 (3848,377111, ); 中央高校基本科研业务费专项资金 (1ykpy3); 十二五国家科技支撑计划 (211BAI1B) 作者单位 :5163 广州, 中山大学附属第三医院肾内科通信作者 : 彭晖, elizapeng1@gmail.com

2 中华肾脏病杂志 214 年 4 月第 3 卷第 4 期 Chin J Nephrol, April 214, Vol. 3, No groups, while the diabetes with albuminuria group had lower estimated glomerular filtration rate (egfr) (=.1), had higher level of mir 29a, mir 29b and mir 29c in urine (=.29,.32,.4) compared with diabetes normoalbuminuria group. Urinary albumin excretion rate significantly correlated with urinary mir 29a level (r=.284, =.39) and mir 29b level (r=.275, =.46), urinary mir 29b significantly correlated with BUN(r=.277, =.31)in patients with type 2 diabetes. However, no correlation was found between mir 29a, mir 29b, mir 29c and other clinical paramete. Conclusion Urinary mir 29a and mir 29b correlates with urinary albumin in patients with type 2 diabetes, and it needs further exploration and evaluation for urinary mir 29 to serve as potential biomarker for diabetic nephropathy in type 2 diabetes. Key words MicroRNAs; Diabetic nephropathies; Biological marke; MicroRNA 29 MicroRNA(miR) 是一组由 19~25 个核苷酸组成的功能性非编码 RNA, 主要通过其种子序列 (5 端的第 2 个至第 8 个核苷酸 ) 识别靶基因而参 [1] 与了近 1/3 基因表达的调控 mir 29 包括 mir 29a mir 29b 和 mir 29c, 它们具有共同的种子序列, 其识别的最主要的靶基因是细胞外基质和迁移蛋白, 可直接抑制 2 种胶原蛋白的表达, 具有强大的抗纤维化的潜能 [2] mir 29 的下调在包括糖尿病肾病在内的肾脏纤维化疾病中发挥重要作用 [3] 细胞外的 mir 稳定地存在于血液尿液以及唾液等其他体液中, 并且其水平的变化与某种特 [4] 定的病理生理状态相关越来越多的研究表明 mir 具有作为非侵袭性的疾病标志物的潜能, 因此, 我们探讨 2 型糖尿病患者尿上清的 mir 29 作为糖尿病肾病的生物标志物的可能性材料与方法 1. 研究对象 : 排除了泌尿道感染和恶性肿瘤后, 收集 212 年至 213 年间本院内分泌科收住院的 61 例 2 型糖尿病患者, 根据尿白蛋白肌酐比的水平, 将这 61 例 2 型糖尿病患者分为糖尿病有蛋白尿组 ( 尿白蛋白肌酐比 3 mg/g,n=36) 和糖尿病无蛋白尿组 ( 尿白蛋白肌酐比 <3 mg/g,n= 25) 收集患者清晨首次中段尿 1 ml, 于室温下 3 g 离心 3 min 后, 再于 4,13 g 离心 5 min 取尿上清液储存于 -8 冰箱中用于尿 mir 水平的分析 2. 试剂和仪器 : 尿 mir 纯化试剂盒 (Urine MicroRNA urification Kit) 购于加拿大 Norgen 公司, 合成的 cel mir 39 购于美国 Qiagen 公司,miR 29a mir 29b mir 29c 及 cel mir 39 的特异性 RT 及 CR 引物 (Taqman microrna Assay) mir 逆转录试剂盒 (MicroRNA Revee Transcription Kit) CR 试剂盒 (Univeal CR Master Mix) 及 75 实时荧光定量 CR 仪均购于美国 ABI 公司 3. 尿 mir 提取和检测 : 按照尿 mir 纯化试剂盒的说明书, 每个样本使用 1 ml 尿液用于 mir 的纯化, 每 1 ml 尿液在开始纯化步骤之前加入 1 fmol 的 cel mir 39 用于校正尿 mir 29 的水平根据反转录试剂盒的说明书,15 μl 的反应体系, 反应条件为 16 3 min,42 3 min,85 5 min 然后按照 CR 试剂盒配 2 μl 反应体系 5 2 min 稳定反应体系,95 预变性 1 min, 反应 4 个循环, 反应条件为 s 及 6 1 min 采用 2 -ΔCT 法进行结果分析,ΔCT= 目的基因的 CT 值 -cel mir 39 的 CT 值 4. 实验室检查和眼底镜检查 : 血清果糖胺和糖化血红蛋白分别使用全自动分析仪 Olympus AU64 以及 Bio Rad D 1 检测血肌酐尿素氮胱抑素 β2 微球蛋白总胆固醇三酰甘油高密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇以及尿白蛋白和肌酐水平使用 Hitachi 718 Analyzer 检测 CKD EI 公式用于计算 2 型糖尿病患者估算肾小球滤过率 (egfr), 每位入选的患者均行眼底镜检查用以筛查糖尿病视网膜病变 5. 统计学分析 :SSS 13. 用于数据的统计分析正态分布的连续型变量用 x ± s 表示, 非正态分布的连续型变量用 M(1/4,3/4) 表示正态分布且方差齐的计量资料用 t 检验, 正态分布而方差不齐的计量资料用校正的 t 检验, 计数资料用卡方检验, 相关分析使用 Spearman 秩相关分析非正态分布的计量资料多组间比较用 Kruskal Wallis 检验, 进一步两组间比较用 Mann Whitney U 检验, 此时检验水准 α=.5/ν, 余检验水准为 α=.5

3 264 中华肾脏病杂志 214 年 4 月第 3 卷第 4 期 Chin J Nephrol, April 214, Vol. 3, No.4 结果 <.1 =.3 1. 一般情况 :61 例入选患者根据尿白蛋白肌酐比值分为无蛋白尿组 25 例和有蛋白尿组 36 例, 两组的一般情况见表 1 两组之间性别年龄糖尿病病程以及糖化血红蛋白总胆固醇高密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇水平差异均无统计学意义糖尿病有蛋白尿组的尿素氮肌酐胱抑素 β2 微球蛋白的水平均高于糖尿病无蛋白尿组 (<.5), 而 egfr 显著低于糖尿病无蛋白尿组 (<.1) 虽然糖尿病有蛋白尿组视网膜病变的发生率 (41.67%) 高于糖尿病无蛋白尿组 (2.%), 但差异无统计学意义 (=.76) 2. 尿上清 mir 29 水平 : 采用 Kruskal Wallis 检验比较 mir 29a mir 29b mir 29c 的水平, 发现 2 型糖尿病患者尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 的水平差异有统计学意义 (<.1) 采用 Mann Whitney U 检验进一步比较 mir 29a mir 29b mir 29c 的水平, 发现 mir 29a 及 mir 29c 水平显著高于 mir 29b 水平 ( =.3,α=.17), 见图 1 糖尿病有蛋白尿组尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 的水平均高于糖尿病无蛋白尿组 (= ,α=.5), 见图 2 3. 尿 mir 29 与尿蛋白及其他临床指标的相关分析 :Spearman 秩相关分析发现, 尿白蛋白排项目性别 ( 男 / 女, 例 ) 年龄 ( 岁 ) 糖尿病病程 ( 年 ) 果糖胺 (μmol/l) 糖化血红蛋白 (%) 视网膜病变 [ 有 / 无, 例 (%)] 尿素氮 (mmol/l) 肌酐 (μmol/l) egrr 表 1 胱抑素 (mg/l) β2 微球蛋白 (mg/l) 尿白蛋白排泄率总胆固醇 (mmol/l) 三酰甘油 (mmol/l) 2 型糖尿病患者有无蛋白尿组各项临床指标的比较高密度脂蛋白胆固醇 (mmol/l) 低密度脂蛋白胆固醇 (mmol/l) 无蛋白尿组 (n=25) 16/ ± ± ± ±3.3 5/2(2.) 5.92(4.49,6.49) 64.3(55.6,8.15) 14.(64.5,184.28) 95.8± ±.22 2.± (5.8,12.74) 4.32± ±.8 1.5± ±.85 有蛋白尿组 (n=36) 17/ ± ± ± ± /21(41.67) 6.93(5.49,12.31) 6.21± ± ± (29.9,136.13) 4.8± ± ± ±1.7 值注 :egfr: 估算肾小球滤过率, 单位为 ml min -1 (1.73 m 2 ) -1 ; 数据形式除已注明外, 其余为 x ± s 或 M(1/4,3/4) mir 29a mir 29b mir 29c 注 :Mann Whitney U 检验, 检验水准 α=.17;n=61; 纵坐标数值示 mir 29a mir 29b mir 29c 水平与 mir 29c 的中位数的比值 ; 因数据为非正态分布, 坐标刻度间距采用等对数间距图 1 mir 29/cel mir 39 2 型糖尿病患者尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 水平的 mir 29/cel mir 比较 ( 实时荧光定量 CR) =.29 =.32 =.4 mir 29a mir 29b mir 29c 泄率与尿上清 mir 29a 及 mir 29b 水平呈正相关 (r s=.284,=.39;r s=.275, =.46), 而 mir 29c 与尿白蛋白排泄率无相关关系 (r s=.265,=.56), 见图 3 mir 29 与各项临床指标的相关分析发现, 尿上清 mir 29b 水平与尿素氮呈正相关 (r s=.277,=.31), 而 mir 29a 以及 mir 29c 水平与尿素氮则无相关关系 (r s=.176,=.176;r s=.233,=.71), 见图 4 另外, 尿上清 mir 29 水平与肌酐胱抑素 β2 微球蛋白以及估算肾小球滤过率无相关关系, 见表 2 讨论无蛋白尿组有蛋白尿组注 :Mann Whitney U 检验, 检验水准 α=.5;n=61; 纵坐标数值示 mir 29a mir 29b mir 29c 水平分别与糖尿病无蛋白尿组相应 mir 的中位数的比值 ; 因数据为非正态分布, 坐标刻度间距采用等对数间距图 2 2 型糖尿病有无蛋白尿组尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 水平的比较 ( 实时荧光定量 CR) 本研究中, 伴有蛋白尿的 2 型糖尿病患者其视网膜病变的发生率约为无蛋白

4 中华肾脏病杂志 214 年 4 月第 3 卷第 4 期 Chin J Nephrol, April 214, Vol. 3, No 表 2 2 型糖尿病患者尿上清 mir 29 与其他临床指标的相关分析 (Spearman 秩相关分析 ) 临床指标 mir 29a mir 29b 肌酐 β2 微球蛋白胱抑素估算肾小球滤过率 mir 29c 尿白蛋白排泄率尿白蛋白排泄率尿白蛋白排泄率尿上清 mir 29a 尿上清 mir 29b 尿上清 mir 29c 注 : 横坐标数值示 mir 29a mir 29b mir 29c 水平与相应 mir 中位数的比值 ; 因数据为非正态分布, 坐标刻度间距采用等对数间距 ;n=61 图 3 2 型糖尿病患者尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 水平与尿白蛋白排泄率的相关分析 (Spearman 秩相关分析 ) 尿上清 mir 29a 尿上清 mir 29b 尿上清 mir 29c 注 : 横坐标数值示 mir 29a mir 29b mir 29c 水平与相应 mir 中位数的比值 ; 因数据为非正态分布, 坐标刻度间距采用等对数间距 ;n=61 图 4 尿素氮 (mmol/l) 尿素氮 (mmol/l) 尿素氮 (mmol/l) 型糖尿病患者尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 水平与血清尿素氮的相关分析 (Spearman 秩相关分析 ) 尿糖尿病患者的 2 倍有 Meta 分析认为, 在 2 型糖尿病患者中, 糖尿病视网膜病变是诊断和筛查糖 [5] 尿病肾病的有利依据糖尿病肾病或糖尿病视网膜的出现都可以增加彼此的发病风险, 二者的伴随出现和相互影响可能是由于这两种糖尿病微 [6] 血管病变存在共同的发病机制所致但由于样本量有限, 本研究中糖尿病有无蛋白尿两组间视网膜病变的差异未能得出有统计学意义的结果本研究对尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 的水平进行比较发现尿上清 mir 29a 及 mir 29c 的水平高于 mir 29b, 在肾小管上皮细胞 (NRK52E) 以及大鼠肾组织中也发现 mir 29a 及 mir 29c 的水平高于 mir 29b [3],miR 29 家族成员不同的稳定性和转录后的处理过程不同可能导致其细胞内外的丰度不同 [2] 既往的研究发现在链脲素诱导的早期以及晚期糖尿病肾病模型中, 肾组织 mir 29a 及 mir 29c 表达均下调 [3],IgA 肾病的患者及肾间质纤维化的大鼠肾组织中 mir 29c 的表达亦有下调, 且 mir 29 [3,7] 的下调与肾脏纤维化相关另外,IgA 肾病患者的尿沉渣 mir 29b 和 mir 29c 的表达下调, 且 mir 29b 和 mir 29c 的水平与尿蛋白水平呈负相

5 266 中华肾脏病杂志 214 年 4 月第 3 卷第 4 期 Chin J Nephrol, April 214, Vol. 3, No.4 [8] 关而与 egfr 呈正相关综合以上研究表明 mir 29 的下调可能介导了糖尿病肾病的发病而另一项研究则发现在 db/db 小鼠的肾小球中 mir 29c 表达升高, 且体内抑制 mir 29c 的表达则可以 [9] 延缓糖尿病肾病的进展出现以上差别的原因可能是所使用的糖尿病肾病的动物模型不同, 这也提示 mir 29 在糖尿病肾病中的作用复杂, 有待进一步研究本研究中我们发现 mir 29a mir 29b mir 29c 在糖尿病伴蛋白尿组均高于糖尿病无蛋白尿组, 且 mir 29a 及 mir 29b 的水平与尿蛋白水平呈正相关这与最近一项研究结果不同, 该研究收集包括糖尿病肾病在内的慢性肾脏病 (CKD) 患者尿液, 分离尿外来体 (exosome) 并检测其 mir 29 水平, 发现 CKD 患者尿外来体中 mir 29a mir 29b mir 29c 水平下降, 且 mir 29c 与 egfr [1] 呈正相关, 而与肾间质纤维化程度呈负相关但该项研究存在一个重要缺陷, 即该研究以 RNU6B 作为检测外来体 mir 29 水平的内参, 但并未证实 RNU6B 在不同尿标本之间是稳定表达的事实上, 有研究证实膀胱癌和尿路感染均可以影响尿 RNU6B 的水平, 且在该项研究中有 8.5% 的患者尿 RNU6B 检测不出, 因此认为 RNU6B 不适 [11] 于尿 mir 水平的校正由于尿 mir 水平随着疾病状态的不同而变化, 较理想的校正方法是在 mir 提取之前在等体积的样本中加入等量的合成的非人源的成熟 mir [4] 本研究引入合成的线虫 mir, 即 cel mir 39 作为校正, 因此, 不同的校正方法和尿 mir 的来源不同 ( 尿上清与尿外来体 ) 可能导致了这两项研究的结果的差异另外, 由于不同的糖尿病肾病动物模型中肾组织 mir 29 的表达变化存在争议 [3,9], 本研究未检测肾组织内 mir 29 的表达, 因此无法比较伴有蛋白尿的糖尿病患者肾组织 mir 29 的变化趋势与尿上清 mir 29 的变化是否一致本研究的另一个局限是未能获得 2 型糖尿病患者肾组织活检的病理结果, 故未能充分评估尿 mir 29 在预测糖尿病肾组织病理变化严重程度中的作用有待进一步的研究以评估尿 mir 29 作为糖尿病肾病的标志物的潜能此外, 本研究发现尿上清 mir 29a mir 29b 水平与尿白蛋白水平呈正相关, 而与 egfr 无相关, 可能由本研究的样本量有限导致, 有待扩大样本量进一步验证综上所述, 本研究发现 2 型糖尿病伴蛋白尿的患者尿上清 mir 29a mir 29b mir 29c 水平高于无蛋白尿患者,2 型糖尿病患者尿上清 mir 29a 及 mir 29b 的水平与尿白蛋白水平相关, 尿上清 mir 29b 水平与尿素氮相关尿 mir 29 作为 2 型糖尿病患者糖尿病肾病的生物标志物的潜能有待进一步的探索和评估参考文献 [1] Lewis B, Burge CB, Bartel D. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microrna targets[j]. Cell, 25, 12: [2] Kriegel AJ, Liu Y, Fang Y, et al. The mir 29 family: genomics, cell biology, and relevance to renal and cardiovascular injury[j]. hysiol Genomics, 212, 44: [3] Wang B, Kome R, Carew R, et al. Suppression of microrna 29 expression by TGF beta1 promotes collagen expression and renal fibrosis[j]. J Am Soc Nephrol, 212, 23: [4] Zen K, Zhang CY. Circulating micrornas: a novel class of biomarke to diagnose and monitor human cance[j]. Med Res Rev, 212, 32: [5] He F, Xia X, Wu XF, et al. Diabetic retinopathy in predicting diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes and renal disease: a meta analysis[j]. Diabetologia, 213, 56: [6] Kramer CK, Retnakaran R. Concordance of retinopathy and nephropathy over time in Type 1 diabetes: an analysis of data from the Diabetes Control and Complications Trial[J]. Diabet Med, 213, 56: [7] Fang Y, Yu X, Liu Y, et al. mir 29c is downregulated in renal intetitial fibrosis in humans and rats and restored by HIF alpha activation[j]. Am J hysiol Renal hysiol, 213, 34: [8] Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Urinary mir 21, mir 29, and mir 93: novel biomarke of fibrosis[j]. Am J Nephrol, 212, 36: [9] Long J, Wang Y, Wang W, et al. MicroRNA 29c is a signature microrna under high glucose conditions that targets Sprouty homolog 1, and its in vivo knockdown prevents progression of diabetic nephropathy[j]. J Biol Chem, 211, 286: [1] Lv LL, Cao YH, Ni HF, et al. microrna 29c in urinary exosome/microvesicle as biomarker of renal fibrosis[j]. Am J hysiol Renal hysiol, 213, 36: [11] Hanke M, Hoefig K, Merz H, et al. A robust methodology to study urine microrna as tumor marker: microrna 126 and microrna 182 are related to urinary bladder cancer[j]. Urol Oncol, 21, 28: ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 杨克魁 )

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