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陨离昌
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1 114 基础研究白藜芦醇对慢性肾衰竭大鼠肾脏的保护作用及相关机制黄新忠温东海张敏谢琼虹马乐婷任月衡关熠陈靖林善锬郝传明摘要目的探讨白藜芦醇 (RSV) 对 5/6 肾切除大鼠肾脏的保护作用及对转化生长因子 (TGF) β Smad 信号通路的影响方法将 50 只雄性 SD 大鼠随机分为 3 组 : 假手术组 (,n=10) 5/6 肾切除组 (,n=20) 和 5/6 肾切除 +RSV 治疗组 (,n=20), 术后 1 周开始每天给予生理盐水或 RSV(20 mg/kg) 灌胃建模后每 4 周收集 24 h 尿液检测尿蛋白含量,12 周后处死大鼠, 收集血和肾组织标本观察血肌酐和肾组织病理改变免疫组化法观察各组大鼠肾组织 TGF β 结缔组织生长因子 (CTGF) 纤连蛋白 (FN) 和 Ⅰ 型胶原 (ColⅠ) 变化 Western 印迹法检测肾组织 Smad3 磷酸化和乙酰化 Smad3 表达, 免疫共沉淀检测 Sirt1 与 Smad3 的相互结合结果在术后 12 周尿蛋白量 [(152.14±30.49)mg/24 h 比 (25.34± 7.54)mg/24 h] 血肌酐 [(111.60±21.50)μmol/L 比 (53.90±11.59)μmol/L] 和肾小球硬化指数 (1.56±0.34 比 0.35±0.08) 均显著高于 ( 均 P<0.01),RSV 治疗可显著抑制上述改变 ( 均 P<0.01) 免疫组化结果显示大鼠 FN ColⅠ TGF β 和 CTGF 的表达高于 ( 均 P<0.01),RSV 治疗能显著抑制上述改变 Western 印迹显示,大鼠磷酸化 Smad3 和乙酰化 Smad3 的表达显著高于 ( 均 P<0.05),RSV 治疗可显著降低乙酰化 Smad3 的表达 (P<0.05), 但并未显著降低磷酸化 Smad3 的表达免疫共沉淀研究显示 Sirt1 与 Smad3 相互作用结论 RSV 可改善肾切除大鼠蛋白尿肾功能和纤维化等指标, 其作用机制可能与激活 Sirt1, 降低乙酰化 Smad3 的表达有关, 提示 Sirt1 可能是慢性肾脏病潜在的治疗靶点关键词肾切除术 ; 转化生长因子 β; Smad 蛋白质类 ; Sirt1 蛋白 ; 白藜芦醇 Protective effect of resveratrol on 5/6 nephrectomized rats and its mechanism HUANG Xin zhong, WEN Dong hai, ZHANG Min, XIE Qiong hong, MA Le ting, REN Yue heng, GUAN Yi, CHEN Jing, LIN Shan tan, HAO Chuan ming. Department of Nephrology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai , China Corresponding author: HAO Chuan ming, chuanminghao@fudan.edu.cn Abstract Objective To investigate the protective effect of resveratrol (RSV) on 5/6 nephrectomized rats and its mechanism. Methods Fifty male SD rats were randomly divided into three groups: sham operated (Sham, n=10), 5/6 nephrectomy (Nx, n=20), and 5/6 nephrectomy+rsv 20 mg/kg (Nx+RSV, n=20). RSV or normal saline was administered one week after 5/6 nephrectomy. Proteinuria was detected every 4 weeks. Serum creatinine and the renal pathological changes were measured after 12 weeks. Immunohistochemisty staining of fibronectin (FN), collagen Ⅰ, transforming growth factor β (TGF β) and connective tissue growth factor (CTGF) were used to analyze the changes of renal fibrosis. Western blotting was used to measure the expression of Smad3, phospho Smad3, and acety Smad3. Immunoprecipitation was used to detect the interaction between Sirt1 and Smad3. DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( ) 作者单位 : 上海, 复旦大学附属华山医院肾内科复旦大学肾脏病研究所 ( 黄新忠, 现在江苏南通大学附属医院肾内科 ) 通信作者 : 郝传明, chuanminghao@fudan.edu.cn

2 115 Results Compared with the sham operated rats, subtotal nephrectomy significantly increased proteinuria [(152.14±30.49) mg/24 h vs (25.34±7.54) mg/24 h], serum creatinine[(111.60±21.50) μmol/l vs (53.90±11.59) μmol/l], glomerular sclerosis index (1.56±0.34 vs 0.35±0.08) and the expressions of fibronectin, collagenⅠ, TGF β and CTGF in renal tissue at 12 weeks after operation (all P<0.01), and RSV treatment significantly inhibited the above up regulations (all P<0.01). Compared with the sham operated rats, subtotal nephrectomy increased the expression of phospholylation and acetylation of Smad3. RSV treatment significantly reduced the expression of acety Smad3, but had no effect on the phospho Smad3. Immunoprecipitation revealed a binding effect of Smad3 with Sirt1. Conclusions RSV treatment can attenuate proteinuria, protect renal function and inhibit renal fibrosis in 5/6 nephrectomized rats. This renal protective effect is associated with reduced Smad3 acetylation and activation of Sirt1, which suggesting that Sirt1 may be a potential therapeutic target of CKD. Key words Nephrectomy; Transforming growth factor beta; Smad proteins; Sirt1 protein; Resveratrol 纤维化在慢性肾脏病的发生发展中起着重要作用, 而转化生长因子 (TGF)β Smad 信号通路在肾脏纤维化发病机制中起重要作用 TGF β 通过活化细胞膜 I 型和 Ⅱ 型丝氨酸苏氨酸激酶受体, 使下游 Smad2/3 磷酸化并转移至胞核内, 与 TGF β 反应元件结合调节细胞增殖分化凋亡和细胞 [1] 外基质的积聚最近研究表明 TGF β 也可以通过诱导成纤维细胞 Smad3 乙酰化从而上调纤维化基因的表达, 提示 Smad3 的乙酰化在肾脏纤维化 [2] 中也可能起重要作用近年研究表明沉默信息调节因子 2 同源基因 Sirt1 属于 NAD + 依赖的 Ⅲ 类组蛋白去乙酰化酶, 广泛表达于哺乳动物器官, Sirt1 通过对组蛋白非组蛋白的去乙酰化作用, [3-4] 调节细胞的分化衰老凋亡和代谢白藜芦醇 (RSV) 是一种在红葡萄酒中发现的多酚类化合物, 系 Sirt1 的激动剂体内外研究表明,RSV 能 [5] 够通过激活 Sirt1 而产生重要的器官保护作用我们课题组前期的研究表明 Sirt1 激活可以保护单侧输尿管梗阻 (UUO) 小鼠肾髓质免受氧化应 [6] 激损伤, 减轻肾脏纤维化但有关 RSV 在慢性肾衰竭中的作用鲜见报道我们利用 5/6 肾切除的肾衰竭模型观察 RSV 对肾脏纤维化的影响, 探讨其可能的作用机制材料和方法 1. 动物模型制备及分组 : 体质量 180~200 g 雄性清洁级 SD 大鼠 50 只, 购买并饲养于复旦大学上海医学院动物实验中心随机分成 3 组 :(1) 假手术组 (,n=10): 以 10% 水合氯醛 (400 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠后, 仅作背部切口, 分两次剥离左右肾包膜, 保留肾上腺 1 周后每天定时灌服生理盐水 (4 ml/kg) (2)5/6 肾切除组 (,n=20): 二步法建立 5/6 肾切除模型, 造模 1 周后每天定时灌服生理盐水 (4 ml/kg) (3)5/6 肾切除 +RSV 治疗组 (Nx + RSV 组,n=20):RSV 粉剂 ( 上海世冠恒化学试剂公司 ), 溶于无菌生理盐水中, 造模 1 周后每天定时灌服 RSV 20 mg/kg 所有大鼠都予标准饲料喂养, 自由饮水, 于建模 12 周后处死大鼠 2. 生化指标测定 : 每 4 周用代谢笼收集 24 h 尿液检测尿蛋白量, 在处死大鼠前收集血标本和肾组织标本, 血标本室温下 1500 r/min 离心 15 min ( 离心半径 8 cm), 取上清肾组织置于 4% 中性多聚甲醛固定后乙醇梯度脱水, 石蜡包埋备用尿蛋白血肌酐由上海艾迪康医学检验中心检测 3. 肾组织形态学观察 :3 μm 肾组织石蜡切片行 PAS 染色, 光镜观察参考文献 [7] 以半定量方法评估肾小球硬化程度, 每张切片至少观察 20 个肾小球每个肾小球按损伤面积占肾小球毛细血管袢的百分比进行半定量评分 :0 分 : 正常 ;1 分 : 轻度损伤 ( 25%);2 分 : 中度损伤 (26%~50%);3 分 : 重度损伤 (51%~75%);4 分 : 极重度损伤 (>75%), 然后计算肾小球硬化指数 (GSI) 4. Western 印迹 : 提取肾皮质蛋白, 同时加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟化物 (PMSF,100 g/l) 抑肽酶 (1 mg/l) 和抗氧化剂 β 巯基乙醇 (1 mg/l), 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度等量加样后用 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE), 然后用电转移仪 ( 美国 Bio Rad) 转移到硝酸

3 116 纤维素膜上, 室温下用 5% 的脱脂奶封闭 1 h 洗膜后加入兔抗 Smad3 多克隆抗体和兔抗磷酸化 Smad3 (p Smad3) 单克隆抗体 ( 美国 Cell Signaling,1 500) 4 孵育过夜, 洗膜后加二抗 (1 2000) 室温下孵育 1 h, 应用 ECL 发光剂在 X 线胶片上曝光显影和定影结果由计算机凝胶图像分析系统分析 5. 免疫组化 : 按 Vector ABC Kit 免疫组化试剂盒操作步骤进行 3 μm 肾组织石蜡切片常规脱蜡脱水,3% 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶, 微波行抗原修复,5%BSA 封闭 20 min, 分别滴加兔抗 TGF β1 抗体 ( 美国 Santa Cruz,1 200) 鼠抗结缔组织生长因子 (CTGF) 抗体 ( 美国 Santa Cruz,1 200) 兔抗 Ⅰ 型胶原 (ColⅠ) 抗体 ( 美国 Abcam,1 1000) 鸡抗纤连蛋白 (FN) 抗体 ( 美国 Sigma,1 1000) 后 4 过夜, 次日滴加二抗 (1 200) 室温孵育 1 h,pbs 洗 3 次后滴加 ABC 复合物, 室温孵育 30 min,dab 显色, 苏木素复染, 透明, 封片每项检测均设阴性对照, 以 PBS 代替一抗光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位, 每张切片随机找出 20~30 个不重叠视野, 经 IMS 细胞图像分析系统拍照, 医学图像分析软件 Image Pro Plus 6.0 半定量分析, 以每个高倍视野下阳性表达的积分吸光度 (A) 表示阳性物质的相对含量 6. 免疫共沉淀 : 称取 100 mg 肾皮质标本, 加入 1 ml 含蛋白酶抑制剂 IP 裂解液冰上研磨 10 min, 将组织匀浆转移至 1.5 ml 的 EP 管中, 振摇冰浴 20 min 后 g 离心 10 min, 沉淀用 IP 裂解液加 420 mmol/l NaCl 和 25% 甘油重悬,4 轮转 30 min 后 g 离心 10 min, 取上清用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度每个样本取 50~100 mg 蛋白, 加入 20 μl 蛋白 A/G 琼脂糖和 2 μg 兔抗 Smad3 多克隆抗体或非特异性兔抗 IgG 作为对照,4 轮转 4 h 后 g 离心 10 min 弃上清, 加入 0.3 ml IP 裂解液,4 轮转 10 min 后 g 离心 10 min 弃上清, 重复 3 次弃上清, 加入 50 μl 裂解液和 10 μl 6 上样缓冲液, 振摇混匀后煮沸 10 min,-70 保存备用 Western 印迹检测蛋白的方法同上 7. 统计学分析 : 实验结果计量数据以 x ± s 表示, 组间比较采用单因素方差分析应用 SPSS16.0 统计软件进行统计分析结果 1. 各组生化指标 : 在 4 周 8 周和 12 周时大鼠 24 h 尿蛋白量显著高于 ( 均 P<0.01), 给予 RSV 干预后可以有效降低肾切除大鼠 24 h 尿蛋白量, 在 8 周 12 周时与差异均有统计学意义 ( 均 P<0.01) 与相比,12 周时大鼠血肌酐显著高于 (P<0.01), 而 RSV 干预可以显著降低血肌酐水平 (P<0.01), 见表 1 2. 肾组织形态学变化 :12 周时 PAS 染色显示,肾小球基本正常, 没有明显病理改变 ; 大鼠系膜区细胞外基质明显增多, 伴系膜细胞增生, 部分肾小球呈节段硬化改变 ; 而 RSV 干预组病理改变较有显著减轻, 见图 1 GSI 评分显著高于 (P<0.01),Nx+RSV 干预组 GSI 显著低于 (P<0.01), 见图 2 3. RSV 对肾组织 FN ColⅠ TGF β 和 CTGF 表达的影响 : 免疫组化结果显示, 与相比, FN ColⅠ TGF β 和 CTGF 表达明显增加, 而 RSV 干预组可以显著改善肾切除大鼠上述纤维化因子的表达, 见图 3 4. 肾组织 Smad3 和 p Smad3 的表达 : p Smad3 的表达显著高于 Smad3 组, 而 RSV 干预并未显著下调肾切除引起的 p Smad3 的表达, 见图 4 5. RSV 对肾组织中 Smad3 与 Sirt1 相互作用的影响 :大鼠肾组织乙酰化 (Ac) Smad3 的表达显著高于, 而 RSV 干预可以显著降低肾切除引起的 Ac Smad3 的表达免疫沉淀结果显示,Smad3 与 Sirt1 相互作用大鼠肾切除后,Sirt1 与 Smad3 的结合下降,Ac Smad3 的表达增加, 而表 1 各组大鼠尿蛋白及血肌酐水平 (n=10,x ± s) 组别 4 周尿蛋白量 (mg/24 h) 8 周 12 周血肌酐 (μmol/l) 12 周 22.35± ± ± ± ±28.77 b 93.28±34.48 b ±30.49 b ±21.50 b 32.89± ±18.62 ac 79.87±34.27 ac 83.00±14.69 bc 注 : 与比较, a P<0.05, b P<0.01; 与比较, c P<0.01

p Smad3 图4 A C 图1 肾小球硬化指数 C 12 周时各组大鼠肾组织病理

Smad3 12 周时各组大鼠肾组织 Ac Smad3 表达及 Smad3 与 Sirt1

1.6 52 000 IB Sirt1 图5 a Smad3 B 注 A B 2.

Sirt1 与 Smad3 的结合增加 Ac Smad3 的表达下降见图 5 TGF β

积扩大和肾小球呈节段性硬化改变且 GSI 评分显著高于证明 CKD 大鼠模型建立成功

4 p Smad3 图4 A C 图1 肾小球硬化指数 C 12 周时各组大鼠肾组织病理 PAS 400 Western 印迹 IP Smad3 IB Ac Smad3 IB Smad3 12 周时各组大鼠肾组织 Ac Smad3 表达及 Smad3 与 Sirt1 相互作用的影响免疫共沉淀论 ab 1.2 慢性肾脏病 CKD 是各种肾脏疾病持续进展 0.8 的最终结局严重威胁患者的生命, 其主要病理周时各组大鼠肾组织 p Smad3 和 Smad3 蛋白表达讨 IB Sirt1 图5 a Smad3 B 注 A B a 学特征为肾小球硬化和小管间质纤维化 [8] 本研 b 注 n 10 与比较 P 0.01 与比较 P 0.01 图2 12 周时各组大鼠肾小球硬化指数给予 Sirt1 激动剂 RSV 干预后 Sirt1 与 Smad3 的结合增加 Ac Smad3 的表达下降见图 5 TGF β 白量和血肌酐水平明显高于 PAS 染色可看到肾小球系膜细胞系膜基质增生系膜区面积扩大和肾小球呈节段性硬化改变且 GSI 评分显著高于证明 CKD 大鼠模型建立成功既往研究显示 RSV 可以通过 JNK NF κb p38 ColⅠ CTGF 究结果显示在术后 12 周时大鼠 24 h 尿蛋图3 12 周时各组大鼠肾组织 FN ColⅠ TGF β和 CTGF 的表达免疫组化 400 FN

5 118 [9-11] NO NOS 等信号通路发挥作用 ; 也可通过改善 [12] [2] 氧化应激, 减轻蛋白尿, 改善肾功能 Li 等发现, RSV 能特异性的抑制 UUO 小鼠术后 Smad3 的乙酰化, 从而改善术后肾间质纤维化的发生本课题组前期的研究亦表明, 使用 Sirt1 激动剂 RSV 或 SRT2183 上调 Sirt1 表达可提高细胞对氧化应激的存活率本研究结果显示 RSV 能明显降低大鼠 24 h 尿蛋白量和血肌酐水平, 减轻肾脏病理改变, 降低 FN ColⅠ TGF β1 和 CTGF 的表达, 保护肾功能 TGF β 及其下游的 Smad 信号通路在肾脏纤维化发病机制中起重要作用在 TGF β 血管紧张素 Ⅱ 和高级糖基化终末产物等作用下,Smad3 [13-15] 的磷酸化是导致纤维化的关键信号通路在 TGF β 诱导下,p300 CBP 也能够使 Smad3 乙酰化, [16-17] [2] 从而调节 Smad3 DNA 结合与转录活性 Li 等研究表明,TGF β 也可以通过诱导成纤维细胞 Smad3 乙酰化, 从而上调纤维化基因的表达, 提示 Smad3 的乙酰化在肾脏纤维化中可能起重要作用本研究结果表明, TGF β 和 p Smad3 的表达显著升高, 而 RSV 干预并未显著下调 p Smad3 的表达, 进一步研究显示, Ac Smad3 的表达显著升高,RSV 干预能显著下调 Ac Smad3 水平, 表明 RSV 的肾保护作用可能并非通过调节 p Smad3, 而是通过调节 Ac Smad3 起作用的免疫共沉淀结果显示,Smad3 与 Sirt1 二者相互作用, 肾切除后 Sirt1 与 Smad3 的结合下降,RSV 干预后 Sirt1 与 Smad3 的结合增加, 因此 Ac Smad3 表达下降, 这与 RSV 是 Sirt1 激动剂, 而 Sirt1 是去乙酰化酶, 具有去乙酰化的特性相一致综上述, 本实验成功制作了 5/6 肾切除大鼠 CKD 模型,RSV 治疗可改善肾切除大鼠术后蛋白尿肾功能肾脏病理和纤维化等指标, 其作用机制可能与激活 Sirt1, 降低 Ac Smad3 的水平有关, 提示 Sirt1 可能是慢性肾脏病潜在的治疗靶点 [1] [2] [3] 参考文献 Bottinger EP, Bitzer M. TGF beta signaling in renal disease. J Am Soc Nephrol, 2002, 13: Li J, Qu X, Ricardo SD, et al. Resveratrol inhibits renal fibrosis in the obstructed kidney: potential role in deacetylation of Smad3. Am J Pathol, 2010, 177: Hao CM, Haase VH. Sirtuins and their relevance to the [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] kidney. J Am Soc Nephrol, 2010, 21: 黄新忠, 郝传明. 沉默信息调节因子 T1 与肾脏疾病的研究进展. 中华肾脏病杂志, 2011, 8: Aubin MC, Lajoie C, Clement R, et al. Female rats fed a high fat diet were associated with vascular dysfunction and cardiac fibrosis in the absence of overt obesity and hyperlipidemia: therapeutic potential of resveratrol. J Pharmacol Exp Ther, 2008, 325: He W, Wang Y, Zhang MZ, et al. Sirt1 activation protects the mouse renal medulla from oxidative injury. J Clin Invest, 2010, 120: Iyoda M, Shibata T, Hirai Y, et al. Nilotinib attenuates renal injury and prolongs survival in chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol, 2011, 22: Strutz F, Zeisberg M. Renal fibroblasts and myofibroblasts in chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol, 2006, 17: Zhang L, Pang S, Deng B, et al. High glucose induces renal mesangial cell proliferation and fibronectin expression through JNK/NF kappab/nadph oxidase/ros pathway, which is inhibited by resveratrol. Int J Biochem Cell Biol, 2012, 44: Tikoo K, Singh K, Kabra D, et al. Change in histone H3 phosphorylation, MAP kinase p38, SIR2 and p53 expression by resveratrol in preventing streptozotocin induced type I diabetic nephropathy. Free Radic Res, 2008, 42: Chander V, Chopra K. Protective effect of nitric oxide pathway in resveratrol renal ischemia reperfusion injury in rats. Arch Med Res, 2006, 37: Sharma S, Anjaneyulu M, Kulkarni SK, et al. Resveratrol, a polyphenolic phytoalexin, attenuates diabetic nephropathy in rats. Pharmacology, 2006, 76: Roberts AB, Tian F, Byfield SD, et al. Smad3 is key to TGF beta mediated epithelial to mesenchymal transition, fibrosis, tumor suppression and metastasis. Cytokine Growth Factor Rev, 2006, 17: Wang W, Huang XR, Canlas E, et al. Essential role of Smad3 in angiotensin II induced vascular fibrosis. Circ Res, 2006, 98: Chung AC, Zhang H, Kong YZ, et al. Advanced glycation end products induce tubular CTGF via TGF beta independent Smad3 signaling. J Am Soc Nephrol, 2010, 21: Simonsson M, Kanduri M, Gronroos E, et al. The DNA binding activities of Smad2 and Smad3 are regulated by coactivator mediated acetylation. J Biol Chem, 2006, 281: Inoue Y, Itoh Y, Abe K, et al. Smad3 is acetylated by p300/ CBP to regulate its transactivation activity. Oncogene, 2007, 26: ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 王欣 )

20 2 CJITWN November. 2 No. 959 not markedly changed in two treatment groups in this experiment. 3. It is possible that addition an subtraction of Fan

20 2 CJITWN November. 2 No. 959 not markedly changed in two treatment groups in this experiment. 3. It is possible that addition an subtraction of Fan 958 20 2 CJITWN November 20 Vol. 2 No. * MCP - - MCP - AIN SD 4 + A - + B ADR 6. 5 mg /kg 2 24 h > 00 mg A B + - + 2 8 24 h 4 8 MCP - 2 24 h P < 0. 05 6. 5 mg /kg MCNS 2 RT - PCR MCP - MCP - MCP - A B