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1 中南大学学报 医学版 冬虫夏草制剂对自发性高血压大鼠肾组织 %#5 和?#5 表达的影响 武蓉 周巧玲 林书典 敖翔 成小苗 杨敬华 中南大学湘雅医院肾内科 长沙 8 海南省人民医院肾内科 海口 摘要 目的 观察自发性高血压大鼠. 肾组织中细胞间黏附分子 5 %#5 和血管细胞黏附分子 5?#5 表达及冬虫夏草制剂对其影响 方法 清洁级雄性. 只 ;0 大鼠 4 只 ; 组. 随机分为非干预组. 组 冬虫夏草制剂组 # 组 福辛普利组 = 组 冬虫夏草制剂加福辛普利组 =# 组 后 组以冬虫夏草制剂 8 9 ) 和 或福辛普利 9 ) 灌胃. 组及 ; 组以等量清水灌胃 测血压 周末测尿蛋白 血肌酐 取肾组织做 6, 染色 免疫组织化学及 5 # 方法检测 %#5?#5 蛋白及 表达情况 结果 与 ;0 大鼠比较. 尿蛋白排泄量增高 肾组织 %#5?#5 蛋白及 表达增强 与. 组比较 福辛普利使大鼠血压下降 而冬虫夏草制剂无明显降压作用 但 # = =# 组均有尿蛋白排泄量 血肌酐水平下降 肾组织 %#5?#5 蛋白及 表达下调 结论 高血压造成肾脏损害时可出现肾组织 %#5 和?#5 的异常表达 冬虫夏草制剂可有效改善二者的异常表达 具有良好的肾保护作用 关键词 高血压肾脏损害 细胞间黏附分子 5 血管细胞黏附分子 5 冬虫夏草 %!4! ' 4 58 # "#%'%8%4 4!' 5 ;3, 3@',(' %./)' A' #6A',', C'/!"#",!,!!"! "!,! 8!"#",!! -"-!!! -95,,2 -+,-", ',,- '+ (/() ',,(+/(5 %#5 ) 2+/(+ () ',,(+/(5?#5 ' 9'),-,,/( '2. ),'2' +',- 4 (. 9,() ),()'2') ) ',8,/,/ ',/,/.,/ ) ' #,)+' '8 9),/ #,/ ) ' -,','( 9 ),/ = ),/ +'2) )'(''+)5 ''',,- 8 9) ) -,','( 9 ),/ #= ' 4 ( ;0 /),(+,,( ),- 9 ( +'5 -'+). / +''.+ 8 /',' +,/ ) ',,-%#5 ) 收稿日期! " " 作者简介 武蓉 硕士 医师 主要从事肾内科临床工作 通信作者! 周巧玲 65'(:,/('7,,+,+ 基金项目! 江西济民可信集团项目 ',9 /,) C''9 ',/

2 冬虫夏草制剂对自发性高血压大鼠肾组织 %#5 和?#5 表达的影响 武蓉 等?#5 ' ) '/,',+ '+(+'/ ) 5#"!' #,) ' ;0 (,,) / 8 /',' +,/.+) ',,-%#5 )5?#5 ' 9'),-.''-'+('+) - #,) ',/. (,,) / ) +) - -,','( - #,) ',/. (2(,-.+ 8 /',' +,/ ) (, /((', ''-'+()/+) ' ), -,','(,/ ',,-%#5 )?#5 ''-'+() +) ',/ - '! (,(',+', ) '5-','',+,-('/'.,/ )/+' ',,-%#5 )?#5 ( '2, '+ (/() ',,(+/(5 2+/(+ ( ) ',,(+/(5 " 微炎症状态系一种没有临床感染征象而体内存在持续低水平的炎症状态 表现为炎症因子 如 # 反应蛋白 白介素 4 肿瘤坏死因子 黏附分子等 水平升高 与高血压的发生发展及其心血管事件的发生有密切联系 5 血管紧张素 ',' 可通过氧化应激调节核转录因子 /+(-+,5< =5< 的活性并诱导炎症因子如细胞间黏附分子 5 '+ (/() 5 ',,(+/(5 %#5 血管细胞黏附分子 5 2+/(+ () ',,(+/(5?#5 等黏附分子的表达 促进炎症反应的发生 在高血压的靶器官损害中起重要作用 冬虫夏草制剂具有稳定溶酶体膜 保护 > 5 0 > 5 酶活性 减少脂质过氧化损伤 促进肾小管上皮细胞再生等作用 8 但其是否能改善高血压所致肾脏损害的微炎症状态 尚未见文献报道 本研究以自发性高血压大鼠,,/5 '2. 为研究对象 用福辛普利和冬虫夏草制剂进行干预 观察. 肾组织 %#5 和?#5 表达情况 以进一步探讨高血压良性小动脉性肾硬化时 %#5?#5 表达 高血压肾损害与微炎症反应的关系以及冬虫夏草制剂的肾脏保护作用 为高血压肾脏损害的早期防治提供理论依据 ) 材料与方法 动物及分组 周龄雄性清洁级. 及雄性清洁级 ;0 大鼠 ;'50,, 均由实验动物中心西南分公司提供 体质量 实验前测尾动脉血 压 留尿采用双缩脲法测尿蛋白 将. 随机分为分为 8 组. 组即. 非干预组 = 组即. 福辛普利干预组 9 ) 4 # 组即. 冬虫夏草制剂制剂干预组 冬虫夏草制剂菌粉 8 9 ) 4 =# 组即. 冬虫夏草制剂制剂与福辛普利联合干预组 4 将 ;0 大鼠作为正常对照组 即 ; 组 4. 组及 ; 组每日以等量清水灌胃 材料与试剂冬虫夏草制剂由江西金水宝制药有限公司惠赠 福辛普利钠由上海施贵宝制药公司惠赠 兔抗大鼠 %#5 抗体 二抗免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德公司 兔抗大鼠?#5 抗体为美国.5#/: 公司产品 < 显色试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司 方法 大鼠动脉压的测定采用中日友好临床医学研究所生产的 <5 < 型大鼠血压计测定大鼠尾动脉血压 药物干预方法冬虫夏草发酵菌丝体加入适量蒸馏水熬制约 ' 纱布过滤 冷却后灌胃 每日 次 福辛普利钠经适量双蒸水溶解后灌胃 每日 次 标本留取及检测于实验第 周末处死大鼠 处死前 ) 将大鼠置代谢笼中喂养并收集 8 尿液 测尾动脉压及尿蛋白定量 将大鼠麻醉后经心脏采集血液于试管中 离心后取上清液置 " E 保存 剖腹取左肾称重并记录 以 8 的多聚甲醛固定做石蜡切片 厚度为 8 用于病理分析及免疫组织化学检测 右肾速冻于液氮中 用于 %(4/ 和

3 8 中南大学学报 医学版 =(4/ 水平的检测 8 肾脏病理及免疫组织化学检测取石蜡包埋的肾组织切片 进行 6 及, 染色检查和免疫组织化学检测 %#5 和?#5 表达状况 免疫组织化学采用. 法 一抗 山羊抗大鼠 %#5 和?#5 多克隆抗体 H 湿盒孵育 8 E 过夜 二抗 E 孵育 ' < 显色 ' 后脱水 透明 封片 免疫组织化学染色切片用光学显微镜下观察并拍照 8 每张切片随机选取 个视野 采用.'(#% 软件 #,'%+#,' 3. 分析阳性染色面积所占视野的比例 计算阳性指数,'5 '2 ') % 阳性面积 视野面积 5# 检测 %(4/ 和 =(4/ 水平肾组织研碎后加 %:,( 试剂提取总 用 5# 方法对肾组织中的 %(4/ 和 =(4/ 水平进行检测 扩增条件! E 预变性 '!8 E 变性 4 根据引物不同选择不同退火温度 表 E 延伸 4 共 个循环 E 终末延伸 ' 8 E 保温 扩增产物进行凝胶电泳后于 <)+ 图像处理系统测量产物的光密度 8 统计学处理采用... 软件包进行统计学分析 所有数据用均数 标准差 + 表示 采用方差分析和.5 检验 - 为差异有统计学意义 表 )%4) 和 4) 引物序列及退火温度,)%4) 4) '! 名称 引物 序列 产物长度 退火温度 %(4/ 上游 5###5 8 4 E 下游 5#5 =(4/ 上游下游 5#########5 5##########5 8 E 5+' 上游 5#####5 E 下游 5#5 / 结 果 实验前后各组大鼠尾动脉压 8 尿蛋白和干预后血清肌酐检测结果实验前. 组 # 组 = 组 #= 组血压及 8 尿蛋白排泄量均高于 ; 组 - 实验 周末 ; 组. 组及 # 组血压与实验前比较无明显改变 均 -F 而 = 组和 =# 组血压较实验前明显下降 其差异有统计学意义 - 同时 实验 周后 # 组 = 组和 =# 组大鼠 8 尿蛋白排泄量明显减少 且血清肌酐水平明显低于. 组 差异有统计学意义 均 - 表 各组大鼠肾脏病理变化实验第 周处死各组大鼠 将肾组织于 6, 染色 其结果显示. 组大鼠肾组织可见小动脉肌层肥厚及纤维素样变性 血管壁明显增厚 血管周围炎症细胞浸润 一部分肾小球可见节段硬化 肾小管间质可见炎症细胞浸润及部分纤维化等改变 图 表 / 各组大鼠尾动脉压 /3 尿蛋白及血清肌酐比较,/,!''! /3!!! 分组 实验前 尾动脉压 干预后 实验前 尿蛋白 8 干预后 肌酐, 干预后 ; 组 !8. 组 4 8!!!! 8 8! # 组 ! 44 8! = 组 4! ! =# 组 4 8! 4!4 8 与 ; 组比较 - 与. 组比较 -

4 冬虫夏草制剂对自发性高血压大鼠肾组织 7 和 c 表达的影响!武蓉#等 图 AB各组大鼠 X5染色结果% _QTT ' 6Y 组% `F 组% 55组% >a组% Ta5组, I -KABX5 # " + +- % %3)% _QTT K6 MB G) Y% ` MB G) F% 5 MB G) 5% > MB G) a% T MB 图 GB各组大鼠 R" %+染色结果 % _QTT ' 6Y 组% `F 组% 55组% >a组% Ta5组, I -KGBR" %+ # " + +- % %3)% _QTT K6 MB G) Y% ` MB G) F% 5 MB G) 5% > MB G) a% T MB ". %!肾组织中 7 和 c 蛋白质的表达?7值 分 析 结 果 显 示 # F 组 7 和 c 的 7 表达 于 血 管 内 皮 及 外 膜# 肾 小 管 上 表 达 较 Y 组 明 显 上 调! Eh#.# " # 5组 - a组 和 皮细胞-壁 层 上 皮 细 胞 及 系 膜 细 胞 也 有 部 分 表 a5组 7 和 c 的表达较 F 组明显下调 达, c 主 要 分 布 在 血 管 内 皮 和 外 膜 - ` OS! 均 Eh#.# " # 5组 - a组 和 a5组 之 间 比 较 差 异 0; /囊 等 处 # 另 外 在 小 管 上 皮 细 胞 亦 有 部 分 表 无 统 计 学 意 义! Ep#.# # 表 % ", 达! 图 % #V ", 根 据 7 和 c 蛋白表达

5 R 中南大学学报! 医学版" #"###%!""!!'( ( ) +,+.+ / 0.2 ( A"6 A 蛋白 L7值% Z+ 表 MB各组大鼠肾组织 7 ">KMBL% # S +2 V %7 A "+26 A )' %# + + %3)% Z+ ". V!肾组织中 7 G0\L6表达 Y 组大鼠肾脏 7 G 0\L6 低 表 达#F 组 大 鼠 7 G 0\L6 异 常 高 表 组别 7 c Y组 R V l 3 %3 l " F组 R. "% l %%!. " l V#! 5组 IV l "# a组 R I3 l J I# l % a5组 I" l V% I l 3 I l "I 达! Eh#.# " # 而 药 物 干 预 J 周 后 5组 - a组 和 a5组 7 G 0\L6 的 表 达 量 显 著 低 于 F 组! 均 Eh#.# " # 但 5组 - a组 和 a5组 之 间 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义! 表 V # 图 #R ",!!与 Y 组比较#!Eh #%与 F 组比较#"Eh #, A 蛋白的表达% _QTT ' 6Y 组% `F 组% 55组% >a组% Ta5组, 图 MB各组 7 I -KMB5V)' %+%7 A +' +"9# 3 % %3)% _QTT K6 MB G) Y% ` MB G) F% 5 MB G) 5% > MB G) a% T MB 图 QB各组 6 A 蛋白的表达情况% _QTT ' 6Y 组% `F 组% 55组% >a组% Ta5组, I -KQB5V)' %+%6 A +' +"9# 3 % %3)% _QTT K6 MB G) Y% ` MB G) F% 5 MB G) 5% > MB G) a% T MB

6 冬虫夏草制剂对自发性高血压大鼠肾组织 %#5 和?#5 表达的影响 武蓉 等 表 < 各组大鼠肾组织 / 和 /"+ 的相对表达,<"'58/ / " +! 组别 %(4/ =(4/ ; 组 4 8. 组 4 4! # 组 = 组 4! 4 88 =# 组 与 ; 组比较 - 与. 组比较 -! 图 7 各组大鼠肾组织中 /"+ 表达 9 ; 组. 组 # 组 8= 组 =# 组 7/ "+8'!! 9,/ ;,/.,/ # 8,/ =,/ =#! 图 < 各组大鼠肾组织中 /"+ 表达 9 ; 组. 组 # 组 8= 组 =# 组 < / "+8'!! 9,/ ;,/.,/ # 8,/ =,/ =# 讨 论 4 研究表明 高血压形成过程中伴随着微炎症反应发生 体内巨噬细胞通过 =5< 诱导产生炎症介质及细胞因子 如 %54?#5 %#5 等 其中 %#5 和?#5 属于黏附分子中的免疫球蛋白超家族成员 广泛分布于多种细胞如血管内皮细胞 白细胞等 介导白细胞与内皮细胞的黏附以及白细胞的渗出 并参与了细胞内的信号转导 5! 参与肾病 炎症性肠病 关节炎等多种疾病的发病过程 5 生理情况下?#5 和 %#5 呈低水平表达 受各种刺激因素影响后表达可上调 持续的异常表达可导致组织器官结构和功能的损伤 本组研究发现. 组大鼠喂养 周后除了血压升高外 尿蛋白排泄 明显增加 肾组织病理检测结果表明 肾间质小动脉 细动脉管壁增厚 血管周围大量炎症细胞浸润 部分肾间质出现纤维化等变化 与此同时 肾小球 鲍曼氏囊 肾小管上皮细胞 血管内皮细胞及外膜?#5 %#5 蛋白质表达水平上调 肾组织 %(4/ 和 =(4/ 水平较对照组明显增强 提示高血压导致肾脏损伤时 启动了炎症反应过程 这种非细菌性的微炎症状态可能是导致高血压肾损伤的原因之一 高血压时 机体 内皮素 65 等 生成增多及流体切应力等机械刺激均可使 %#5 和?#5 表达上调 导致靶器官的损 8 伤 0' 等对. 大鼠注射 5 并用氯沙坦进行干预 发现 5 可促进大鼠心肌细胞 %#5 高表达 且呈时间剂量依赖关系 ' 等研究也发现 5 刺激氧化应激反应 同时可使血管和心脏组织中?#5 %#5 表达增强 这些研究均表明 高血压时 5 造成靶器官损伤的机制可能与启动炎症反应 导致?#5 %#5 高表达有密切关系 本研究结果显示. 组大鼠喂养 周后除了血压升高外 尿蛋白排泄明显增加 肾组织病理表明 肾间质小动脉 细动脉管壁增厚 血管周围大量炎症细胞浸润 部分肾间质出现纤维化等变化 与此同时 肾小球 鲍曼氏囊 肾小管上皮细胞 血管内皮细胞及外膜?#5 %#5 蛋白质表达水平上调 肾组织 =(4/ %(4/ 水平较对照组明显增强 提示高血压导致肾脏损伤时 启动了炎症反应过程 这种非细菌性的微炎症状态可能是导致高血压肾损伤的原因之一 在实验过程中 笔者采用 #6% 制剂福辛普利喂养. 发现第 周后 干预组. 尿蛋白排泄明显下降 血肌酐水平上升速度减慢 肾组织?#5 %#5 表达下调 证明 5 所致的炎症反应在高血压肾损伤中起重要作用 冬虫夏草是一种传统中药 含有多糖 氨基酸 脂肪酸 麦角甾醇及多种微量元素 本组前 45 期研究已经证实 冬虫夏草具有降低 鼠蛋白尿排泄 下调 4# 5 基因及 # 表达 减轻肾纤维化程度的肾脏保护作用 本研究用冬虫夏草制剂喂养. 大鼠 周 与对照组和福辛普利组进行比较 周后冬虫夏草制剂干预

7 中南大学学报 医学版 组大鼠尿蛋白排泄明显减少 肾脏病理改变明显减轻 炎性渗出减少 肾组织中 %(4/ 和 =(4 / 及蛋白表达水平均明显降低 与福辛普利组比较差异无统计学意义 有趣的是 冬虫夏草制剂组. 血压下降并不明显 但肾脏保护作用较为突出 其确切机制还需进一步研究 参考文献 /(, :'%-(', ) ', + -,('9 C,('(( 费晓 徐群红 王鸣 慢性肾衰竭患者微炎症状态研究的意义和近况 C 中国中西医结合肾病杂志 4 54! =6%A', A3@/, ; ' ''-'++ ) /,-/),-'+,'-(', ' +,'+(-'(/ C #' C,/(,-%) )'',() ;,(, 4 54!.,('.+ ' #'+% (('''', (,',' %')/+),,+ ) ',,3?6# )/+',,-4 (,+', ) ', C C? 8!! 58 8 刘宏伟 林艺章 冬虫夏草防治肾脏病实验研究进展 C 中医杂志!!! %3,' % ':+, ' -+,-+,)+' '' ()' C C,/(,-)'5 ',(#' )'+'!!! 张子强 朱竹先 刘雪平 等 贝那普利和氯沙坦联合治疗对自发性高血压大鼠左室重构的影响 C 高血压杂志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胡杨青 周巧玲 刘抗寒 等 冬虫夏草对糖尿病肾病鼠肾组织转化生长因子 #5+ 表达的影响 C 肾脏病透析与肾移植 ' %3 0 ( ',,-=5#5+ ) -+,-+,)+ ' ''. C #' C,/(,-,(,'5 (') (', 周巧玲 刘抗寒 王衍慧 等 冬虫夏草对糖尿病肾病模型鼠肾组织转化生长因子 结缔组织生长因子表达的影响 C 肾脏病与透析肾移植杂志 %3 0 ; /' ( 6-+,-+,)+' ', ',,-=5 ) #=' ' )' '+, C #' C,/(,-,(, '(') (', 徐方云 冬虫夏草及其发酵菌丝体的药理药效学研究 C 药品评价 8 5! A3 =/./), +,(,'+( -+,-#,) ' ') '- ) +(' C / 62(/', 8 5! 本文编辑 彭敏宁

高 云 钟良军 张源明 周晓欢 梁 平 徐 隽 探讨兔牙周炎对动脉粥样硬化炎性因子的影响及抗生素对其的作用 将 只雄性新西兰大白兔随机分为 组 组为对照组 组为牙周炎组 组为动脉粥样硬化组 组为牙周炎 动脉粥样硬化组 组为干预组 牙周炎 动脉粥样硬化 替硝唑组 各组分别按照实验设计进行相应干预处理 周末处死动物 检测牙周指标 血清中总胆固醇 三酰甘油 高密度脂蛋白胆固醇 低密度脂蛋白胆固醇 反应蛋白

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