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娈慎
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1 第 27 卷第 20 期中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 9 月 China Journal of Modern Medicine Sept DOI: /j.issn 文章编号 : (2017) 基础研究论著二甲双胍对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究梅艳, 欧三桃 ( 西南医科大学附属医院肾内科, 四川泸州 ) 摘要 : 目的观察二甲双胍对链脲佐菌素 (STZ) 诱导糖尿病肾病大鼠肾脏的影响, 分析二甲双胍的防治功效及其机制方法选取健康雄性 14 周龄 Wistar 大鼠 36 只, 随机分为 3 组 : 正常对照组糖尿病模型组和二甲双胍干预组利用 STZ 诱导大鼠糖尿病, 正常对照组给予生理盐水, 第 8 周时大鼠糖尿病肾病模型复制成功采用 Western blot 检测各组大鼠肾脏中炎症细胞因子 [ 肿瘤坏死因子 α(tnf-α) 白介素 1β(IL-1β) 白介素 6(IL-6)] 和抗炎症细胞因子 [ 白介素 10(IL-10)] 的表达结果糖尿病模型组 TNF-α IL-1β 及 IL-6 的表达水平高于正常对照组 ( <0.05),IL-10 的表达水平低于正常对照组 ( <0.05); 给予二甲双胍干预后, 上述结果逆转 ( <0.05) 结论二甲双胍可通过抑制肾脏炎症细胞因子的表达, 保护 STZ 诱导的糖尿病大鼠的肾脏关键词 : 二甲双胍 ; 糖尿病 ; 肾病 ; 炎症细胞因子中图分类号 :R587.1 文献标识码 :A Protective effect of Metformin on Streptozotocin-induced nephropathy in diabetic rats Yan Mei, San-tao Ou (Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan , China) Abstract: Objective To observe the effect of Metformin on diabetic nephropathy induced by Streptozotocin in rats, and to explore its preventive and therapeutic effect on diabetic nephropathy. Methods Thirty-six healthy male 14-week-old Wistar rats were randomly divided into three groups, i.e. normal control group, diabetic group and Metformin intervention group. Streptozotocin was used to induce diabetic rat model. TNF- 琢, IL-1 茁, IL-6 and anti-inflammatory cytokine IL-10 in the renal tissues were detected by Western blot. Results The levels of TNF- 琢, IL-6 and IL-1 茁 in the renal tissues of the diabetic rats were significantly higher than those in the normal controls, while the IL-10 level was significantly lower than that in the control group ( <0.05). After treatment with Metformin, the levels of TNF- 琢, IL-6 and IL-1 茁 in the renal tissues decreased while the IL-10 level increased in the diabetic rats ( <0.05). Conclusions Metformin can ameliorate diabetic nephropathy induced by Streptozotocin in rats by inhibiting the expression of inflammatory cytokines. Keywords: Metformin; diabetes; nephropathy; inflammatory cytokine 糖尿病肾病是糖尿病患者死亡的主要病因之一, 其发病机制十分复杂, 可能与代谢紊乱肾小球血流动力学异常及遗传易感性有关最新研究发现, [1-2] 该病往往伴随炎症因子表达水平的增高, 甚至有学者认为, 糖尿病肾病本身就是一种炎症反应的过 [3-4] 程二甲双胍是双胍类口服降糖药物, 是目前 2 型糖尿病一线用药据报道, 二甲双胍可有效降低糖尿病肾病患者的尿白蛋白排泄率, 降低血肌酐和尿收稿日期 : [ 通信作者 ] 欧三桃, @qq.com 1

2 中国现代医学杂志第 27 卷 [5-7] 素氮水平, 表现出较为满意的肾脏保护作用但该种保护作用的机制目前并不清楚大量研究发现, 二甲双胍可抑制多种代谢性疾病相关的炎症因 [8-10] 子因此, 笔者提出假说, 二甲双胍通过抑制炎症因子 [ 肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 白介素 1β(interleukin-1β,IL-1β) 及白介素 6(interleukin-6,IL-6)] 的表达, 而实现对糖尿病肾病的保护作用为验证该假说, 设计本研究, 现报道如下 1 材料与方法 1.1 动物选取健康雄性 Wistar 大鼠 36 只,2 月龄, 体重 220~260 g[ 西南医科大学动物中心提供, 动物许可证号 :SCXK( 川 ) ], 动物饲养室温 23, 湿度 44%, 自由摄食饮水, 实验开始前测鼠尾外周血糖均正常, 将动物适应性喂养 1 周后开始实验药品与试剂二甲双胍链脲佐菌素 (Streptozocin,STZ) 购自美国 Sigma 公司,TNF-α IL-1β IL-6 及 IL-10 一抗和二抗购自美国 Abcam Biotechnology 公司实验动物分组实验动物分为 3 组 : 正常对照组糖尿病模型组及二甲双胍干预组, 每组 12 只单次腹腔注射 STZ 65 mg/kg 诱导糖尿病模型, 各组大鼠均在 48 h 后空腹采取外周血血糖 16.7 mmol [11] 的大鼠模型复制成功, 被视为糖尿病大鼠模型 1.2 方法模型的复制模型复制成功 1 周后, 二甲双胍干预组大鼠灌胃二甲双胍 20 mg/(kg d), 上午给药,1 次 /d, 连续灌胃 6 周, 糖尿病模型组和正常对照组给予等剂量的生理盐水 NaCl 灌胃, 直至取材实验动物组织标本的收集及检测在 8 周末时, 使用代谢笼收集正常对照组糖尿病模型组及二甲双胍干预组大鼠 12 h 尿液, 混匀后取 6ml, 将其置于温度 <40 的冰箱保存然后, 对糖化血红蛋白 (haemoglobin A1C,HbA1c) 尿白蛋白(Albumin, ALB) 细胞间黏附分子 -1 (intercellular adhesion molecule-1,icam- 单核细胞趋化蛋白 -1 及视黄醇结合蛋白 (retinol binding protein,rbp) 进行检测, 并对各组实验大鼠的排泄率予以合理计算 ; 同时经大鼠股动脉取血 2ml, 予以肝素抗凝血, 对血红蛋白 (Haemoglobin,Hb) 水平进行检测将实验大鼠麻醉后, 取出两侧肾脏, 在 4 NaCl 中洗净, 剥去肾包膜,4 NaCl 溶液冲洗肾脏 6 次称其左肾重量, 计 [12] 算肾脏肥大指数, 肾脏肥大指数 = 左肾重 / 体重用德国罗氏血糖仪进行血糖检测,Hb 和尿 ALB 采用微柱层析法进行检测动物处理分析将 10% 水合氯醛注射于腹腔内, 麻醉完成后通过颈椎脱臼的方式使大鼠死亡, 将其肾脏取出, 于 -80 冷冻保存制备蛋白样品 RNA:1 对 60~100 g 大鼠肾脏组织予以冷冻处理, 同时加入 1ml Trizol, 根据说明书提取总 RNA, 将 RNA 的 A260/A280 控制在 1.8~2.0;2 取肾脏组织约 200 mg, 在 2ml 含蛋白酶抑制剂磷酸盐缓冲溶液 (phosphate buffer saline,pbs) 中匀浆组织, 离心 15 min 左右 ;3 取上清液作为总蛋白样本 Western blot 检测实验通过 Western blot 检测对肾脏中炎症细胞因子 TNF-α IL-1β IL-6 及抗炎症细胞因子 IL-10 表达量进行比较 14 裂解分离组织, 匀浆液离心, 提取蛋白, 离心总蛋白, 超声波裂解, 提取破解液中的生物化蛋白 ;2 组织匀浆后, 提取蛋白变性成分, 用聚丙烯酰胺凝胶对蛋白样品电泳 2h 左右, 将分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上 ;3 将膜置于 3% 牛血清蛋白溶液中孵育 ;4 加炎症细胞因子 TNF-α IL-1β IL-6 及抗炎症细胞因子 IL-10 一抗 ( ),4 孵育过夜, 洗涤液洗一抗 ;5 加二抗 ( ), 室温孵 40min, 洗涤液洗二抗, 发光选取 NIH ImageJ 和 Imagine 软件分析图像并统计数据 1.3 统计学方法数据分析采用 SPSS 19.0 统计软件, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 多组间比较用方差分析, 两两比较用 SNK- 检验, <0.05 为差异有统计学意义 2 结果组大鼠血糖 HbA1c 比较 3 组大鼠血糖 HbA1c 比较, 经方差分析, 差异有统计学意义 ( <0.05) 两两比较采用 SNK- 检验, 糖尿病模型组与正常对照组的血糖 HbA1c 比较, 差异有统计学意义 ( = 和 , =0.004 和 0.000), 糖尿病模型组的血糖 HbA1c 高于正常对照组 ; 二甲双胍干预组与糖尿病模型组的血糖 HbA1c 比较, 差异有统计学意义 ( = 和 , = 和 0.000), 二甲双胍干预组的血糖 HbA1c 低 2

第 20 期梅艳, 等 : 二甲双胍对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究于糖尿病模型组见表 1 表 2 3 组大鼠尿生化肾脏肥大指数的比较 (x±s) 表 1 3 组大鼠血糖 HbA1c 水平比较 (x±s) 组别血糖 /(mmol/l) HbA1c/% 正常对照组 ( =12) 5.86±0.55 5.34±0.20 糖尿病模型组 ( =10) 31.45±2.09 9.18±1.

05) 两两比较采用 SNK- 检验, 糖尿病模型组与正常对照组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数比较, 差异有统计学意义 ( =23.940 20.810 和 49.117, 均 =0.000), 糖尿病模型组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数高于正常对照组 ; 二甲双胍干预组与糖尿病模型组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数比较, 差异有统计学意义 ( =19.051 23.

98±2.03 0.208±0.017 6.67±0.45 二甲双胍干预组 ( =1 9.87±0.45 0.089±0.02 5.67±0.65 值 36.104 19.174 28.135 值 0.000 0.

3 第 20 期梅艳, 等 : 二甲双胍对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究于糖尿病模型组见表 1 表 2 3 组大鼠尿生化肾脏肥大指数的比较 (x±s) 表 1 3 组大鼠血糖 HbA1c 水平比较 (x±s) 组别血糖 /(mmol/l) HbA1c/% 正常对照组 ( =12) 5.86± ±0.20 糖尿病模型组 ( =10) 31.45± ±1.43 二甲双胍干预组 ( = ± ±1,34 值值尿生化肾脏肥大指数比较 3 组大鼠的 ALB RBP 及肾脏肥大指数比较, 经方差分析, 差异有统计学意义 ( <0.05) 两两比较采用 SNK- 检验, 糖尿病模型组与正常对照组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数比较, 差异有统计学意义 ( = 和 , 均 =0.000), 糖尿病模型组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数高于正常对照组 ; 二甲双胍干预组与糖尿病模型组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数比较, 差异有统计学意义 ( = 和 , 均 =0.000), 二甲双胍干预组的 ALB RBP 及肾脏肥大指数低于糖尿病模型组见表肾脏病理学改变二甲双胍干预治疗 6 周时, 正常对照组的基底膜组别 ALB/ (μg/min) RBP/ (μg/min) 肾脏肥大指数正常对照组 ( =12) 2.45± ± ±0.67 糖尿病模型组 ( =10) 24.98± ± ±0.45 二甲双胍干预组 ( =1 9.87± ± ±0.65 值值处于同一状态, 未出现显著增厚, 也未出现足突细胞融合 ; 糖尿病模型组出现毛细血管基底膜增厚, 结构模糊不清, 发生足突破坏融合及消失, 系膜基质增多, 且出现肿胀 ; 二甲双胍干预组出现少量足突融合, 系膜区细胞出现轻度增生, 胞浆肿胀变性见图各组大鼠肾脏中 TNF-α IL-1β IL-6 及 IL- 10 表达水平比较 3 组大鼠肾脏中 TNF-α IL-1β IL-6 及 IL-10 表达水平比较, 经方差分析, 差异有统计学意义 ( < 0.05) 两两比较采用 SNK- 检验, 糖尿病模型组与正常对照组 TNF-α IL-1β IL-6 及 IL-10 表达水平比较, 差异有统计学意义 ( = 和 9.287, = 和 0.007), 糖尿病模型组的 TNF-α IL-1β IL-6 的表达水平高于正常对照组, 而 IL-10 的表达水平低于正常对照组 ; 二甲正常对照组糖尿病模型组二甲双胍干预组图 1 3 组大鼠肾脏病理学改变 ( 电镜 1 000) 双胍干预组与糖尿病模型组 TNF-α IL-1β IL-6 及 IL-10 表达水平比较, 差异有统计学意义 ( = 和 , = 和 0.003), 二甲双胍干预组的 TNF-α IL-1β IL-6 的表达水平低于糖尿病模型组, 而 IL-10 的表达水平较糖尿病模型组升高见图 ) 2) TNF-α IL-1β IL-6 2) TNF-α IL-1β IL-6 β-actin 1: 正常对照组 ;2: 糖尿病模型组 ;3: 二甲双胍干预组与正常对照组比较, <0.05;2) 与糖尿病模型组比较, <0.05 图 2 各组大鼠肾脏炎症因子 TNF-α IL-1β 及 IL-6 的表达 (x±s) 3

中国现代医学杂志第 27 卷与正常对照组比较, <0.05;2) 与糖尿病模型组比较, <0.05 图 3 IL-10 β-actin 3 讨论 1.5 1.0 0.

4 中国现代医学杂志第 27 卷与正常对照组比较, <0.05;2) 与糖尿病模型组比较, <0.05 图 3 IL-10 β-actin 3 讨论 : 正常对照组 ;2: 糖尿病模型组 ;3: 二甲双胍干预组各组大鼠肾脏抗炎因子 IL-10 的表达 (x±s) 高血糖可引起蛋白质脂类发生生理和生化特性的改变, 最终形成糖基化终末产物 [13], 其可诱导单核趋化蛋白转化生长因子 β 1 结缔组织生长因子及血管内皮生长因子的产生, 促使肾小球硬化 [14-15] ; 并且可促使血管 ICAM-1 与肾小管上皮细胞表达增多, 导致白细胞从小管周围毛细血管内皮细胞迁移至肾脏间质, 造成肾脏肥大, 肾功能受损 [16-17] 二甲双胍作为一种经典降糖药, 可有效改善糖尿病肾病患者的肾功能, 这可能涉及多种机制首先, 该药可通过多种机制降低血糖, 减少糖基化终末产物的产生 [18] ; 二甲双胍可减少谷胱甘肽过氧化物酶的表达, 从而降低肾脏组织内的氧化应激 [19] ; 另外该药可降低血小板聚集和黏附, 改善肾脏血管反应性及微循环 [20] 但目前关于二甲双胍是否通过抗炎作用来实现对肾脏的保护作用尚少见报道 TNFα IL-1β 及 IL-6 是临床上较为常用的炎症因子指标, 常用来反应机体炎症反应的强弱 ; 而 IL-10 为应用较为成熟的抗炎因子指标, 用来反映机体的抗炎能力因此本研究采用 TNF-α IL-1β IL-6 及 IL-10 来反映大鼠肾脏的炎症 - 抗炎反应状态本实验模型复制成功, 并且发现糖尿病大鼠肾脏组织炎症细胞因子 TNF-α IL-1β 及 IL-6 增加, 抗炎症细胞因子 IL-10 减少给予二甲双胍治疗后, 血糖下降, 肾脏肥大改善, 肾脏炎症细胞因子与抗炎症细胞因子失平衡也得到改善因此, 笔者推测二甲双胍改善糖尿病肾病患者的肾功能是通过对肾脏的炎症细胞因子的调节来实现未来笔者将进一步开展相关实验, 一方面验证抗炎治疗是否对糖尿病肾病有直接的肾脏保护作用, 另一方面将从细胞基因 2) 水平进一步探究相关机制总之, 本研究发现二甲双胍对糖尿病肾病大鼠的肾脏具有保护作用, 其机制可能与抑制糖尿病大鼠肾脏炎症细胞因子表达有关参考文献 : [1] YAO Y, FOMISON-NURSE IC, HARRISON JC, et al. Chronic bilateral renal denervation attenuates renal injury in a transgenic rat model of diabetic nephropathy[j]. American Journal of Physiology Renal Physiology, 2014, 307(3): F251-F262. [2] HE Y, XU Z, ZHOU M, et al. Reversal of early diabetic nephropathy by islet transplantation under the kidney capsule in a rat model[j]. 2016, 2016(4): [3] VERA G, L 譫 PEZ-MIRANDA V, HERRAD 譫 N E, et al. Characterization of cannabinoid-induced relief of neuropathic pain in rat models of type 1 and type 2 diabetes[j]. Pharmacology Biochemistry Behavior, 2012, 102(2): [4] HUANG LY, TSUI DY, WILLIAMS CM, et al. The furoxan nitric oxide donor, PRG150, evokes dose-dependent analgesia in a rat model of painful diabetic neuropathy (PDN)[J]. Clinical Experimental Pharmacology Physiology, 2015, 42(9): [5] 肖雪娜, 王莹, 马彩娟, 等. 二甲双胍和阿卡波糖治疗早期糖尿病肾病疗效比较 [J]. 中日友好医院学报,2012, 12(2): [6] 陈淼, 娄宁, 陈福莲, 等. 二甲双胍对糖尿病肾病患者肾功能的影响 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),2010,30(5): [7] 张永刚, 任宁卫. 二甲双胍联合益气补血法对 2 型糖尿病合并糖尿病肾病患者 HGF 肌酐清除率及临床疗效影响[J]. 辽宁中医药大学学报,2016, 18(8): [8] YUE W, YANG CS, DIPAOLA RS, et al. Repurposing of metformin and aspirin by targeting AMPK-mTOR and inflammation for pancreatic cancer prevention and treatment[j]. Cancer Prevention Research, 2014, 7(4): [9] SAISHO Y. Metformin and Inflammation: its potential beyond glucose-lowering effect[j]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2015, 15(3): [10] 赵富利, 亓民, 刘辉. 利拉鲁肽联合二甲双胍治疗 2 型糖尿病伴肥胖患者疗效及对微炎症状态的影响 [J]. 中国现代医学杂志, 2015, 25(15): [11] CUI F, ZOU D, GAO Y, et al. Effect of tongxinluo on nephrin expression via inhibition of notch1/snail pathway in diabetic rats[j]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2015, 2015(7): [12] BISHNOI M, BOSGRAAF CA, ABOOJ M, et al. Streptozotocin-induced early thermal hyperalgesia is independent of glycemic state of rats: role of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV and inflammatory mediators[j]. Molecular Pain, 2011, 7(: [13] LI X, LI C, LI X, et al. Involvement of histone lysine methylation in p21 gene expression in rat kidneyin vivoand rat mesan- 4

5 第 20 期梅艳, 等 : 二甲双胍对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究 gial cellsin vitrounder diabetic conditions[j]. Journal of Diabetes Research, 2016, 2016(10): [14] JIANG S, DU P, AN L, et al. Anti-diabetic effect of coptis chinensis polysaccharide in high-fat diet with STZ-induced diabetic mice[j]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 55(3): [15] LAMBA HS, BHARGAVA CS, THAKUR M, et al. α-glucosidase and aldose reductase inhibitory activity in vitro and antidiabetic activity in vivo of tribulus terrestris L (dunal)[j]. International Journal of Pharmacy Pharmaceutical Sciences, 2011, 3(3): [16] HUANG G, LV J, LI T, et al. Notoginsenoside R1 ameliorates podocyte injury in rats with diabetic nephropathy by activating the PI3K/Akt signaling pathway [J]. International Journal of Molecular Medicine, 2016, 38(4): [17] LOPEZPARRA V, MALLAVIA B, LOPEZFRANCO O, et al. Fcγ receptor deficiency attenuates diabetic nephropathy [J]. Journal of the American Society of Nephrology, 2012, 23(9): [18] PERNICOVA I, KORBONITS M. Metformin-mode of action and clinical implications for diabetes and cancer[j]. Nature Reviews Endocrinology,2014, 10(3): 143. [19] 施鹏, 李婉湘. 盐酸二甲双胍片对 2 型糖尿病神经病变患者氧化应激的作用 [J]. 中国实用神经疾病杂志,2014(8): [20] SOLINI A, ROSSI C, DURANTI E, et al. Saxagliptin prevents vascular remodeling and oxidative stress in db/db mice. Role of endothelial nitric oxide synthase uncoupling and cyclooxygenase[j]. Vascular Pharmacology, 2015, 76(666): ( 童颖丹编辑 ) 5

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环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两种电针对脊髓损伤 14 天后大鼠运动功能神经元及 MEK2 p 鄄 ERK1 表达的影响论著宋良玉摇吕威摇景泉凯摇莫雨