98 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2018,49(1): 第 49 卷过度积累所导致的肾小球硬化是糖尿病肾病的主要病理特点, 通常伴有蛋白尿和肾小球滤过率下降等临床表现 [3-6] 纤维粘连蛋白(fibronectin,FN) 是

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1 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2018,49(1): 穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制李梦诗, 吴腾, 曹静桦, 何亚军, 亓翠玲, 王丽京 ( 广东药科大学基础学院血管生物学研究所, 广州 ) 摘要利用自发 2 型糖尿病基因工程 Lepr db/db 小鼠糖尿病小鼠模型, 探讨穿心莲内酯 (andrographolide,andro) 对糖尿病肾病的作用及机制利用试剂盒检测 Andro 治疗 Lepr db/db 小鼠 24h 后的尿蛋白血肌酐和血尿素氮水平 ; 利用 HE 染色和 PAS 染色分别检测 Andro 对糖尿病小鼠肾脏组织的病理改变和还原糖水平的影响 ; 采用免疫组织化学染色法检测 Andro 对 Lepr db/db 小鼠肾脏的纤维粘连蛋白 (FN) 和 NOX 4 的影响结果显示,Andro 治疗组 (1mg/kg,ip) 的 24h 后 Lepr db/db 小鼠的尿蛋白血肌酐和血尿素氮等生化指标水平明显低于对照组,Andro 能抑制 Lepr db/db 小鼠肾脏的病理改变和 FN NOX 4 的表达, 表明 Andro 可以显著改善自发 2 型糖尿病基因工程小鼠 Lepr db/db 小鼠的糖尿病肾病关键词穿心莲内酯 ; 糖尿病肾病 ;Lepr db/db 转基因小鼠 ; 系膜细胞中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 (2018) doi: /j.isn 引用本文李梦诗, 吴腾, 曹静桦, 等穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制 [J]. 中国药科大学学报,2018,49(1): Citethisarticleas:LIMengshi,WUTeng,CAOJinghua,etal Efectsandmechanismofandrographolideondiabeticnephropathymice[J].JChina PharmUniv,2018,49(1): Efectsandmechanism ofandrographolideondiabeticnephropathymice LIMengshi 牞 WUTeng 牞 CAOJinghua 牞 HEYajun 牞 QICuiling 牞 WANGLijing VascularBiologyResearchInstitute 牞 SchoolofBasicCourse 牞 GuangdongPharmaceuticalUniversity 牞 Guangzhou 牞 China Abstract Toinvestigatetheefectsandmechanismofandrographolide 牗 Andro 牘 ontypeidiabeticnephropathy inlepr db/db mice 牞 levelsofurinaryprotein 牞 serumcreatinineandbloodureanitrogenafter24hofandro 牗 1mg/ kg 牞 ip 牘 treatmentonlepr db/db miceweremeasuredbykit.thechangesonrenalpathologyandsugarlevelsin diabeticmicetreatedbyandrowereobservedbyhestainingandpasstaining.theexpresionoffibronectin 牗 FN 牘 andnox 4proteinwereanalyzedbyimmunofluorescence.Resultsshowedthatlevelsofurinaryprotein 牞 serumcreatinineandbloodureanitrogeninlepr db/db miceafterandrotreatmentfor24hweresignificantlylower thanthoseofthecontrolgroup.kidneypathologicchangewasinhibited 牞 andfn andnox 4expresionwere markedlydecreaseintheandrogroup.inconclusion 牞 Androcansignificantlyreducethediabeticnephropathyin Lepr db/db micewithspontaneoustype Idiabetesmelitus. Keywords andrographolide 牷 diabeticnephropathy 牷 Lepr db/db mice 牷 mesangialcels Thisstudywassupported bythescienceand TechnologyPlanningProjectofGuangdongProvince 牗 No 2014B No 2014A 牞 No 2015A 牞 No 2013B 牘糖尿病是常见的内分泌疾病, 在全球流行性疾病中仅次于心脑血管疾病肿瘤艾滋病位列第 4, 严重威胁着人类健康 [1] 糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症, 也是导致终末期肾病的重要因素, 最终导致肾衰竭 [2] 肾小球系膜细胞是肾小球的主要功能细胞, 无论是在肾脏的生理功能或是病理变化中都发挥着重要作用由肾小球系膜细胞的过度增生及细胞外基质 (extracelularmatrix,ecm) 的收稿日期通信作者 Tel: E mail:wanglijing62@163 com 基金项目广东省科技计划资助项目 (No 2014B ,No 2014A ,No 2015A ,No 2013B )

2 98 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2018,49(1): 第 49 卷过度积累所导致的肾小球硬化是糖尿病肾病的主要病理特点, 通常伴有蛋白尿和肾小球滤过率下降等临床表现 [3-6] 纤维粘连蛋白(fibronectin,FN) 是 ECM 的主要成分, 是评价 ECM 累积的重要指标 [7] 有研究报道糖尿病患者机体内氧化应激水平有升高的趋势, 可以在糖尿病肾病患者肾脏中检测到活性氧化物质 (reactiveoxygenspecies,ros) 增高有研究提示, 在糖尿病动物模型中, 通过抑制肾脏 ROS 水平可有效改善肾小球和肾小管的病理性改变 [8] 亦有研究表明,NAPDH 氧化酶 4(NOX 4) 是肾脏细胞 ROS 产生的主要途径之一 [9-13] 穿心莲属爵床科穿心莲属植物, 其主要有效成分为穿心莲内酯 (andrographolide,andro), 是一种二环双萜内酯类化合物中医认为穿心莲属于寒性药物, 有消热排毒的疗效近年研究表明 Andro 具有抗炎的作用, 并对动脉粥样硬化高血压及肿瘤有一定疗效及抑制作用 [14-16] 此外 Andro 还被发现能够在 1 型糖尿病中发挥保护胰岛 β 细胞的功能及减缓 NOD 小鼠自发免疫性糖尿病的病理进程 [17-18] 另外, 也有研究证实 Andro 能通过减少细胞 ROS 产生, 从而在体内 / 体外达到治疗与氧化应激相关疾病的目的 [19-21] 目前,Andro 对糖尿病肾病的作用尚未见报道, 本研究利用自发糖尿病转基因 Lepr db/db 小鼠, 研究 Andro 对 Lepr db/db 小鼠糖尿病肾病的作用及其机制材料 1 1 试剂穿心莲内酯粉末 ( 美国 Sigma 公司 ) 溶解于 DMSO 中, 配成质量浓度为 200mg/mL 的溶液, 使用时蒸馏水稀释 1000 倍 ;24h 尿蛋白检测试剂盒肌酐检测试剂盒和尿素氮检测试剂盒 ( 南京建成生物工程研究所 ); 苏木精染液小鼠及兔二抗 DAB 显色试剂 ( 北京中杉金桥生物有限公司 ); BSA[ 生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ],4% 多聚甲醛溶液 ( 博士德生物工程有限公司 ) 1 2 仪器 PR MBJ 1 全自动生物组织包埋机 (PR 公司 ); 石蜡切片机 ( 德国 Leica 公司 ); 独立送回风净化笼具 IVC 与小鼠代谢笼 ( 苏杭科技器材有限公司 ); 倒置显微镜 ( 日本 Olympus 公司 ); 冷冻高速离心机 ( 德国 Eppendorf 公司 ); 酶标仪 ( 美国 BioTek 公司 ) 1 3 动物转基因小鼠 Lepr db/db 小鼠购自南京大学模式动物研究所 (Jackson 实验室货号 ),C57BL/ 6 小鼠购自广东省动物中心, 许可证号 :SCXK( 粤 ) 小鼠自购买后均饲养于 SPF 级实验动物环境中, 光照时间为 12h/12h 昼夜交替所有动物实验均符合动物伦理委员会标准方法 2 1 小鼠分组及给药选用 18 周龄体重在 42~48g 的雄性 Lepr db/db 小鼠, 剪指做好标记, 将小鼠随机分为两组, 一组每两天腹腔注射 1μg/gAndro 至 26 周 [7], 另一组则注射 DMSO 溶解的相同体积的生理盐水至 26 周, 另外, 选用同样周龄的体重在 28~32g 雄性 C57BL/6 小鼠作为阴性对照组每组各 7 只 2 2 肌酐尿素氮, 尿蛋白含量的测定治疗 8 周后, 将小鼠置于代谢笼中 24h, 从收集尿液的瓶子中取出尿样, 进行尿蛋白和尿素氮的检测将小鼠眼眶取血,4000r/min 离心取上清液, 检测血清中的肌酐水平用 AU800 全自动生化分析仪检测血肌酐尿素氮其中血肌酐采用苦味酸法, 尿素氮采用脲酶法 24h 尿蛋白定量 : 采用考马斯亮蓝法检测实验小鼠 24h 尿蛋白含量 2 3 苏木精伊红 (HE) 染色石蜡切片梯度脱蜡, 水化, 苏木精染色 1 分 30 秒, 流水返蓝 1h, 伊红染色 15 秒, 流水冲洗 3 遍, 脱水透明, 中性树脂封片 2 4 过碘酸希夫 (PAS) 染色石蜡切片梯度脱蜡至水, 蒸馏水洗 1~2min, 过碘酸溶液氧化 10min, 流水洗 10min, 希夫 (Schif) 试剂染色 10min, 流水洗 5min, 苏木精染核 2min, 流水冲洗 10min, 常规脱水透明封片 2 5 免疫组化石蜡切片脱蜡后, 用 PBS 洗 3 次, 每次 5min 高压修复 5min PBS 洗后, 用 3% 过氧化氢甲醇 37 孵育 30min PBS 洗 3 次, 每次 5min,10% BSA 封闭一抗 (1%BSA 稀释 1 100)4 冰箱孵育过夜第 2 天, 复温后,PBS 洗,37 烘箱孵育

第４９卷第１期李梦诗等穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制９９相应二抗１ＢＳＡ稀释１１４ｍＤＡＢ显对照组明显降低图１色苏木精染核后脱水透明封片３２Ａ对Ｌ小鼠肾小球病理性变化的ＰＡＳ染色及免疫组化染色由ＩｍＰＰ统计积分光密度ＩＯＤ２６统计学处理影响治疗结束后取材石蜡包埋切片ＨＥ染色结果发现Ａ

3 第４９卷第１期李梦诗等穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制９９相应二抗１ＢＳＡ稀释１１４ｍＤＡＢ显对照组明显降低图１色苏木精染核后脱水透明封片３２Ａ对Ｌ小鼠肾小球病理性变化的ＰＡＳ染色及免疫组化染色由ＩｍＰＰ统计积分光密度ＩＯＤ２６统计学处理影响治疗结束后取材石蜡包埋切片ＨＥ染色结果发现Ａ实验组与对照组相比治疗组肾采用ＧＰＰｍ５软件对数据进行单小囊结构恢复正常肾小球细胞的细胞核排列规因素方差分析以Ｐ５为差异有统计学意义则提示Ａ能显著改善Ｌ小鼠肾小球系 ( 结膜的扩张图２Ａ果此外为检测小鼠肾脏中的还原糖水平对这３１Ａ对Ｌ小鼠的２４尿蛋白血肌酐３种小鼠的切片进行ＰＡＳ染色图２Ｂ发现和血尿素氮水平的影响Ａ治疗后Ｌ小鼠肾脏着色比对照组明显用Ａ治疗Ｌ小鼠随机分为两组一减轻Ｐ５与正常Ｃ５７ＢＬ６小鼠水平相近组每２天腹腔注射１μ Ａ至２６周另一组可以减轻肾脏还原糖累积因此表明Ａ则注射相同体积ＤＭＳＯ溶解的的生理盐水治疗Ａ能够改善Ｌ小鼠在形态学上的肾损后发现Ａ治疗组的２４尿蛋白Ｐ１伤同时也能减轻Ｌ小鼠整个肾脏的还原糖５和血尿素氮Ｐ１水平比血肌酐Ｐ水平图２Ｂ２ＣＦ１ＡＡ２４ｍＬｍｘ７珋± ＡＡｂｍＢＳｍＣＢＰ５Ｐ１Ｐ１Ｐ１Ｆ２ＡｍｍＬｍＡＨＥ４ＢＰＡＳ４ＣＳＰＡＳｘ５Ｐ５珋± ３３Ａ对Ｌ小鼠肾脏中ＦＮ表达的影响ＦＮ是ＥＣＭ的主要成分ＥＣＭ的累积与糖尿病肾病的发展密切相关本研究用免疫组化进行ＦＮ染色图３发现ＤＭＳＯ组Ｌ小鼠肾ＦＮ

学报ＪＣＰｍＵ２１８４９１９７１１１第４９卷的水平明显高于正常对照组小鼠Ｐ１少Ｌ小鼠肾脏中ＦＮ的积累进而改善糖尿治疗减少Ｌ小鼠肾脏中ＦＮ表达水而Ａ病肾病１上述结果证明Ａ可以通过减平ＰＦ３ＥＡｂＦＮｘＬｍｋＡＦＮｍｍｍｂｍＬｍ４ＢＳｍｍｍｘ５珋± Ｐ

ｂｍＬｍ４ＢＳｍｍｍｘ珋± ５Ｐ１ ) 讨论糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一在我国的发病率亦呈上升趋势２４的糖尿病患者会并发糖尿病肾病严重影响了患者的生活质量糖尿病肾病的发病机制尚未明确可以通过测量血尿素氮血清肌酐肌酐清除率和蛋白尿来诊断糖尿病肾病２２目前糖尿病肾病临床常用药一般分为降糖类药物和非降糖类药物常用的

4 学报ＪＣＰｍＵ２１８４９１９７１１１第４９卷的水平明显高于正常对照组小鼠Ｐ１少Ｌ小鼠肾脏中ＦＮ的积累进而改善糖尿治疗减少Ｌ小鼠肾脏中ＦＮ表达水而Ａ病肾病１上述结果证明Ａ可以通过减平ＰＦ３ＥＡｂＦＮｘＬｍｋＡＦＮｍｍｍｂｍＬｍ４ＢＳｍｍｍｘ５珋± Ｐ１Ｐ１３４Ａ对Ｌ小鼠肾小球ＮＯＸ４水平的脏中ＮＯＸ４的表达水平Ｐ１上述结果提影响示Ａ可能是通过减少Ｌ小鼠细胞ＮＯＸ相比Ｃ５７ＢＬ６小鼠ＮＯＸ４在Ｌ小鼠肾小球系膜中的大量表达Ａ治疗减少了小鼠肾４的表达水平进而改善糖尿病肾病中的氧化应激状态从而改善糖尿病肾病Ｆ４ＥＡＮＯＸ４ｘＬｍｋＡＮＯＸ４ｍｍｍｂｍＬｍ４ＢＳｍｍｍｘ珋± ５Ｐ１ ) 讨论糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一在我国的发病率亦呈上升趋势２４的糖尿病患者会并发糖尿病肾病严重影响了患者的生活质量糖尿病肾病的发病机制尚未明确可以通过测量血尿素氮血清肌酐肌酐清除率和蛋白尿来诊断糖尿病肾病２２目前糖尿病肾病临床常用药一般分为降糖类药物和非降糖类药物常用的ＭＣ细胞增殖和ＦＮ的表达但是Ａ对自发糖尿病Ｌ小鼠糖尿病肾病的作用尚未见研究Ｌ小鼠是由美国Ｊｋ实验室于１９６６年在Ｃ５７ＢＬＫＳＪＢＫＳ近交系中发现糖尿病突变基因是位于小鼠４号染色体的瘦素受体基因发生突变所致２６因其多饮多食多尿肥胖高血糖高胰岛素血症等症状与人类２型糖尿病患者的临床症状相似因此被广泛应用于糖尿病及其并发症等疾病的研究中本研究利用Ｌ小鼠研究了Ａ对糖尿治疗糖尿病肾病的中成药有肾康注射液黄芪注射２３可以显著降低Ｌ液等黄芪注射液可以降低肾脏蛋白的排泄病肾病的作用发现Ａ小鼠２４尿蛋白尿肌酐和血尿素氮的水平显著具有保护肾脏的功能２４Ａ具有抗炎抗肿瘤及治疗动脉粥样硬化改善了Ｌ小鼠肾脏代谢相关的生化指标代谢水平另外本研究通过观察Ｌ小鼠肾脏组等的作用近年来研究发现Ａ能够改善自发１７１８治疗对Ｌ小鼠的肾小球免疫性糖尿病ＮＯＤ小鼠的糖尿病病理进程织形态发现Ａ２５病理性改变有明显的改善作用并且可以减少其肾Ｌ等也报道Ａ可以显著降低高糖诱导

5 第 49 卷第 1 期李梦诗, 等 : 穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制 101 脏的还原糖水平和 ECM 的累积近年来, 越来越多的研究表明, 氧化应激在糖尿病肾病的发展进程中发挥着不可忽视的作用 [27] 为此, 本研究进一步研究发现 Andro 可能通过降低 Lepr db/db 小鼠肾脏中 NOX 4 表达水平以抑制肾脏细胞的氧化应激状态, 进而缓解了 Lepr db/db 小鼠糖尿病肾病的病情然而,Andro 对 Lepr db/db 小鼠糖尿病肾病的具体分子机制尚需进一步研究参考文献 [1] DanaeiG,FinucaneMM,LuY,etal.National,regional,andglob altrendsinfastingplasmaglucoseanddiabetesprevalencesince 1980:systematicanalysisofhealthexaminationsurveysandepide miologicalstudieswith370country yearsand2.7milionpartici pants[j].lancet,2011,378(9785):31-40 [2] SunH,YuanY,SunZL.Cholesterolcontributestodiabetic nephropathythroughscap SREBP 2Pathway[J].IntJEndocri nol,2013,2013: [3] ForbesJM,FukamiK,CooperME.Diabeticnephropathy:where hemodynamicsmeetsmetabolism[j].expclinendocrinoldiabe tes,2007,115(2):69-84 [4] JerumsG,PanagiotopoulosS,PremaratneE,etal.Integrating albuminuriaandgfrintheasesmentofdiabeticnephropathy [J].NatRevNephrol,2009,5(7): [5] TramontiG,KanwarYS.Reviewanddiscusionoftubularbiomar kersinthediagnosisandmanagementofdiabeticnephropathy [J].Endocrine,2013,43(3): [6] Zhang,XF,TanBK.Anti diabeticpropertyofethanolicextractof Andrographispaniculatainstreptozotocin diabeticrats[j].acta PharmacolSin,2000,21(12): [7] MeniniS,AmadioL,OddiG,etal.Deletionofp66Shclongevity geneprotectsagainstexperimentaldiabeticglomerulopathyby preventingdiabetes inducedoxidativestres[j].diabetes,2006, 55(6): [8] JiX,LiC,OuY,etal.Andrographolideamelioratesdiabetic nephropathybyatenuatinghyperglycemiamediatedrenaloxidative stresandinflammationviaakt/nf κb pathway[j].molcel Endocrinol,2016,437: [9] BaynesJW.Roleofoxidativestresindevelopmentofcomplica tionsindiabetes[j].diabetes,1991,40(4): [10] GiaccoF,BrownleeM.Oxidativestresanddiabeticcomplications [J].CircRes,2010,107(9): [11] SchnackenbergCG.Oxygenradicalsincardiovascular renaldis ease[j].curopinpharmacol,2002,2(2): [12] GorinY,BlockK,HernandezJ,etal.Nox4NAD(P)H oxidase mediateshypertrophyandfibronectinexpresioninthediabetic kidney[j].jbiolchem,2005,280(47): [13] FujiM,InoguchiT,MaedaY,etal.Pitavastatinameliorates albuminuriaand renalmesangialexpansion bydownregulating NOX4indb/dbmice[J].KidneyInt,2007,72(4): [14] SheejaK,GuruvayoorappanC,KutanG.Antiangiogenicactivity ofandrographispaniculataextractandandrographolide[j].int Immunopharmacol,2007,7(2): [15] SinhaJ,MukhopadhyayS,DasN,etal.Targetingofliposomal andrographolidetol.donovani infectedmacrophagesinvivo[j]. DrugDeliv,2000,7(4): [16] JadaSR,HamzahAS,LajisNH,etal.Semisynthesisandcytotoxic activitiesofandrographolideanalogues[j].jenzymeinhibmed Chem,2006,21(2): [17]ZhangZ,JiangJ,YuP,etal.Hypoglycemicandbetacelprotec tiveefectsofandrographolideanaloguefordiabetestreatment [J].JTranslMed,2009,7:62 [18] ZhangC,GuiL,XuY,etal.PreventiveefectsofAndrographolide onthedevelopmentofdiabetesinautoimmunediabeticnodmice byinducingimmunetolerance[j].intimmunopharmacol,2013, 16(4): [19]YanGR,ZhouHH,WangY,etal.ProtectiveefectsofAndrogra pholideanalogueal 1onROS inducedrin mbetaceldeathby inducingrosgeneration[j].plosone,2013,8(6):e63656 [20]DeySK,BoseD,HazraA,etal.Cytotoxicactivityandapoptosis inducingpotentialofdi spiropyrolidinoanddi spiropyrolizidino oxindoleandrographolidederivatives[j].plosone,2013,8(3): e58055 [21] ZhuYY,YuG,ZhangY,etal.A novelandrographolide derivativeal 1exertsitscytotoxicityonK562celsthrougha ROS dependentmechanism[j].proteomics,2013,13(1): [22] KaurM,BediO,SachdevaS,etal.Rodentanimalmodels:from mildtoadvancedstagesofdiabeticnephropathy[j].inflammop harmacology,2014,22(5): [23] FangWH.Drugtreatmentofdiabeticnephropathy[J].AnhuiMed PharmJ( 安徽医药 ),2009,13(2): [24] ChengSH,HouFY,ZhangLJ.Investigationoncurativeefectof astragalusinjectiononddiabeticnephrosis[j].chintraditpat Med( 中成药 ),2000,22(3): [25]LanT,WuT,GouH,etal.Andrographolidesuppreseshighglu cose inducedfibronectinexpresioninmesangialcelsviainhibi tingtheap 1pathway[J].JCelBiochem,2013,114(11): [26] HummelKP,DickieMM,ColemanDL.Diabetes,anewmutation inthemouse[j].science,1966,153(3740): [27] BrezniceanuML,LiuF,WeiCC,etal.Atenuationofinterstitial fibrosisandtubularapoptosisindb/dbtransgenicmiceoverex presingcatalaseinrenalproximaltubularcels[j].diabetes, 2008,57(2):

中草药

中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (

98 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2018,49(1): 第 49 卷 过度积累所导致的肾小球硬化是糖尿病肾病的主要病理特点, 通常伴有蛋白尿和肾小球滤过率下降等临床表现 [3-6] 纤维粘连蛋白(fibronectin,FN) 是

98 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2018,49(1): 第 49 卷过度积累所导致的肾小球硬化是糖尿病肾病的主要病理特点, 通常伴有蛋白尿和肾小球滤过率下降等临床表现 [3-6] 纤维粘连蛋白(fibronectin,FN) 是