黄巍, 等 Alport 综合征患者肾小球基底膜超微结构改变与层粘连蛋白的异常分布 631 厚变薄和比较有特征性的撕裂分层改变 [2] GBM 主要由 4 大成分组成 :Ⅳ 型胶原层粘连蛋白 (lami nin) 巢蛋白 (nidogen/entactin) 以及硫酸类肝素蛋白多糖 (hepar

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个范
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1 630 Alport 综合征患者肾小球基底膜超微结构改变与层粘连蛋白的异常分布黄巍, 王晨, 郑欣, 鄂洁, 王素霞, 刘刚 ( 北京大学第一医院肾内科, 北京大学肾脏病研究所, 北京 ) 论著 [ 摘要 ] 目的 : 观测 Alport 综合征患者肾小球基底膜 (GBM) 超微结构改变与 GBM 上层粘连蛋白 α1(lamininα1) 和 α5(lamininα5) 分布的关系方法 :1998 年 1 月至 2008 年 7 月在北京大学第一医院经肾活检病理确诊为 Alport 综合征的患者 20 例, 另外选择 6 例肾肿瘤切除术后患者的正常肾组织作为对照在透射电镜下测量 GBM 厚度以及增厚和撕裂的范围对肾组织石蜡切片进行 lamininα1 lamininα5 免疫组织化学染色, 对其在 GBM 的分布进行半定量评分 :0 分为 0%,1 分为 25%,2 分为 25% ~50%,3 分为 50% ~75%,4 分为 75% 结果: 透射电镜下观察 Alport 综合征患者的 GBM 均出现不同程度的增厚和撕裂分层免疫组织化学显示, 正常对照组的 lamininα1 主要在肾小球系膜区,GBM 无显色 ;lamininα5 则沿着 GBM 均匀显色 Alport 患者的 lamininα1 在肾小球系膜区的分布低于对照组, 主要在 GBM 上显色 ;lamininα5 在 GBM 上的分布低于对照组 ;GBM 上 lamininα1 与 lamininα5 半定量评分呈高度负相关 (r=-0.83,p<0 001) GBM 增厚及撕裂范围与 lamininα1 的半定量评分均呈正相关 ( 分别为 r=0 76,P<0 001;r=0 56,P=0 015), 与 lamininα5 的半定量评分均呈负相关 ( 分别为 r=-0 59,P= 0 010;r=-0 53,P=0 025) 结论:Alport 综合征患者 GBM 中异常分布的 lamininα1 和 lamininα5 与 GBM 增厚和撕裂的超微病理改变有关 [ 关键词 ] 肾炎, 遗传性 ; 肾小球基底膜 ; 层粘连蛋白 [ 中图分类号 ]R692 3 [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] X(2009) doi: /j.isn X Correlationbetweenultrastructuralchangesofglomerularbasementmembraneand abnormaldistributionoflamininsinpatientswithalport ssyndrome HUANGWei,WANGChen,ZHENGXin,AOJie,WANGSu xia,liugang (DepartmentofNephrology,PekingUniversityInstituteofNephrology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China) ABSTRACT Objective:Toanalysetherelationshipofultrastructuralchangesofglomerularbasementmem brane(gbm)andglomerulardistributionsoflamininα1andlamininα5inpatientswithalport ssyn drome.methods:twentypatientswithalport ssyndromewererecruited.thethicknesofgbm andthe extensionofthickeningandsplitinggbm weremeasuredundertransmisionelectronmicroscope.normal renaltisuesfrom6nephrectomiesofrenalcarcinomaweretakenascontrols.parafinembeddedsectionsof formalin fixedrenaltisuewereprocesedforimmunohistochemistrywithmonoclonalantibodiestolaminin α1andlamininα5.theirdistributionsingbmwereevaluatedbyasemiquantitativescaleofpositiveexten sion:absent,0; 25%,1;25% -50%,2;50% -75%,3; 75%,4.Results:Therewereavariety ofdegreesofthickeningorsplitinggbm inpatientswithalport ssyndrome.lamininα1waspositivein glomerularmesangialareaandabsolutelynegativeingbm andlamininα5wasevenlypositiveingbm in normaltisue.inalport ssyndrome,lamininα1wasmuchweakeringlomerularmesangialarea,but stronglypositiveingbm;lamininα5ingbmwasprominentlyreduced.therewasahighnegativecorela tionofsemiquantitativescoresbetweenlamininα1andlamininα5(r=-0 83,P<0 001).Theextension ofthickeningorsplitinggbmwaspositivelycorelatedwithscoresoflamininα1ingbm(r=0 76,P< 0 001;r=0 56,P=0 015),andwasnegativelycorelatedwithscoresoflamininα5inGBM (r= -0 59,P=0 010;r=-0 53,P=0 025).Conclusion:Abnormaldistributionoflamininα1andlami ninα5ingbm iscorelatedwithgbm thickeningandsplitinginhumanalport ssyndrome. KEYWORDS Nephritis,hereditary;Glomerularbasementmembrane;Laminin Alport 综合征是由于 Ⅳ 型胶原 α3 或 α5 链基因突变导致相应编码产物表达缺失, 从而不能构建正常的 Ⅳ 型胶原网状结构所致的一种遗传性肾小球基底膜 (GBM) 疾病 [1] 电镜下可以观察到 GBM 增基金项目 : 985 工程项目 ( ) 基金 Supportedbythe985ProjectFoundationofPekingUniversity( ) Corespondingauthor se mail,liugang2003@medmail.com.cn

2 黄巍, 等 Alport 综合征患者肾小球基底膜超微结构改变与层粘连蛋白的异常分布 631 厚变薄和比较有特征性的撕裂分层改变 [2] GBM 主要由 4 大成分组成 :Ⅳ 型胶原层粘连蛋白 (lami nin) 巢蛋白 (nidogen/entactin) 以及硫酸类肝素蛋白多糖 (heparansulfateproteoglycans,hspgs) [3], 其中 Ⅳ 型胶原和 laminin 形成各自的网络结构, 构成 GBM 的主要支架, 而 nidogen 和 HSPGs 连接它们使之稳定 [4] Alport 综合征患者虽然都存在近乎一致的 GBM 的 Ⅳ 型胶原缺陷, 但不同患者之间或同一个患者 GBM 不同部位的超微结构改变并不一致, 说明很可能仅 Ⅳ 型胶原 α 链的缺失还不足以造成 GBM 增厚和分层撕裂的特征性形态学改变那么构成 GBM 另一个网络结构成分的 laminin 在 Alport 综合征 GBM 超微结构改变中是否起了重要作用呢? 这一点目前尚未见报道 laminin 是 GBM 中含量最丰富的非胶原蛋白成分 [4], 是由 α β 和 γ 链组成的三聚体至今发现 5 种 α 链 3 种 β 链和 3 种 γ 链, 通过不同的排列组合成为 15 种 (laminin 1 至 12, 14, 15 和 5B) 在肾小球的发育成熟过程中,laminin 的种类也在不断变化 [5] 胚胎时期 GBM 的主要成分是 laminin 1 (α1β1γ1), 而成熟 GBM 的主要成分逐渐变为 lami nin 11(α5β2γ1) [6] 正常人 lamininα1 主要在肾小球系膜区表达, 在 GBM 上不表达 ; 而 lamininα5 则主要表达在 GBM 上 [7] 目前已初步发现, 在 Alport 综合征中 laminin 的 [8] 表达有改变 Kashtan 等在敲除了 Ⅳ 型胶原 α3 链的患有 Alport 综合征的小鼠模型中发现,lamininα1 分布在 GBM 上, 而正常小鼠没有分布此后 Abra [9-10] hamson 等证实了这一现象, 并发现 lamininα1 和 lamininα5 在该动物模型的 GBM 上的分布均增加, 特别是 GBM 的增厚部位 Kashtan 等仅用免疫荧光的方法检测了 lamininα1 和 lamininα5 在 Al port 综合征患者 GBM 上的分布, 结果未发现与正常人有差别, 与上述动物实验的结果相矛盾目前尚未见到关于 Alport 综合征患者 GBM 增厚或撕裂的超微结构改变与 GBM 中 laminin 分布关系的报道因此, 本实验设计主要基于借助透射电镜观测 Al port 综合征患者 GBM 的超微结构改变, 应用免疫组织化学染色方法检测 lamininα1 lamininα5 沿 GBM 的分布情况, 并着重分析两者的关系 1 资料与方法 1.1 研究对象选取 1998 年 1 月至 2008 年 7 月在北京大学第一医院肾内科经肾活检病理确诊为 Alport 综合征患者的肾组织标本 20 例 ( 每例标本均 10 个肾小球 ) 确诊依据为 :(1) 电镜下观察 GBM 出现增厚或变薄广泛撕裂的典型病理改变 ;(2)Ⅳ 型胶原 α3 α5 链的免疫荧光至少有一项是阴性 [11] 20 例标本中,16 例均为阴性,3 例 α3 链阴性 α5 链弱阳性,1 例 α5 链阴性 α3 链弱阳性同时选择 6 例肾肿瘤切除术患者的正常肾组织作为对照, 其 α3 α5 链免疫荧光沿 GBM 和肾小管基底膜 (tubularbase mentmembrane,tbm) 均呈连续线样强阳性所有组织标本的使用均获得患者的书面知情同意 1.2 方法患者资料分析患者的主要临床资料, 包括受累器官, 家族史以及血尿尿蛋白血肌酐 (Scr) 等检查数据, 进行光镜阅片 (PASM+Mason,Mason, HE 染色 ) 获得病变资料电镜观测 GBM 利用 Ipp 图像分析软件, 在电镜下随机选取 10~20 个毛细血管袢, 在同等倍数下 ( 12000) 照相每张照片在 GBM 上采用直角相交网格法随机取点 50~80 个 [12], 测量 GBM 的厚度, 从正常对照组获取 GBM 的正常厚度值 (x± 1.5s), 患者的 GBM 厚度大于此范围的上限则定义为增厚, 小于下限则定义为变薄, 增厚或撕裂所占比例定义为所在点占所有测量点的百分比 [13] 免疫组织化学染色采用石蜡切片, 二步法一抗为小鼠抗人 lamininα1 lamininα5 的单克隆抗体 ( 稀释度分别为 ,SantaCruz 公司 Milipore 公司 ), 二抗为抗鼠的单克隆抗体 (Vec tor 公司 ) 显色剂为二氨基联苯胺 (DAB, 北京中杉金桥生物技术有限公司 ) 对 lamininα1 lamininα5 在 GBM 的显色分布进行半定量评分 ( 显色的 GBM 占总 GBM 的百分比 ):0 分为 0%,1 分为 25%,2 分为 25% ~50%,3 分为 50% ~75%,4 分为 75% [14], 计算患者的每个肾小球评分, 取平均值 1.3 统计方法采用 SPSS13.0 软件, 正态分布的计量资料以 x±s 表示, 均数比较采用 t 检验或单因素方差分析, 相关性采用 Spearman 相关分析 ; 非正态分布的资料采用非参数检验 P<0 05 表示差异有统计学意义 2 结果 2.1 临床资料 20 例患者中, 男性 10 例女性 10 例, 年龄 (25 2±9 6) 岁 (14~41 岁 ) 患者均有不同程度的血尿和蛋白尿, 尿蛋白 (3 2±2 8)g/24h(0 2~10 2 g/24h), 血 Scr 为 (96 0±40 5)μmol/L(53.4~

3 μmol/L),7 例出现肾病水平蛋白尿 (35%, 尿蛋白 3 5g/24h),2 例肾功能不全 (Scr>133μmol/ L) 尿蛋白量与血 Scr 值呈正相关 (r=0 54,P= 0 021) 14 例患者有家族史患者的基本临床资料见表 1 正常对照组 6 例, 其中男性 4 例, 女性 2 例, 年龄 (54 2±15 6) 岁 (36~73 岁 ) No.of patients Gender Age 表 1 20 例患者的临床资料 Table1 ClinicalcharacteristicsoftwentypatientswithAlport ssyndrome Courseof disease Family history Disease ofeyes Disease ofears U pro (g/24h) Haematuria Scr (μmol/l) 1 M /HP M /HP F /HP F /HP M /HP F /HP F /HP M /HP M /HP F /HP F /HP F /HP M /HP M /HP F /HP M /HP F /HP M /HP M /HP F /HP 99.0 U pro,urinaryprotein;scr,serumcreatinine;m,male;f,female;hp,highpowerobjective. 2.2 肾组织病理检查光镜下,15 例患者肾组织表现为轻度系膜增生,5 例患者表现为局灶节段性肾小球硬化 19/20 例肾间质有泡沫细胞电镜检查发现 :(1) 患者 GBM 均有撕裂分层 ( 图 1 表 2), 其中 GBM 撕裂分层的范围 50% 的有 15 例 (75%) (2) 正常对照组 GBM 的厚度为 (378 9± )nm;20 例患者中以增厚为主的 (48 0% ~89 2%) 有 10 例, 以正常厚度为主的有 9 例 (40 1% ~57 9%), 以变薄为主的有 1 例, 变薄范围为 38.6%( 表 2) (3) 未发现尿蛋白量血 Scr 与 GBM 增厚范围相关, 未发现血 Scr 与 GBM 撕裂范围相关 (P>0 05), 仅发现尿蛋白量与 GBM 撕裂范围相关 (r=0 53,P=0 025) 2.3 免疫组织化学染色结果 lamininα1: 正常对照组的 lamininα1 主要在肾小球系膜区显色, 在 GBM 上均为阴性患者的 lamininα1 在肾小球系膜区的分布明显低于对照组, 而主要在 GBM 上呈不均匀分布 ( 图 2), 评分为 1 53±0 90 尿蛋白量与该评分呈正相关 (r= 0 63,P=0 005),GBM 增厚或撕裂范围与之呈正相关 (r=0 76,P<0 001;r=0 56,P=0 015; 表 3) 表 2 电镜下 Alport 综合征患者的 GBM 厚度及撕裂范围 Table2 ExtensionofGBM thicknesandgbm splitingunder electronmicroscope(em)inpatientswithalport ssyndrome No.of patients Split GBM Thickand splitgbm ThinGBM Normal GBM ThickGBM % 62.4% 1.8% 11.0% 87.2% % 26.8% 3.7% 29.6% 66.7% % 44.3% 9.9% 26.7% 63.4% % 16.1% 8.5% 50.8% 40.7% % 41.7% 6.3% 25.9% 67.7% % 30.6% 19.8% 27.6% 52.5% % 7.2% 23.1% 57.9% 19.0% % 3.1% 35.4% 48.6% 16.0% % 75.0% 8.1% 11.3% 80.6% % 22.7% 22.6% 44.1% 33.3% % 78.7% 2.9% 7.8% 89.2% % 21.1% 38.6% 36.4% 25.0% % 33.1% 10.5% 41.5% 48.0% % 19.5% 29.0% 47.3% 23.7% % 13.1% 22.6% 51.6% 25.8% % 21.9% 32.8% 40.1% 27.0% % 10.4% 31.6% 43.9% 24.6% % 52.7% 2.2% 34.4% 63.3% % 30.4% 14.6% 48.5% 36.9% % 56.5% 3.1% 15.2% 81.7%

黄巍, 等 Alport 综合征患者肾小球基底膜超微结构改变与层粘连蛋白的异常分布 633 图 1 A, 正常对照组的 GBM;B,1 例 Alport 综合征患者的 GBM 表现为厚薄不均且广泛撕裂分层 ; C,1 例 Alport 综合征患者的 GBM 表现为以变薄为主且撕裂分层 ;D,1 例 Alport 综合征患者的 GBM 表现为以增厚为主且广泛撕裂分层 ( 电镜 12000)

ssyndromewasdifusethinningandextensivespliting;d,gbm ofonepatientwithalport ssyndromewas difusethickeningandextensivespliting(em 12000)

4 黄巍, 等 Alport 综合征患者肾小球基底膜超微结构改变与层粘连蛋白的异常分布 633 图 1 A, 正常对照组的 GBM;B,1 例 Alport 综合征患者的 GBM 表现为厚薄不均且广泛撕裂分层 ; C,1 例 Alport 综合征患者的 GBM 表现为以变薄为主且撕裂分层 ;D,1 例 Alport 综合征患者的 GBM 表现为以增厚为主且广泛撕裂分层 ( 电镜 12000) Figure1 A,GBM ofnormalcontrolsunderem;b,gbm ofonepatientwithalport ssyndromewasthickening,thinningandextensivespliting; C,GBM ofonepatientwithalport ssyndromewasdifusethinningandextensivespliting;d,gbm ofonepatientwithalport ssyndromewas difusethickeningandextensivespliting(em 12000) A,lamininα1waspositiveinglomerularmesangialareaandabsolutelynegativeinGBMinnormaltisue;B,lamininα5wasevenlypositiveinGBMin normaltisue;c,lamininα1waspositiveinglomerularmesangialareaandingbmofpatientno.17,anditwasmoreingbmincontrasttonormalcon trols;d,lamininα5waspositiveingbm ofpatientno.17,butitwasweakerthannormalcontrols;e,lamininα1wasstronglypositiveingbm and negativeinmesangialareaofpatientno.18;f,lamininα5wasprominentlyreducedingbm ofpatientno.18. 图 2 lamininα1 和 lamininα5 的免疫组织化学染色 (DAB 显色 200) Figure2 Immunohistochemistrystainingoflamininα1andlamininα5(DABstaining 200) lamininα5: 正常对照组的 lamininα5 主要在 GBM 上均匀分布, 评分为 3 87±0 09 患者的 lamininα5 在 GBM 的分布低于正常对照组, 且分布不均匀 ( 图 2), 评分为 1 84±0 98 两组的评分差异有统计学意义 (P<0 001) 尿蛋白量与该评分呈负相关 (r=-0 63,P=0 005),GBM 增厚或撕裂范围与之亦呈负相关 (r= -0 59,P=0 01;r= -0 53,P=0.025; 表 3) 患者的 lamininα1 lamininα5 在 GBM 上分布的评分呈高度负相关 (r= -0 83,P<0 001; 图 3) 3 讨论 laminin 和 Ⅳ 型胶原是构成 GBM 的两大网架结

5 634 构,nidogen 和 HSPGs 连接它们, 使两者之间关系紧密 [4] 人类 GBM 在从形成到成熟的过程中,laminin α1 将被 lamininα5 所替代正常人的 GBM 被证实主要是 lamininα5, 而不存在 lamininα1 [6-7] 本研究结果发现, 患者的 GBM 上出现不同程度的 lami ninα1, 而正常对照组没有 ; 患者 GBM 上的 laminin α5 分布少于正常对照组 ; 患者的 lamininα1 与 lami ninα5 在 GBM 上的分布呈高度负相关这些发现表明, 在 Alport 综合征患者中, 由于 GBM 成熟的 Ⅳ 胶原 α3α4α5 缺乏, 进一步导致了另一个网架结构 laminin 的幼稚化异常, 即出现了胚胎期的 lami ninα1 与成熟型的 lamininα5 减少这一发现与目前国际上唯一的有关报道 (Kashtan 等 [8] ) 不一致, 该报道未发现患者 GBM 的 lamininα1 和 α5 与正常人有差别由于本研究采用的是免疫组织化学方法, 染色结果在光镜下观察非常清晰, 观察的肾小球数目明显多于上述研究采用的免疫荧光方法, 且本研究结果与目前相对较多的动物实验结果完全一致 [9-10], 因此, 我们相信本研究此次发现的可靠性表 3 尿蛋白量,GBM 增厚范围撕裂范围与 lamininα1 和 lamininα5 评分的相关关系 Table3 Corelationsofurinaryprotein,theextensionof GBM thickening,gbm splitingandscoresof lamininα1andlamininα5 Corelation lamininα1 lamininα5 r P r P Urinaryprotein ExtensionofGBM thickening 0.76 < ExtensionofGBM spliting 图 3 Alport 综合征患者 GBM 上 lamininα1 与 lamininα5 评分呈高度负相关 (Spearman 相关 ) Figure3 Highnegativecorelationofsemiquantitativescoresbetween lamininα1andlamininα5inpatientswith Alport ssyndrome(r=-0.83,p<0.001) 本研究的另一项重要发现是 Alport 综合征患者 GBM 的增厚或撕裂范围与 lamininα1 在 GBM 的分布呈正相关, 与 lamininα5 在 GBM 的分布呈负相关此外, 由于 Alport 综合征的 Ⅳ 型胶原 α3α4α5 普遍缺乏, 而 GBM 增厚撕裂程度很不均匀, 因此, 本研究认为 Ⅳ 型胶原异常虽然是本病的起始因素, 但它不是造成 GBM 增厚撕裂的直接原因, 很可能是它通过某些环节引起了 laminin 的上述异常, 而后者与 GBM 增厚撕裂的形态学改变关系密切同时, 本研究还发现尿蛋白量与 GBM 分布的 laminin α1 呈正相关, 与 lamininα5 呈负相关, 说明 laminin 的这些异常不仅可能引起了 GBM 形态改变, 而且参与了滤过屏障的异常, 这些都需要今后进一步深入研究参考文献 [1]KashtanCE,MichaelAF.Alportsyndrome:from bedsidetoge nometobedside[j].am JKidneyDis,1993,22(5): [2] KashtanCE,MichaelAF.Alportsyndrome[J].KidneyInt, 1996,50(5): [3] MinerJH.Developmentalbiologyofglomerularbasementmem branecomponents[j].curopinnephrolhypertens,1998,7 (1): [4] LeBleuVS,MacDonaldB,KaluriR.Structureandfunctionof basementmembranes[j]. Exp BiolMed,2007,232(9): [5]MinerJH,YurchencoPD.Lamininfunctionsintisuemorphoge nesis[j].annurevceldevbiol,2004,20(1): [6] MinerJH.Renalbasementmembranecomponents[J].Kidney Int,1999,56(6): [7] MinerJH,PatonBL,LentzSI,etal.Thelamininalphachains: expresion,developmentaltransitions,andchromosomallocations ofalpha1 5,identificationofheterotrimericlaminins8 11,and cloningofanovelalpha3isoform [J].JCelBiol,1997,137 (3): [8]KashtanCE,KimY,LeesGE,etal.Abnormalglomerularbase mentmembranelamininsinmurine,canine,andhumanalport syndrome:aberantlaminina2depositionisspeciesindependent [J].JAmSocNephrol,2001,12(2): [9] AbrahamsonDR,PretymanAC,RobertB,etal.Laminin 1re expresioninalportmouseglomerularbasementmembranes[j]. KidneyInt,2003,63(3): [10] AbrahamsonDR,IsomKS,EileenR,etal.Laminincompensa tionincolagenα3(iv)knockout(alport)glomerulicontributes topermeabilitydefects[j].jam SocNephrol,2007,18(9): [11] PaolaB,AndreaOM,GiannaM,etal.Distributionofα chains oftypeⅣcolageninglomerularbasementmembraneswithultra structuralalterationssuggestiveofalportsyndrome[j].nephrol DialTransplant,2001,16(5): [12]HaasM.Thinglomerularbasementmembranenephropathy:inci dencein3471consecutiverenalbiopsiesexaminedbyelectronmi croscopy[j].archpathollabmed,2006,130(5): [13]DischeFE.Measurementofglomerularbasementmembranethick nesanditsapplicationtothediagnosisofthin membranenephro pathy[j].archpathollabmed,1992,116(1): [14] 蒋镭, 吕继成, 陈文芳, 等.IgA 肾病简明半定量病理评分方法及其与预后的关系 [J]. 中华肾脏病杂志,2007,23(5): ( 收稿 ) ( 本文编辑 : 任英慧 )

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人